Adenylyl cyclase

• 2.1 Cyclisch Adenosinemonofosfaat
• 2.2 Pyrofosfaat

• 3.1 Type II
  • 3.1.1 Structuur
  • 3.1.2 Overexpressie Stoornissen

• 4.1 Structuur
  • 4.1.1 C-terminaal katalytisch domein
    • 4.1.1.1 α1-schakelaar
  • 4.1.2 N-terminaal regulerend domein
    • 4.1.2.1 αN10-schakelaar
• 4.2 Regeling door pH
• 4.2 Biologische rol
• 4.3 Biologische rol
  • .3 Biologische rol
• 5 3D Structuren van adenylyl cyclase

Functie

Adenylyl cyclase (ADCY, EC nummer 4.6.1.1), ook bekend als adenylaat cyclase, is een enzym dat de cyclisatie katalyseert van in . Dit gebeurt in één enkele, gecoördineerde stap, waarbij de zuurstof op de 3′-hydroxylgroep van ATP nucleofillisch het alfafosfaat aanvalt, waarbij een fosfodiësterbinding wordt gevormd en een pyrofosfaatgroep wordt gesplitst. In de meeste actieve sites is er een zuur residu in de buurt van het 3’OH dat functioneert bij de deprotonatie, en basische residuen bij het β-fosfor om de energie van de groep voor splitsing te verlagen. De reactant in de reactie die door adenylylcyclase wordt gekatalyseerd is ATP; ATP is het meest voorkomende nucleotide trifosfaat in de meeste cellen met typische concentraties van 1 tot 10 mM. Door deze hoge intracellulaire concentratie kan de cAMP-concentratie snel stijgen als reactie op een specifiek signaal, hetgeen belangrijk is in veel signaaltransductie- en metabolische routes. Het hoofdproduct van deze reactie is cAMP, met als nevenproduct PPi. De cytoplasmatische gebieden van ADCY bestaan uit het N-terminaal, C1a, C1b, C2a en C2b. De C1a en C2a vormen het katalytische domein. Op deze pagina ligt de nadruk op het microbiële adenylyl cyclase Rv1264, maar ook adenylyl cyclases van zoogdieren worden in minder detail behandeld.

Adenylyl cyclase-geassocieerd eiwit (CAP) reguleert het actine-cytyoskelet en de celadhesie bij alle eukaryoten.

Voor calmoduline-gevoelig adenylaatcyclase zie Anthrax-oedeemfactor.

Inleiding

Er zijn tien isozymes van adenylylcyclasen bij zoogdieren, adenylylcyclase type I-X, (ADCY I-X), en nog veel meer bij andere organismen. Alle zoogdier-, en de meeste andere adenylyl cyclasen behoren tot klasse III; de meeste zijn integrale membraaneiwitten, en alle produceren cAMP, waarvan het vermogen kan worden geactiveerd of geïnactiveerd in reactie op bepaalde omstandigheden of liganden. Alle membraangebonden adenylylcyclasen van zoogdieren worden geactiveerd door alpha-subeenheden van G-eiwitten, maar reageren verschillend op liganden zoals magnesium-ionen, calcium-ionen en beta-gamma-subeenheden van G-eiwitten. Een van de isozymes van zoogdieren, en sommige prokaryotische vormen van adenylyl cyclase reageren op omgevingscondities, voornamelijk pH.

Cyclisch Adenosine Monofosfaat

In zoogdieren fungeert cAMP als een secundaire boodschapper, een van zijn functies is het controleren van de activiteit van proteïne kinase A (PKA). PKA heeft op zijn beurt zeer diverse rollen in de cellen, waarvan de meeste verband houden met het metabolisme, maar PKA speelt ook belangrijke rollen in de transcriptie, de celcyclus en de apoptose. Het uiteindelijke lot van cAMP is de omzetting in AMP door splitsing van de fosfodiesterbinding door 3′, 5′-cyclisch adenosinemonofosfaatfosfodiësterase.

Pyrofosfaat

Splitsing van het bijproduct van deze reactie, PPi, door pyrofosfatase levert twee moleculen anorganisch fosfaat (Pi) op. ATP-synthase kan dit anorganische fosfaat weer omzetten in adeninedifosfaat (ADP) om ATP te maken met behulp van energie uit de protonendrijfkracht.

Adenylyl Cyclase bij zoogdieren

Er zijn tien isozymes van adenylyl cyclases bij zoogdieren, adenylyl cyclase type I-X, (ADCY I-X); Bij zoogdieren speelt adenylyl cyclase een belangrijke rol in signaaltransductieroutes waarin cAMP een secundaire boodschapper is.

ADCY I-IX delen een algemene structuur; zij bestaan uit twee trans-membraanregio’s (M1, M2) die bestaan uit zes membraanoverspannende helices en functioneren om het enzym in het membraan verankerd te houden, en twee cytoplasmatische regio’s (C1, C2) die verder kunnen worden onderverdeeld (C1a, C1b, C2a, C2b) en verantwoordelijk zijn voor alle katalytische activiteit, en regulering door G-eiwitten en forskoline. In oplossing kunnen de C1a- en C2a-domeinen heterodimeren met elkaar vormen, hetzij in hetzelfde of in verschillende enzymen, of zij kunnen homodimeren vormen met hun identieke eenheden op verschillende enzymen. Het C1b-domein is zeer groot (≈15 kDa) met veel regulerende plaatsen, en heeft een variabele structuur in verschillende isozymes; terwijl het C2b-domein in veel isozymes vrijwel niet voorkomt, en nog niet in verband is gebracht met een bepaalde functie.

Type II

Structuur

Een monomeer van het C2-domein van heeft een interne, hydrofobe, anti-parallelle omgeven door verschillende, amfipathische , behalve een gebied dat nodig is om een homodimer te vormen met een ander C2-domein. Twee monomeren van C2-domeinen van adenylylcyclase type II binden zich in oplossing tot een , dat nodig is voor de katalytische omzetting van ATP in cAMP en PPi. Wanneer zij gebonden zijn creëren zij een diepe spleet die het centrum van hun bindingsplaats omspant; deze spleet is geschikt om twee moleculen aan de uiteinden te binden. Er worden sterke waterstofbruggen gemaakt tussen de zuurstofatomen van forskoline en de omringende peptide-backbone, en de rest van de interacties zijn zeer hydrofoob, aangezien de bindingsplaats van forskoline tien alifatische en aromatische residuen bevat. Door deze binding van forskoline ontstaat een hydrofobe verbinding tussen de monomeren, die elk twee verschillende hydrofobe oppervlakken hebben die aan forskoline binden; en het is deze interactie die het homodimeer stabiel maakt. De forskoline heeft ook een wisselwerking met Asn 1025, dat essentieel is voor de katalytische activiteit, en positioneert dit op de juiste wijze, en het kan zelfs rechtstreeks met ATP een wisselwerking aangaan. Dit homodimeer-forskolin-complex kan verder worden geactiveerd in reactie op een signaal via binding aan de βγ-subeenheid van een G-eiwit. Deze βγ-subeenheid bindt zich aan die deel uitmaken van een α-helix op de buitenste laag van het complex.

Het van dit homodimeer bevindt zich binnen de crevasse, en wordt gekenmerkt door twee sterk geconserveerde sets polaire residuen (Arg 997 (Groen), Asn 1025 (Rood), Ser1028(Roze), Arg 1029(Oranje), Asp 1031(Geel), en Ser 1032(Paars)). Een van deze sets bevindt zich op elke monomere subeenheid, op het homodimeer rangschikken zij zich op een anti-parallelle wijze, waarbij zij naar elkaar wijzen.

Overexpressie Stoornissen

In de hersenen van zoogdieren wordt de uitvoering van geheugen gebaseerde functies uitgevoerd door de prefrontale cortex (PFC). Hyperpolarisatie-geactiveerde cyclisch nucleotide-gated (HCN) kanalen op neuronen sluiten om elektrochemische signalen langs de axon en in een synaps te laten stromen; wanneer HCN-kanalen open zijn, kan het elektropotentiaal signaal niet door de cel worden doorgegeven. Blootstelling van deze kanalen aan cAMP zorgt ervoor dat ze open gaan, waardoor de overdracht van signalen stopt, en dus de hogere cognitieve gedachten worden belemmerd. Bij patiënten met schizofrenie is een cAMP-regulerend molecuul, Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) gemuteerd en kan het cAMP-niveau niet reguleren; verhoogde cAMP-niveaus kunnen dus schizofrenie veroorzaken. Men denkt dat het sluiten van HCN-kanalen een rol speelt bij andere aandoeningen, zoals ADHD en bipolaire stoornis. Het is dus redelijk dat regulering van de cAMP produktie door zich te richten op type II adenylyl cyclase, omdat dit in de hersenen wordt aangetroffen, als behandeling voor deze stoornissen kan dienen.

Rv1264 Adenylyl Cyclase

Hoewel adenylyl cyclase overal in organismen op universeel niveau wordt aangetroffen, hebben veraf verwante organismen verschillende modificaties van het enzym, elk is gespecialiseerd voor een bepaalde taak in een bepaalde omgeving. Zoals eerder gezegd, heeft de mens 10 bekende isozymes van adenylyl cyclase; terwijl Escherichia coli slechts één isozym heeft, en Mycobacterium tuberculosis er 15 heeft. Een bijzonder interessant adenylyl cyclase van M. tuberculosis, Rv1264, heeft een N-terminaal dat in zekere zin als een pH-sensor fungeert, aangezien het de activiteit van het enzym regelt op basis van de pH van de omringende oplossing. Dit adenylyl cyclase behoort, zoals de meeste andere, tot klasse III, adenylyl cyclases in deze klasse hebben meerdere domeinen, ten minste één voor de katalyse, en een ander voor de regulatie.

Structuur

Het adenylyl cyclase is een 363 residuen lang eiwit dat bestaat uit een katalytische en een regulatorische die een flexibele bevat die de twee met elkaar verbindt. De actieve structuur is een homodimeer dat lijkt op het zoogdier type II homodimeer, waarbij een α-helix van het ene monomeer (keten A) door de centrale spiraal van een ander monomeer (keten B) wordt geplaatst. Deze dimerisatie plaatst het regulatoire domein van keten A in de nabijheid van het katalytische domein van keten B, en vice versa. In het eiwit zijn twee schakelelementen aanwezig, een in het C-terminale domein (α1-schakelaar) en een in de linkerregio (αN10-schakelaar), die grote conformatieveranderingen in het enzym mogelijk maken als reactie op betrekkelijk kleine veranderingen in de omgeving.

C-Terminal Catalytic Domain

De katalytische activiteit in Rv1264’s wordt verricht door de residuen: Asp 222 (Rood), Lys 261 (Blauw), Asp 265 (Oranje), Arg 298 (Roze), Asp 312 (Geel), Asn 319 (Paars), Arg 323 (Groen). Al deze residuen creëren een zeer polaire omgeving die complementair is in lading en polariteit aan het tussenproduct van de reactie. Residuen die de fosfaten van ATP geleiden, arginine 298 en 323, binden een in de actieve site. Dit sulfaation bevindt zich op de plaats die tijdens de katalyse zal worden ingenomen door het β-fosfaat van ATP. Tijdens het katalyseproces wordt het β-fosfaat van het α-fosfaat gesplitst; deze reactie kan gunstiger worden gemaakt door de energie te verlagen door complementaire ladingsassociaties tussen het β-fosfaat en de arginines 298 en 323. Een ander residu, , bindt een molecuul door elektrostatische interacties. De specifieke functie van deze associatie is onbekend, maar door de nabijheid van de actieve plaats kan het een rol spelen bij de katalyse.

Amino acid sequencing heeft aangetoond dat de sequentie tussen het katalytische domein van de Rv1264 adenylyl cyclasen en het katalytische domein van de zoogdier adenylyl cyclasen niet goed geconserveerd zijn, met slechts ongeveer een 25% overeenkomst met het hierboven besproken zoogdier type II adenylyl cyclase. De twee verschillende isozymes lijken echter nog steeds op elkaar in die zin dat superpositie van de een over de ander een aanzienlijke overlap vertoont, met een root mean square deviation (rmsd) van minder dan 1.76Å tussen 79% van alle . Een opmerkelijk verschil tussen de katalytische domeinen van Rv1264 en type II adenylyl cyclase is hun relatieve grootte; Rv1264 heeft geen dimerisatie arm en verschillende van zijn lussen zijn ingekort. Dit resulteert in Rv1264 adenylyl cyclase katalytisch domein dat als een dimer associeert met een kleiner interface gebied dan type II van zoogdieren, met interface gebieden van 1900Å2 en 3800Å2, respectievelijk. De actieve sites de Rv1264 en zoogdieren type II adenylyl cyclases zijn nog meer geconserveerd; de in de actieve site hebben een rmsd van slechts 0,69Å, en in de actieve site hebben een rmsd van 1,17Å.

Alle van de bovenstaande structurele informatie voor de C-terminale katalytische domein is alleen waar wanneer het enzym in zijn actieve toestand. De inactieve toestand van het enzym bezit een gedemonteerde actieve site, vandaar geen katalytische activiteit. Ten opzichte van de vaste N-terminale domeinen kan elk van de C-terminale monomere domeinen tot 6Å transponeren en 55o roteren. Deze enorme verandering in de tertiaire structuur van de C-terminale domeinen ontmantelt de actieve plaats, waarbij katalytische residuen tot 25Å van hun katalytisch actieve positie worden verwijderd. Niet alleen is de actieve plaats in het C-terminale domein onderbroken, maar ook neemt het raakvlak tussen de twee monomeren in omvang af van 1900Å2 tot 930Å2.

α1-schakelaar

De α1-schakelaar bevindt zich binnen het C-terminale katalytische domein en bestaat als een compacte α-helix wanneer het enzym in zijn actieve toestand is. Bij inactivering wordt de α-helixconformatie van de α1-schakelaar onstabiel en verandert deze in een willekeurige spoel. Aangezien deze schakelaar zich in de onmiddellijke nabijheid van de actieve plaats bevindt, wordt de actieve plaats door een grote verandering in structuur sterk verstoord, en wordt het enzym inactief.

Deze structuur wordt geconserveerd in adenylylcyclasen van zoogdieren, waar zij fungeert als een bijdrage voor de bindingsplaats van de βγ-fosfaten van het ATP-substraat. Het functioneert ook in de regulatie van adenylyl cyclases bij zoogdieren, samen met een andere α-helix vormt het de bindingsplaats voor de Gsα en Giα G proteïne subeenheden die de adenylyl cyclases activiteit reguleert.

N-Terminal Regulatory Domain

Het N-terminale domein functioneert in de regulatie; het heeft een uniek mechanisme dat bepaalt of het enzym al dan niet actief zal zijn op basis van de pH van de omringende oplossing. Elk monomeer in het katalytisch actieve dimeer heeft er tien; wanneer zij gedimeriseerd zijn, vormen zij een schijfvormige structuur. Een enkele molecule bindt zich in een hydrofobe zak. De functie van dit polyethyleenglycol lijkt structureel te zijn; zijn specifieke plaatsing en beweging tussen de actieve en inactieve vormen van het enzym suggereren echter dat het ook kan functioneren bij het detecteren van hydrofobiete veranderingen in de omgeving.

αN10-schakelaar

De αN10-schakelaar bevindt zich in het linkergebied en zijn conformatieverandering heeft een drastischer effect op het totale enzym dan de α1-schakelaar doet. Wanneer het enzym actief is, bestaat de αN10-schakelaar uit een willekeurige spiraal met een korte α-helix; deze conformatie maakt slechts een zwakke interactie mogelijk tussen het N-terminale regulatoire domein en het C-terminale katalytische domein, waardoor het enzym katalytische activiteit kan vertonen. Deze helix kan zich tot 24Å uitstrekken, waardoor de monomere C-terminale katalytische domeinen van het dimeer van elkaar gescheiden worden. Deze scheiding van domeinen verlaagt hun interfaceoppervlak en transponeert residuen; zoals hierboven besproken, resulteren deze veranderingen in een inactivering van het enzym, en een belangrijk kenmerk van de inactieve toestand van het enzym is dan ook een verlengde αN10-schakelaar. Wanneer de αN10-schakelaar zich uitstrekt, beweegt hij naar buiten, en het pentaethyleenglycol beweegt zich in een nieuw gevormde holte door de αN10-helix. Dit ondersteunt verder het idee dat het pentaethyleenglycol ligand niet alleen voor de structuur, maar ook voor de regulatie fungeert.

Regeling door pH

Aan het begin van de linker regio is er een residu, , dat een aanzienlijke invloed heeft op de regeling door pH. Bij een basische pH heeft het residu geen lading en minimale interacties met de twee katalytisch belangrijke residuen , die op een afstand van 14 Å en 21 Å van hun katalytisch actieve posities liggen. In deze toestand is het enzym inactief, niet alleen vanwege de residuen Lys 261 en Asp 312, maar ook omdat andere belangrijke structurele componenten van de katalytische site worden gedesintegreerd. Bij een zure pH wordt Rv1264 actief (Optimale pH~5.8) en neemt de activiteit tot een 40-voudige toe. Bij deze zure pH wordt His 192 geprotoneerd en positief geladen; dit veroorzaakt belangrijke structurele veranderingen in het eiwit, waaronder verdichting van zowel de αN10-schakelaar als de α1-schakelaar, samentrekking van de α4-helix die op zijn beurt een translocatie veroorzaakt van het paraethyleenglycol-ligand. De positief geladen His 192 stoot elektrostatisch de Lys 261 en Asp 312 residuen af, waardoor deze samen met andere structuurveranderingen respectievelijk 14 Å en 21 Å worden getransponeerd naar hun katalytisch actieve posities.

, een residu dat veel residuen die belangrijk zijn in de C-terminale – N-terminale interactie via waterstofbruggen organiseert, is ook belangrijk voor de regulatie. Wanneer dit residu gemuteerd is, gaat de regulatie op basis van pH verloren en is het enzym constant actief.

Vele andere residuen dragen ook bij aan de regulatie door pH; het zijn de elektrostatische interacties en waterstofbruggen in de C-terminal – N-terminal domein interface die het Rv1264 adenylyl cyclase mogelijk maken om gevoelig te zijn voor pH.

Biologische rol

M. tuberculosis is een pathogene bacterie, en dus wordt zij geconfronteerd met een scala van immuunreacties van een gastheer in een poging om zich te ontdoen van het. Een van de verdedigingsmechanismen van de gastheer tegen M. tuberculosis is de verzuring die optreedt in de fagolysosomen. De mogelijkheid om deze zure omgeving te detecteren, en er een gepaste reactie op te hebben, kan M. tuberculosis enorm helpen bij het infecteren van een gastheer. Wanneer de cAMP-niveaus worden verhoogd, wordt de verzuring van andere structuren vertraagd en verhoogde cAMP-niveaus activeren cAMP-receptoreiwitten die op hun beurt de transcriptie regelen.

3D-structuren van adenylyl cyclase

3D Adenylyl cyclase 3D-structuren