Adventitious Root
Methods for Rooting Microshoots
Als microshoots geen wortels vormen tijdens de vermenigvuldigingsfase, moeten ze een speciale behandeling ondergaan om een adventief wortelstelsel te initiëren en te laten groeien. Microscheuten kunnen in vitro worden beworteld en vervolgens aan de omgeving worden geacclimatiseerd, of ze kunnen ex vitro worden beworteld, waarbij beworteling en acclimatisatie worden gecombineerd.
Het gemak en het succespercentage van de beworteling bepalen welke methode voor een bepaalde cultivar wordt gebruikt. De meest kosteneffectieve methode is het ex vitro bewortelen van microscheuten. Ex vitro beworteling bespaart een extra in vitro overbrenging naar bewortelingsmedium en versnelt de acclimatisatie, waardoor microvermeerdering efficiënter wordt. In-vitro-beworteling wordt toegepast als er geen faciliteiten voor ex-vitro-beworteling en acclimatisatie zijn, als het succespercentage bij ex-vitro-beworteling laag is, en naar goeddunken van de laboratoriumdirecteur.
In-vitro-beworteling. De ingrediënten in het medium en de incubatieomstandigheden kunnen gemakkelijk worden gewijzigd wanneer in vitro omstandigheden worden gebruikt om wortelinitiatie en vroege ontwikkeling te bevorderen. De zoutformules van de voedingsstoffen kunnen gelijk blijven, worden gewijzigd of verlaagd, vaak tot macrosalts van halve sterkte, en de relatieve vochtigheid kan worden verlaagd door het gebruik van geventileerde deksels (figuur 5). De incubatieomstandigheden voor licht en temperatuur kunnen worden gewijzigd met het oog op beworteling. Veel microscheuten worden gedurende een bepaalde tijd in het donker geïncubeerd voor de initiatie van de wortels en vervolgens overgebracht naar verlichte omstandigheden.
Figuur 5. Chirurgisch microporeus tape zorgt voor ventilatie van dit vat met scheuten die worden beworteld; dit helpt de relatieve vochtigheid te verminderen en bereidt de nieuwe planten voor op de kasomgeving.
De voedingsbodem voor beworteling waarop vers gesneden microscheuten worden geplaatst, bevat gewoonlijk auxine. Gewoonlijk worden micromolaire concentraties IBA en/of NAA aan het medium toegevoegd voordat het wordt geautoclaveerd. De concentratie auxine is afhankelijk van de soort en de cultivar. Deze informatie is meestal online beschikbaar met behulp van een wetenschappelijke zoekmachine, zoals Google Scholar http://scholar.google.com/. Doorgaans levert de naam van de plant, de woorden “vitro” en “root” (of adventieve wortel) in de zoekreeks specifieke informatie op. Als de literatuur voor een bepaalde plant ontbreekt, gebruik dan nauwe verwanten in de zoekopdracht om te bepalen hoe zij hebben gereageerd.
Omdat wordt erkend dat dezelfde concentraties auxine die adventieve wortelinitiatie stimuleren, de wortelontwikkeling kunnen afremmen, gebruiken sommigen een aanpak met twee media. Wanneer microscheuten van Cotinus coggygria gedurende 5 dagen op een medium met 10 µM IBA werden gekweekt alvorens te worden overgebracht naar een auxinevrij medium, wortelde 100%; terwijl slechts 40% wortelde bij een continue kweek op een medium met 10 µM IBA (Metivier et al., 2007). Padilla en Burgos (2010) kweekten microscheuten van olijfbomen gedurende 2 weken op media die tot 4 µM IBA bevatten, gevolgd door overbrenging naar een basismedium zonder auxine, wat resulteerde in 65-93% beworteling, afhankelijk van de cultivar.
In sommige gevallen werden IBA-oplossingen gedurende een minuut of langer op microscheuten aangebracht als een basaal dipje. Tsvetkov et al. (2007) verkregen de beste beworteling van Sorbus domestica microscheuten toen ze 80 s in een 14,8 µM IBA-oplossing werden gedompeld voordat ze op een basaal medium werden geplaatst.
Donker tijdens of voor het bewortelen kan het bewortelingssucces en de synchroniciteit van beworteling tussen microscheuten vergroten. Etiolatie, ontwikkeling van scheuten zonder licht, zal de cellulaire competentie voor onvoorziene beworteling verhogen (Murray et al., 1994). Wanneer microscheuten van walnoten werden geëtioleerd, was de beworteling beter met een snellere opkomst van wortels dan bij groene scheuten (Leslie et al., 2010); de geëtioleerde scheuten waren echter broos en moesten voorzichtiger worden gehanteerd.
Het kweken van groene microscheuten op bewortelingsmedium in duisternis gedurende een relatief korte periode kan de beworteling sterk verbeteren. Een periode van duisternis gedurende 4-7 dagen op een Murashige en Skoog medium van halve sterkte dat 1 µM phloroglucinol en 1,4 µM IBA bevat, gevolgd door incubatie onder belichte omstandigheden, resulteerde in een betere beworteling van de microscheuten van ‘Delicious’ appels dan wanneer ze alleen in het licht of in het donker gedurende langere perioden werden gekweekt (Zimmerman, 1984). Bij de kweek van microshoots van appelwortelstokken ‘MM106’ op medium met 4 µM IBA in het donker gedurende 0-10 dagen, werd door histologisch onderzoek ontdekt dat wortelinductie plaatsvond gedurende de eerste 3 dagen of minder in het donker en dat kegelvormige wortelprimordia zichtbaar waren tegen dag 7 (Naija et al., 2008). Timing van de behandeling in duisternis is kritisch en moet wellicht voor elk gewas of genotype worden bepaald; niettemin kan het het bewortelingssucces aanzienlijk vergroten.
Sommige soorten bewortelen het best als de toppen van de microscheuten worden belicht en het basale gedeelte in het medium in duisternis ligt, vergelijkbaar met de manier waarop macrostekken in een kasmedium onder nevel worden beworteld. Het medium kan donkerder worden gemaakt door de buitenkant van kweekvaten zwart te verven tot iets boven het niveau van het medium en het medium af te dekken met steriele polycarbonaatkorrels of een andere stof die het licht buitensluit, of door het medium zelf donkerder te maken door actieve kool toe te voegen. Soms wordt een kasmedium, zoals vermiculiet, dat ook licht uitsluit, gebruikt voor in vitro beworteling nadat het met de voedingsbodem is bevochtigd.
Het is aangetoond dat het verduisteren van alleen de bases van microscheuten de beworteling van amandel, perzik en olijf (Rugini, 1988) en appel (Mencuccini en Rugini, 1993) verhoogde in vergelijking met controles die hetzij in het donker hetzij onder licht werden geïncubeerd. In een afzonderlijke studie meldden Mencuccini en Rugini (1993) echter dat het verduisteren van de basis weinig effect had op het bewortelen van de microscheuten van amandel, abrikoos, kastanje, jojoba en olijf, en remmend werkte bij walnoot. Daarom kan, als het bewortelingssucces minder is dan gewenst, het verduisteren van de basis nuttig zijn.
Ex vitro beworteling. Als de bewortelingspercentages vergelijkbaar zijn, kan ex vitro beworteling efficiënter en kosteneffectiever zijn dan in vitro beworteling (Leva, 2011). De kosten zijn hoger bij in vitro beworteling vanwege de ingrediënten, de voorbereidingstijd, het autoclaveren van media, de arbeid voor het overzetten en verplaatsen van de culturen, en de incubatieruimte. De verplaatsing naar de kas is vergelijkbaar tussen in vitro en ex vitro beworteling, en de verplantingstijd kan vergelijkbaar of trager zijn wanneer er wortels op de microscheuten zitten (figuren 4 en 6). Het ex vitro bewortelen levert meer efficiëntie op. Er is gerapporteerd dat de wortelkwaliteit van walnootmicroplanten beter is wanneer de wortels zich ex vitro vormen onder mist dan in vitro in een gelvormig medium (Leslie et al., 2010).
Figuur 6. (a) en (b) In vitro bewortelde microvermeerderde kersenplantjes, klaar om te worden uitgeplant in een sphagnum-veen-kasmedium voordat ze onder een hoge relatieve vochtigheid worden geplaatst om te acclimatiseren. (c) Het uitplanten van de kersenplantjes als eerste stap in de acclimatisatie in een kas. (d) Het planten van walnootplantjes in een plat vlak voordat ze onder hoge relatieve vochtigheid in een kas worden geplaatst.
Ex vitro beworteling kan een verbetering zijn ten opzichte van in vitro beworteling. Hoewel in vitro microscheuten van Gardenia jasminoides in 10 dagen beworteld waren, vergeleken met 14 dagen voor ex vitro microscheuten, overleefden alle ex vitro bewortelde microscheuten de acclimatisatie, vergeleken met 80% overleving voor in vitro bewortelde microscheuten (Hatzilazarou et al., 2006). Een slechtere overleving van in vitro bewortelde microscheuten in vergelijking met ex vitro bewortelde microscheuten werd ook gerapporteerd voor walnoot (Leslie et al., 2010).
Het kan nodig zijn om microscheuten met auxine te behandelen voordat ze in een bewortelingsmedium worden geplant voor ex vitro beworteling. Pistache microscheuten behandeld met 2% IBA in talk bewortelden ex vitro met 79% in vergelijking met 48% beworteling voor de controles (Benmahioul et al., 2012).
Betere ex vitro beworteling kan ook worden verkregen met auxine toegepast als een vloeibare dip aangebracht op het basale gedeelte van microscheuten. Een puls van 15 minuten in 250 µM IBA zorgde ervoor dat 90% van de microscheuten van de boomsoort Melia azedarach wortelden, terwijl de microscheuten van de controlemicroscheuten niet wortelden (Husain en Anis, 2009). Een onderdompeling van 2 uur in een waterige oplossing van 588 µM IBA deed 90% van de microscheuten van Malus zumi wortelen, vergeleken met 20% beworteling bij de controlemicroscheuten (Xu et al., 2008).
Misschien als gevolg van een terugkeer naar de jeugdigheid kan een langere tijd van vermenigvuldiging in vitro de beworteling van microscheuten verhogen. Leva en Petruccelli (2012) testten de beworteling tot en met zeven subculturen en ontdekten dat de beworteling het beste was na de zevende subcultuur.
Faciliteiten, de soort, de verzendmethode, de vraag van de klant en de voorkeuren van het management bepalen allemaal hoe microscheuten worden beworteld. Soorten die zeer gemakkelijk wortelen of wortelen tijdens de proliferatiefase van de scheuten kunnen snel aan de ex vitro omgeving worden geacclimatiseerd. Het zijn de moeilijke soorten die speciale aandacht krijgen, wat betreft verlichting, auxinebehandeling, beworteling in vitro of ex vitro, en andere factoren. Moeilijk bewortelbare klonen vragen van de klanten een hogere prijs omdat beworteling een efficiënte productie in de weg staat. Beworteling kan worden verbeterd als het wordt benaderd als een meerstappenproces van competentieverwerving, wortelinitiatie en daaropvolgende wortelgroei. Al deze stappen moeten worden overwogen en aangepakt, vooral bij de meer moeilijk te bewortelen klonen.