Aggregatie van ampholine op heparine en andere zure polysacchariden in isoelectric focusing

Het mechanisme van complexatie van pI range 3.5–5 Ampholine aan heparine in isoelectric focusing is onderzocht door de kleurstofbindende techniek bij verschillende pH waarden in oplossing. Er is geen significante interactie tussen heparine en amfoline bij pH 6,7. Zwakke, of selectieve, binding treedt op bij pH 5,1, en zeer sterke interactie bij pH 3,5. In het laatste systeem lijken de Ampholine componenten zich te gedragen als polykationen vanwege hun geordende opeenvolging van positieve ladingen, elk twee methyleengroepen uit elkaar, hetgeen een sterke binding aan polyanionen bevordert. Bovendien blijken er variabele stoichiometrieën te zijn voor de sterke binding tussen heparine en Ampholine, afhankelijk van hun relatieve hoeveelheden. Voorgesteld wordt dat bij een lage verhouding van heparine tot Ampholine (Ampholine-overschot), de aggregatie loodrecht op de heparine-keten staat, waarbij de eind-ammonium lading van elk Ampholine molecuul één negatieve lading langs het heparine-molecuul neutraliseert; bij hogere verhoudingen (heparine-overschot), wordt het gebonden Ampholine-segment parallel aan het heparine-molecuul uitgelijnd, zodat gemiddeld één Ampholine-component ca. drie negatieve ladingen neutraliseert. De banding van heparine bij iso-electrische focussering in het pH-gebied 3,0 – 4,5 kan worden verklaard door aggregatie van de verschillende componenten aan heparine in hoeveelheden die afhangen van de netto lading van de Ampholine soorten bij de gegeven pH, en van de veranderende stoichiometrie als functie van de variatie in de verhouding van heparine tot Ampholine langs de pH gradiënt. Binding van Ampholine aan polygalacturonaat werd ook aangetoond bij overmaat Ampholine in een pH-bereik afhankelijk van de mate van protonering van de carboxylgroepen van dit zure polysaccharide alsmede van de netto positieve lading van de Ampholine. De aggregatie gezien bij pH 4,2 – 4,5 leidde tot de voorspelling en daaropvolgende demonstratie dat polygalacturonaat ook binding zou vertonen bij iso-electrische focussering. Dit ondersteunt de hypothese dat aggregatie van Ampholine op polyanionen met voldoende ladingsdichtheid een algemeen verschijnsel is dat kan leiden tot valse banding van bepaalde polymeren bij geschikte pH-bereiken bij iso-elektrische focussering. Op basis van hun gedrag bij iso-elektrische focussering bij pH 3,0 – 4,5, lijkt de aggregatiesterkte van de bestudeerde polyanionen als volgt te zijn: heparine A = heparine B groter dan polyglutamaat groter dan carboxyl-gereduceerde heparine B groter dan polygalacturonzuur.