Allozymevariatie in een natuurlijke populatie van Stryphnodendron adstringens in het Rio Preto State Park, Zuidoost-Brazilië

BIOCHEMISTRY AND PHYSIOLOGY

Allozymevariatie in een natuurlijke populatie van Stryphnodendron adstringens in het Rio Preto State Park, Zuidoost-Brazilië

Jacqueline Siqueira GlasenappI,*; Priscila Barros BarbosaI; Vicente Wagner Dias CasaliI; Ernane Ronie MartinsII; Cosme Damião CruzIII

IUniversidade Federal de Viçosa, Departamento de Fitotecnia, Av. PH Rolfs s/n, 36570-000 Viçosa, MG, Brazil
IIUniversidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Agrárias, Avenida Universitária 1.000, Bairro Universitário, Montes Claros, 39404-547 MG, Brazil
IIIUniversidade Federal de Viçosa, Departamento de Biologia, Av. PH Rolfs s/n, 36570-000 Viçosa, MG, Brazil

ABSTRACT

Bladeren en vruchten van 63 Stryphnodendron adstringens bomen werden bemonsterd in het Rio Preto State Park om de allozyme segregatie, weefselspecifieke expressie van allozyme loci, en hun genetische parameters te analyseren. De enzymsystemen ADH, EST, ACP, PGM, PGI, GDH, G6PDH, GOT, IDH, LAP, MDH, PER en SKDH werden beoordeeld door middel van zetmeel-gelelectroforese. De polymorfe systemen PGI, IDH, MDH en GOT vertoonden een dimere quaternaire structuur, terwijl EST en PER monomeer waren. De totale verwachte genetische diversiteit (HE) voor bladeren en zaden bedroeg respectievelijk 0,325 en 0,244. Het effectief aantal allelen per locus (AE) bedroeg 1,58 in bladeren en 1,42 in zaden. De waarden van HE en AE waargenomen in S. adstringens waren relatief hoger dan de gemiddelde waarden waargenomen in allozyme studies van andere houtige planten. De waarden van de fixatie-indices voor de populatie, rekening houdend met bladeren (f = 0,070) en zaden (f = 0,107), waren niet significant. De hoge waarden van genetische diversiteit en van effectief aantal allelen per locus, evenals de niet-significante fixatie-index en de aanpassingen van de Hardy-Weinberg verhoudingen tussen generaties voor de pgi-1, mdh-2 en idh-1 loci, duiden op willekeurige paring in deze populatie. De enzymsystemen EST en PER vertoonden hun beste resolutie in bladweefsels, terwijl de MDH-, IDH-, PGI- en GOT-systemen hun beste resolutie in zaadweefsels vertoonden.

Key words: allozyme segregatie, genetische diversiteit, heterozygositeit, medicinale planten

INLEIDING

Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville (Mimosoideae, Leguminosae) is een kleine groenblijvende boom (plaatselijk barbatimão genoemd) die wijd verspreid is in de Cerrado (Braziliaanse savanne) biome (Ortiz et al. 2003). Hij wordt in de traditionele geneeskunde gebruikt voor de behandeling van zweren, zweren, aambeien (Barros 1982), gastritis, keelpijn (Hirschmann & Arias 1990), leukorroe, hernia’s, diarree, bloedingen, ringworm en oogaandoeningen (Pio Correa 1926, Almeida et al. 1998). De trosvormige andromonoecieuze bloeiwijzen hebben kleine en dicht opeen staande bloemen. Kruisbestuiving is van vitaal belang voor de vruchtvorming bij deze soort en de voornaamste bloembezoekers lijken vliesvleugeligen (Hymenoptera) te zijn; andere bloembezoekers zijn Diptera, Lepidoptera en Coleoptera. De productie van vruchten wordt beperkt door de beschikbaarheid van hulpbronnen (Ortiz et al. 2003).

Stryphnodendron adstringens populaties die vroeger uitgestrekte Cerrado gebieden bedekten zijn nu geïsoleerd in kleine fragmenten als gevolg van ontbossing, willekeurig landgebruik, en stedelijke ontwikkeling. Een van de weinige gebieden waar de Cerrado-vegetatie nog goed bewaard is gebleven, is het Rio Preto State Park (RPSP), gelegen in de gemeente São Gonçalo do Rio Preto in de Serra do Espinhaço Reserve Biosphere, 70 km van de stad Diamantina in de deelstaat Minas Gerais, in het zuidoosten van Brazilië. Het park beslaat een totale oppervlakte van 12.185 ha. dat grotendeels bedekt is met cerrado sensu stricto en campos de altitude vegetatie. De fauna en flora in het RPSP zijn zeer rijk en omvatten vele bedreigde soorten zoals S. adstringens (IEF 2011). De Espinhaço Range fungeert als waterscheiding voor de stroomgebieden van veel centraal-oostelijke rivieren, evenals voor de grote São Francisco rivier (Saadi 1995), en scheidt twee belangrijke biomen in zijn centrale en zuidelijke delen: het Atlantische regenwoud op de oostelijke hellingen, en de Cerrado biome op de westelijke hellingen (Melo Júnior et al. 2001).

De genetische rijkdommen van geneeskrachtige planten (vooral boombewonende soorten) zijn eindig, en veel Cerrado-planten zijn op grote schaal gebruikt zonder zich te bekommeren om hun behoud of vernieuwing. Het is van essentieel belang dat onze overgebleven bosbestanden verstandig worden gebruikt – en genetische studies zijn van fundamenteel belang om een volledig inzicht te krijgen in hun evolutieve processen en om instandhoudingsstrategieën te ontwikkelen die de toekomst van de beheerde soorten kunnen garanderen. Met behulp van isozymtechnieken kunnen de niveaus van genetische variatie in natuurlijke populaties van tropische bosbomen worden bepaald en kunnen populatieprocessen worden gemeten die van belang zijn voor ecologen, natuurbeschermers en bosbeheerders (Loveless 1992). Er zijn echter zeer weinig studies beschikbaar over het niveau van genetische variatie in houtachtige Cerrado planten. Er zijn twee studies van genetische diversiteit in S. adstringens gepubliceerd, de eerste was gebaseerd op microsatellietgegevens (Branco et al. 2010) en de tweede op RAPD-merkers (Camillo et al. 2001), maar er zijn geen isozymenstudies gerapporteerd.

Door het feit dat de genen die de isozyme-expressie controleren zich in bepaalde ontwikkelingsstadia en in specifieke organen en weefsels manifesteren, of in reactie op bepaalde stimuli (Ramírez et al. 1991), kunnen zymogrammen van extracten van zaden, zaailingen en de bladeren van volwassen planten sterk verschillen (Alfenas & Brune 1998). Veel enzymen, zoals esterases, peroxidases, fosfatases en peptidasen vertoonden ook ontwikkelings- en omgevingsvariaties die Mendeliaanse segregatie nabootsen (Conckle 1971b, Kelley & Adamns 1977) en genetische (Law 1967) of omgevings post-translationele modificaties (Cullis 1977), zodat Mendeliaanse analyses essentieel zijn in studies van niet-specifieke enzymassays (Hart & Langston 1977). De beste manier om dit probleem aan te pakken is door middel van Mendeliaanse analyses na te gaan of een bepaalde reeks isozyme varianten echte allozymen zijn, d.w.z. dat zij worden gecodeerd door verschillende allelen op dezelfde locus (Broun & Moran 1979).

De doelstellingen van de huidige studie waren het evalueren van de weefselspecifieke expressie en segregatie van allozyme loci, het meten van genetische parameters, en het beschrijven van bruikbare allozyme varianten voor toekomstige evaluaties van de genetische structuur van S. adstringens populaties.

MATERIAAL EN METHODEN

De vegetatie in het RPSP-reservaat is goed bewaard gebleven en S. adstringens is zowel binnen als buiten het park zeer algemeen, en komt vrijwel continu voor in de gemeenten Olhos D’Água en Diamantina, Minas Gerais State, Brazilië. Er werden monsters genomen van bladeren en vruchten (in hun laatste rijpingsstadia) van 63 individuele S. adstringens bomen. De gemiddelde afstand tussen de bemonsterde bomen was 60 m. De vruchten werden vervoerd in papieren zakken en de bladeren werden ondergedompeld in vloeibare stikstof tot ze werden onderzocht in het Laboratorium voor Plantenreproductie van de Federale Universiteit van Viçosa.

De huidige studie richtte zich op de isozyme varianten (allozymes) aanwezig in deze S. adstringens populatie. De analyses werden uitgevoerd met de zetmeel-gel electroforese techniek, waarbij de allozymen werden geëxtraheerd uit de bladeren en drie zaden van elke bemonsterde boom. Er werd gebruik gemaakt van de door Alfenas et al. (2006) aanbevolen verhouding van 1 g bladweefsel of 1 zaadje tot 3 mL extractievloeistof #1. De gels werden bereid met 12 g sacharose en 60 g zetmeel per 500 mL gelbufferoplossing. De gebruikte buffersystemen volgden Soltis et al. (1983) (buffer A) en Shaw & Prasad (1970) (buffer B). Een pre-run werd uitgevoerd bij 15 mA gedurende 30 min. met buffer A, en gedurende 1 uur met buffer B. De extract runs werden uitgevoerd bij 35 mA en duurde ongeveer 5 uur. De geanalyseerde allozyme systemen en de samenstelling van de elektrode / gel buffersystemen worden beschreven in tabel 1.

De zymogrammen werden geanalyseerd en de allozyme loci werden geïdentificeerd met gebruikmaking van dezelfde afkortingen die gebruikt worden om elk enzymsysteem aan te duiden (bijvoorbeeld PGI voor fosfoglucose-isomerase) in cursieve kleine letters, gevolgd door de oplopende numerieke volgorde, beginnend met de langzamer migrerende locus (bijvoorbeeld pgi-1). Het snelst migrerende allel op elke locus werd aangeduid met de letter a, terwijl de langzamer migrerende allelen in alfabetische volgorde volgden. Statistische tests met betrekking tot allelfrequenties werden alleen uitgevoerd voor loci die eenvoudige banderingspatronen vertoonden die gemakkelijk konden worden geïdentificeerd.

Gecontroleerde kruisingsexperimenten of allozymestudies met gebruikmaking van haploïde weefsels (zoals pollen) zijn nodig om de mendeliaanse overerving te testen en de zymogrammen correct te interpreteren (Hart & Langston 1977, Broun & Moran 1979, Alfenas & Brune 1998). Deze studies zijn moeilijk uit te voeren bij S. adstringens omdat het een niet-gedomesticeerde, allogame en traag groeiende plant is, en de meeste van zijn trossen er niet in geslaagd zijn vruchten voort te brengen door zelfbestuiving (Rocha & Moraes 1997, Ortiz et al. 2003).

Brown & Moran (1979) merken op dat de beste manier om een verkeerde interpretatie van isozymegegevens te voorkomen het gebruik van Mendeliaanse analyses is om te verifiëren dat sets van isozymevarianten werkelijk allozymen zijn en dat ze worden gecodeerd door allelen op één locus. Om de overervingsmodi van allozymen correct te identificeren zonder genetische kruisingen of studies van haploïde weefsels uit te voeren, analyseerden we daarom de genotypische proporties van de allozymen tussen generaties door de allelfrequenties van bladeren en zaden van dezelfde plant te meten. Met behulp van de waargenomen allelfrequenties in de bladeren van 63 bomen berekenden we de verwachte genotypefrequenties onder een Hardy-Weinberg-evenwicht (HWE) voor een even grote steekproef van nakomelingen (189 zaden). Individuele zaden of zaailingen kunnen worden onderzocht als leden van een nageslachtreeks (Brown & Moran 1979). De verwachte allelfrequenties van de nakomelingen werden vervolgens vergeleken met dezelfde steekproefgrootte van geteste nakomelingen met behulp van de chi-kwadraat toets (X2). Aangezien deze soort allogaam is en de mannelijke ouders onbekend zijn, werden de individuen van de populatie zelf beschouwd als de mannelijke gametenverzameling (Cruz 2005), en de mannelijke allelfrequenties werden daarom gelijk geacht aan die van de wijfjes, uitgaande van een HWE.

De genetische parameters van het effectieve aantal allelen, genetische diversiteit (HE en HO) (Nei 1973), en fixatie-index (Wright 1951) werden geschat. De verwachte verhouding van heterozygote loci per individu (HE) is een samengestelde maat die de genetische variatie op het allelniveau samenvat. Deze parameter, die vaak genetische diversiteit wordt genoemd, werd voor elke locus berekend en gemiddeld over alle loci (Berg & Hamrick 1997). De Li & Horvitz (1953) test van de fixatie-index (f) werd uitgevoerd. Elke locus werd afzonderlijk getest en de χ2-waarde en df’s werden over alle loci samengeteld om een algemene test van de gemiddelde multilocus f te verkrijgen. De statistische analyses werden uitgevoerd met het Genes softwaresysteem voor genetica en statistiek. Fisher’s exact en chi-kwadraat (χ2 ) tests werden gebruikt om de waarschijnlijkheid te berekenen van de genotypische rangschikkingen die in de bladeren en zaden werden waargenomen.

RESULTATEN EN DISCUSSIE

Verschillen werden waargenomen in termen van de actieve regio’s en het aantal loci en allelen tussen de bladeren en zaden voor de polymorfe systemen van malaatdehydrogenase (MDH), fosfoglucose-isomerase (PGI), isocitraatdehydrogenase (IDH), glutamaat-oxaloacetaattransaminase (GOT), peroxidase (PER), en esterase (EST); de PGI-, IDH-, EST- en SKDH-systemen daarentegen vertoonden activiteit op dezelfde loci. De actieve gebieden, het aantal loci, het aantal allelen, de quaternaire structuur die bij polymorfe systemen is waargenomen, en de quaternaire structuren die in de literatuur zijn vermeld, staan vermeld in tabel 2. De schematische voorstelling van de variatie in de polymorfe systemen die in de statistische analyses zijn gebruikt (PGI, IDH, GOT en PER), is weergegeven in figuur 1.

Twee regio’s van MDH-activiteit waren duidelijk in de gels van bladeren (vrouwelijke ouders), terwijl slechts één regio duidelijk was in de gels van zaden (nakomelingen). De activiteit van de katodale regio werd voornamelijk waargenomen in de bladeren en leek te worden gecontroleerd door één locus (mdh-1); deze vertoonde een monomeer isozymenpatroon in tegenstelling tot de dimere of tetramere patronen die gewoonlijk worden waargenomen (Brune et al. 2006). De monomorfe locus mdh-2 in de anodale regio was alleen zichtbaar in zaden, en de dimere locus mdh-3 viel samen in bladeren en zaden, en vertoonde een dimeer patroon met twee allelen die duidelijk en consistent in beide organen werden waargenomen. MDH is geïsoleerd uit verschillende bronnen, waaronder archaea, eubacteriën, schimmels, planten en zoogdieren, en is beschreven als bestaande uit twee of vier subeenheden (Musrati et al. 1998, Brune et al. 2006).

Twee samenvallende actieve regio’s werden waargenomen in de PGI gels in zowel bladeren als zaden die gecontroleerd leken te worden door een locus en door twee allelen elk. De pgi-1 locus vertoonde een dimeer patroon met hybride banden typisch voor heterozygote individuen en twee allelen. De anodale (pgi-2) locus vertoonde een banderingspatroon dat typisch is voor monomere enzymen. Hoewel een monomeer patroon van PGI is waargenomen bij micro-organismen zoals Archaeoglobus fulgidus en Methanosarcina mazei (Hansen et al. 2005), is dit enzym over het algemeen dimeer (Cini et al. 1988, Tekamp-Olson et al. 1988, Sun et al. 1990, Brune et al. 2006). IDH gels van bladeren en zaden toonden een activiteitszone aan die gecontroleerd wordt door een locus (idh-1) met drie allelen. Het enzym IDH is goed bestudeerd in schimmels en dieren en is gewoonlijk dimeer of oligomeer (Brune et al. 2006); een dimeerstructuur is bevestigd in planten zoals Cucumis sativus (Watanabe et al. 2007) en de kersenboom (Granger et al. 1992). GOT gels toonden twee actieve regio’s in de zaden en één actieve regio in de bladeren. De anodale regio vertoonde een patroon van twee vaste banden die zowel in de bladeren als in de zaden zichtbaar waren (got-2 en got-3). Een actieve catodale regio uit zaadextracten toonde slechts één locus (got-1) met twee allelen en een dimeer bandpatroon. Van GOT-legerzymes is bekend dat ze dimere patronen hebben in planten (Kephart 1990).

Drie actieve regio’s werden waargenomen in de PER gels van de bladeren, en twee actieve regio’s werden gezien in de zaad gels. Hoewel de banderingspatronen van de nakomelingen (zaden) overeenkwamen met die van de bomen (bladeren), waren vergelijkingen tussen bladeren en zaden niet mogelijk vanwege de slechte resolutie van de meeste nakomelingen. Een monomeer patroon met één locus (per-1 en per-2) en twee allelen was duidelijk in elk anodaal en intermediair gebied van bladextracten, in overeenstemming met de resultaten van Brune et al. (2006). Kersenbomen toonden een dimere quaternaire structuur aan (Granger et al. 1992), maar monomeren werden waargenomen in Cucumis sativus, Roystonea regia (Watanabe et al. 2007), en Allium sativum (Marzouki et al. 2005).

Drie actieve regio’s waren duidelijk in de EST gels, en hoewel het aantal loci en allelen gelijk was voor bladeren en zaden, waren de banding patronen niet duidelijk genoeg bij alle individuen om statistische analyses mogelijk te maken. Er werd een monomeer patroon waargenomen met één locus en twee allelen in elk anodaal en intermediair gebied, terwijl twee vaste loci werden waargenomen in het catodale gebied. Esterase is een van de meest polymorfe enzymsystemen in planten (Weeden & Wendel 1990) en het meest onderzochte systeem in rijst (Endo & Morishma 1983), en monomere of dimere varianten van deze enzymen worden meestal gevonden in planten (Brune et al. 2006). In de huidige studie werden alleen de banderingspatronen van de loci got-1, idh-1, pgi1, mdh-2, per-1 en per-2 duidelijk en consistent waargenomen in de gels en deze konden voor statistische doeleinden worden gebruikt. De steekproefgroottes en de allelfrequenties van de geanalyseerde polymorfe loci zijn vermeld in tabel 3.

Achromatische banden zonder waarneembare distributiepatronen werden waargenomen bij glucose dehydrogenase (GDH), alcohol dehydrogenase (ADH) en glucose-6-fosfaat dehydrogenase (G6PDH). Eén actief gebied werd waargenomen met een vast patroon van triplexbanden in de ADH-afstammelingsgelen; de banden varieerden in kleurintensiteit en de langzamer migrerende banden waren in het algemeen intenser gekleurd. Eén actief gebied met een vast patroon van vijf opeenvolgende banden werd waargenomen in GDH-afstammelingsgelen, waarbij de derde en de vijfde band een veel diepere kleurintensiteit vertoonden. De enzymsystemen leucineaminopeptidase (LAP), fosfoglucomutase (PGM), shikimaatdehydrogenase (SKDH) en zuurfosfatase (ACP) waren monomorf.

Verrassend genoeg waren de aanpassingstests aan de HWE proporties, en de Fisher’s en de χ2 tests niet significant voor alle geanalyseerde allozymsystemen in de verschillende soorten weefsels en tussen generaties (tabellen 4, 5). Er moet echter worden opgemerkt dat bij de HWE-tests (zoals bij elke andere statistische test) het onvermogen om de nulhypothese te verwerpen niet noodzakelijk wijst op de geldigheid ervan. Het is mogelijk dat genotypefrequenties in populaties waarin geen willekeurige paringen plaatsvinden, zodanig verdeeld zijn dat zij multinomiale verdelingen nabootsen (Li 1988). Het is ook mogelijk dat factoren die afwijkingen van de HWE-verwachtingen veroorzaken, genotypefrequenties in tegengestelde richtingen leiden, met niet-significante eindresultaten tussen de aantallen waargenomen en verwachte genotypen (Workman 1969, Cavalli-Sforza & Bodmer 1971).

De rijpe vruchten van S. adstringens worden intensief aangevallen door verschillende soorten insecten, en er blijven weinig of zelfs geen zaden achter in elke peul (Branco et al. 2009), en het is niet bekend of er een selectieve milieufactor is in deze predatie of dat deze directioneel is. Aangezien de bemonsterde vruchten geoogst werden in hun laatste rijpingsstadium en de zaden die gebruikt werden om de allelfrequenties van de nakomelingen te schatten niet onderhevig waren aan een vermeende selectieve druk, kan dit echter geleid hebben tot niet-significante resultaten. Men zou kunnen veronderstellen dat deze resultaten anders zouden zijn indien alleen rijpe zaden (die aan een natuurlijke selectiedruk waren onderworpen) waren gebruikt. Een ander punt dat in overweging moet worden genomen, is dat in deze studie werd uitgegaan van gelijkheid tussen de allelfrequenties van mannetjes en vrouwtjes. De waargenomen HWE tussen generaties zou dus niet reëel kunnen zijn als de allelfrequenties tussen mannelijke en vrouwelijke gameten in feite zouden verschillen. Uitkruising in populaties met een lage effectieve grootte kan dienen als een mechanisme voor het accumuleren van een teveel aan heterozygoten, waarbij de allelfrequenties tussen mannetjes en vrouwtjes in een kleine populatie alleen al door toeval verschillen (Balloux 2004, Souza et al. 2004) als gevolg van driftprocessen die resulteren in frequentere kruisingen tussen individuen met verschillende allelen.

De genetische diversiteit (HE), het effectieve aantal allelen per locus (AE), de waargenomen heterozygositeit (HO), en de fixatie-index (f) van de gemeten polymorfe loci staan vermeld in tabel 6. De locus idh-1 vertoonde de hoogste HO waarden in bladeren (0,535) en zaden (0,532). Dit resultaat werd verwacht als gevolg van het hogere aantal allelen in idh-1 dan in de andere polymorfe loci. De kleinste waarden werden waargenomen bij mdh-2 (HE = 0,106) en got-1 (HE = 0,125) in respectievelijk bladeren en zaden. De totale verwachte genetische diversiteit, rekening houdend met alle loci, was 0,325 in de bladeren en 0,244 in de zaden. Het effectief aantal allelen per locus (AE) voor de populatie was 1,58 in de bladeren en 1,42 in de zaden. De AE waarden die bij S. adstringens werden waargenomen waren hoger, en de HE waarden kleiner, dan de gemiddelde waarden die werden gerapporteerd in allozyme studies zoals gebundeld door Hamrick et al. (1992) die houtachtige plantensoorten evalueerden. Langlevende houtige soorten hebben gemiddeld een hoger effectief aantal allelen per locus (AE = 1.24) en meer genetische diversiteit (HE = 0.177) dan andere levensvormen. De bij S. adstringens gemeten f-waarden waren niet-significant voor alle loci, rekening houdend met bladeren (f = 0,070) en zaden (f = 0,107). Niettemin was de waarschijnlijkheid van niet-significantie van de fixatie-index van zaden (P = 0,0918) verhoudingsgewijs kleiner dan die van bladeren (P = 0,8653). De totale fixatie-index die werd waargenomen voor bladeren en zaden was aanzienlijk kleiner dan die welke werd waargenomen met behulp van microsatellietgegevens (f = 0,3529) (Branco et al. 2009). Deze verschillen waren te wijten aan het hogere aantal allelen per locus van microsatellietmerkers, waardoor het aantal verwachte heterozygote loci toenam en bijgevolg de positieve waarden van de genetische parameter f.

De hogere waarden van genetische diversiteit en effectief aantal allelen per locus, de niet-significante fixatie-index, en de aanpassingen van de HWE-verhoudingen tussen generaties waargenomen voor de loci pgi-1, mdh-2 en idh-1 wijzen allemaal op willekeurige paring in deze populatie van S. adstringens. De allozymsystemen EST en PER waren duidelijker bepaald in bladweefsel, terwijl de systemen MDH, IDH, PGI en GOT duidelijker bepaald waren in zaadweefsel.

Erkentelijkheid – De auteurs danken de Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais (Fapemig) en de Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) voor financiële steun en voor de doctoraatsbeurs en de beurs voor wetenschappelijke inwijding; het Instituto Estadual de Florestas (IEF); en het Instituto de Ciências Agronômicas (ICA) van de Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).

Adams WT, Joly EJ. 1980. Genetica van allozyme varianten in loblolly pine. Tijdschrift voor Erfelijkheid 71:33-40.

Alfenas AC, Brune W. 1998. Eletroforese em gel de amido. In Eletroforese de isoenzimas e proteínas afins: fundamentos e aplicações em plantas e microorganismos (AC Alfenas, ed.). Editora Universidade Federal de Viçosa – UFV, Viçosa, p.47-63.

Alfenas AC, Dusi A, Zerbini Júnior FM, Robinson IP, Micales JA, Oliveira JR, Dias LAS, Scortichini M, Pereira MCB, Bonde RB, Alonso SK, Junghans TG, Brune W. 2006. Eletroforese e marcadores bioquímicos em plantas e microorganismos. 2 ed., Editora Universidade Federal de Viçosa – UFV, Viçosa, p.85-148.

Almeida SP, Proença CEB, Sano SM, Ribeiro JF. 1998. Cerrado: nuttige plantensoorten. Embrapa-CPAC, Planaltina.

Balloux F. 2004. Heterozygotie-overschot in kleine populaties en heterozygotie-overschot in effectieve populatiegrootte. Evolutie 58:1891-1900.

Barros MAG. 1982. Medicinale flora van het Federale District. Brasil Florestal 12:35-45.

Berg EE, Hamrick JL. 1997. Kwantificering van genetische diversiteit op allozyme loci. Canadian Journal of Forest Research 27:215-424.

Branco EA, Zimback L, Lima AB, Mori ES, Aoki H. 2009. Genetische structuur van populaties van Stryphnodendron astringens (Mart.). 4º Seminário de Iniciação Científica do Instituto florestal, 24 juni 2010. Federaal Instituut – IF Records Series 42-37.

Brown AHD, Moran GF. 1979. Isozymen en de genetische rijkdommen van bosbomen. In Proceedings of the Symposium on Isozymes of North American Forest Trees and Forest Insects (MT Conkle, Technical Coord.). Pacific Southwest Forest and Range Experiment Station, Berkeley, p.1-10.

Brune W, Alfenas AC, Junghan, TG. 2006. Specifieke identificaties van enzymen in gels. In Elektroforese en biochemische markers bij planten en micro-organismen (AC Alfenas, ed). Editora Universidade Federal de Viçosa – UFV, Viçosa, p.202-328.

Camillo J, Ciampi A, Vieira RF. 2001. Analyse van de genetische variabiliteit in barbatimão (Stryphnodendron astringens) met behulp van RAPD-merkers. In Anais do Encontro do Talento Estudantil da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 6, Brasília, DF. Embrapa Genetic Resources and Biotechnology, Brasilia, blz. 50.

Cavalli-Sforza LL, Bodmer WF. 1971. De genetica van menselijke populaties. W.H. Freeman and Company, San Francisco.

Cini JK, Cook PF, Gracy RW. 1988. Moleculaire basis voor de allozymen van boviene glucose-6-fosfaat isomerase. Archives of Biochemistry and Biophysics 263:96-106.

Cruz CD. 2005. Princípios de genética quantitativa. Editora Universidade Federal de Viçosa – UFV, Viçosa, p.252-254.

Cullis CA. 1977. Moleculaire aspecten van de milieu-inductie van erfelijke veranderingen in vlas. Erfelijkheid 38:129-154.

Endo T, Morishma, H. 1983. Rijst. In Isozymes in plant genetics and breeding (SD Tanksley, TJ Ortton, eds.). Elsevier, Amsterdam, deel B, p.129-146.

Granger AR, Clarke GR, Jacson JF. 1993. Sweet cherry identification by leaf allozyme polymorphism. Theoretical and Applied Genetics 86:458-464.

Hamrick JL, Godt MJW, Sherman-Broyles S. 1992. Factors influencing levels of genetic diversity in wood plant species. New Forest 6:95-124.

Hansen T, Schlichting B, Felgendreher M, Schonheit PJ. 2005. Cupin-type phosphoglucose isomerases (Cupin-PGIs) constitute a novel metal-dependent PGI family representing a convergent line of PGI evolution. Journal of Bacteriology 187:1621-1631.

Har GE, Langston PJ. 1977. Chromosomal location and evolution of isozyme structural genes in hexaploid wheat. Heredity 39:263-277.

Hirschmann GS, Arias AR. 1990. Een overzicht van medicinale planten van Minas Gerais, Brazilië. Tijdschrift voor Etnofarmacologie 29:159-172.

Kelley WA, Adams RP. 1977. Seasonal variation of allozymes in Juniperius scopulorum: systematic significance. American Journal of Botany 64:1092-1096.

Kephart SR. 1990. Starch-gel electrophoresis of plant allozymes a comparative analysis of techniques. American Journal of Botany 77:693-712.

Law GRJ. 1967. Alkalische fosfatase en leucine aminopeptidase associatie in plasma van de kip. Science 156:1106-1107.

Li CC, Horvitz DG. 1953. Some methods of estimating the inbreeding coefficient. American Journal of Human Genetics 5:107-117.

Li CC. 1988. Pseudo-willekeurige paringspopulaties. Ter viering van het 80-jarig bestaan van de wet van Hardy-Weinberg. Genetica 119:731-737.

Loveless MD. 1992. Isozyme variatie in tropische bomen: patronen van genetische organisatie. New Forests 6:67-94.

Marzouki SM, Limam F, Smaali MI, Ulber R, Marzouki MN. 2005. A new thermostable peroxidase from garlic Allium sativum: purification, biochemical properties, immobilization, and use in H2O2 detection in milk. Toegepaste biochemie en biotechnologie 127:201-214.

Melo Júnior TA, Vasconcelos MF, Fernandes GW, Marini MA. 2001. Verspreiding en behoud van vogelsoorten in Serra do Cipó, Minas Gerais, Brazilië. Bird Conservation International 11:189-204.

Minas Gerais. Secretaria de Estado de Meio Ambiente e Desenvolvimento Sustentável. Instituto Estadual de Florestas. http://www.ief.mg.gov.br/component/content/196?task=view (bekeken in 2011, 12 februari).

Musrati RA, Kollárová M, Mernik N, Mikulásová D. 1998. Malaatdehydrogenase: distributie, functie en eigenschappen. Algemene fysiologie en biofysica 17:193-210.

Nei M. 1973. Analyse van genendiversiteit in onderverdeelde populaties. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 70:3321-3323.

Ortiz PL, Arista M, Oliveira PE, Talavera S. 2003. Patroon van bloem- en vruchtproductie bij Stryphnodendron astringens, een andromonoecieuze peulvruchtboom van Centraal Brazilië. Plant Biology 5:592-599.

Pio Corrêa M. 1926. Dicionário de plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas. Imprensa Oficial, Rio de Janeiro, v.1.

Ramirez H, Calderon A, RoccaW. 1991. Técnicas moleculares para evaluar y mejorar el germoplasma vegetal. In Cultivo de tejidos en la agricultura: fundamentos y aplicaciones (W Rocca, L Mroginski, eds.). Internationaal Centrum voor Tropische Landbouw – CIAT, Cali, blz. 825-856.

Rocha AMS, Moraes JAPV. 1997. Invloed van waterstress op de gasuitwisseling in jonge potplanten van Stryphnodendron astringens (Mart.) Coville. Braziliaans Tijdschrift voor Plantenfysiologie 9:41-46.

Saadi A. 1995. De geomorfologie van de Espinhaço Range in Minas Gerais en zijn marges. Geonomos 3:41-63.

Shaw CR, Prasad R. 1970. Starch gel electrophoresis of enymes: a compilation of recipes. Biochemische Genetica 4:297-320.

Soltis DE, Haufler CH, Darrow DC, Gastony GJ. 1983. Starch gel electrophoresis of fern: a compilation of grind buffers, gel and electrode buffers, and staining schedules. American Fern Journal 73:9-27.

Sousa VA, Robinson IP, Hattemer HH. 2004. Variation and population structure at enzyme gene loci in Araucaria angustifolia (Bert.) O. Ktze. Silvae Genetica 53:12-19.

Sun AQ, Yuksel K, Jacobson TM, Grac RW. 1990. Isolation and characterization of human glucose-6-phosphate isomerase isoforms containing two different size subunits. Archives of Biochemistry and Biophysics 283:120-129.

Tekamp-Olson P, Najarian R, Burke RL. 1988. The isolation, characterization and nucleotide sequence of the phosphoglucoisomerase gene of Saccharomyces cerevisiae. Gene 73:153-161.

Watanabe L, Nascimento AS, Zamorano LS, Shnyrov VL, Polikarpov I. 2007. Purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of royal palm tree (Roystonea regia) peroxidase. Acta Crystallographica, Section F, Structural Biology and Crystallization Communications 63:780-783.

Weeden NF, Wendel JF. 1990. Genetica van plantaardige allozymes. In Allozymes in plant biology (DE Soltis, PS Soltis, eds.). Chapman and Hall, Londen, p.46-72.

Workman PL. 1969. De analyse van eenvoudig genetisch polymorfisme. Menselijke biologie 41:97-114.

Wright S. 1951. De algemene structuur van populaties. Annalen van Eugenetica 15:323-354.