Alpha-2 Adrenergic Receptor Agonists Block Stress-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking

Experiment 1: Effects of Clonidine, Lofexidine and Guanabenz on Footshock-Induced NE Release

Subjecten

De proefpersonen waren mannelijke Long-Evans ratten (Charles River, Quebec) met een gewicht van 300-350 g aan het begin van het experiment. Gedurende het experiment werden de dieren gehuisvest in een vochtigheids- en temperatuurgecontroleerde koloniezaal op een omgekeerd licht-donker schema (lichten aan 1730-0530 uur) en kregen vrije toegang tot standaard laboratorium rattenvoer en water. De experimentele procedures volgden de CCAC richtlijnen en werden goedgekeurd door de Animal Care Committee, Concordia University.

Chirurgie

Voor de operatie werden de ratten verdoofd met natriumpentobarbital (65 mg/kg, i.p.) en kregen ze atropinesulfaat (0,6 mg/ml; 0,2 ml/rat, SC) en antibioticum (Penlong, Rogar/STB Inc.; 0,1 ml/rat, i.m.) ingespoten. Geleidingscanules (20 gauge; Plastics One) werden geïmplanteerd voor het vervolgens inbrengen van dialysesondes; één werd geplaatst in PFC en één in AMG in tegengestelde hemisferen. De dieren die gebruikt werden om de effecten van guanabenz te bestuderen kregen een enkele geleidingscanule gericht op PFC. De hemisfeer waarin de respectievelijke geleidingscanules werden geïmplanteerd werd in evenwicht verdeeld over de behandelingen. De gebruikte stereotaxische coördinaten (ten opzichte van bregma en schedeloppervlak) waren als volgt: AMG, AP -3,0 mm, ML ± 4,5 mm, DV -6,7 mm; PFC, AP + 3,2 mm, ML ± 0,5 mm, DV -1,5 mm (Paxinos en Watson 1997). Bij het inbrengen stak de schacht van de dialysesonde 1 mm uit van de geleidingscanules. Geïmplanteerde geleidingscanules werden aan de schedel bevestigd met roestvrijstalen schroeven en tandheelkundig cement. De geleidingscanules werden gesloten met inschroefbare obdurators. Alle dieren werden teruggebracht naar de kolonie kamer voor een herstelperiode van niet minder dan 1 week voorafgaand aan de testen.

Microdialyse

Microdialyse werd uitgevoerd in vier zeshoekige testkamers (42 × 39 × 33,5 cm) gebouwd van plexiglas met houten plafonds en roestvrij stalen staaf vloeren. Rond elke kamer waren donkere gordijnen getrokken en de verlichting werd in omgekeerde cyclus verzorgd door gloeilampen (15 W). De dialysesonde bestond uit een 1,8 mm (AMG) of 3,5 mm (PFC) stuk semipermeabel dialysemembraan (Spectra/Por; 240 μm o.d., 13000 M.W. cutoff), aan één kant gesloten en aan de andere kant bevestigd aan een 19 mm lange 26 gauge roestvrijstalen slang. Een 40-50 cm lange PE-20 buis verbond het andere uiteinde van de roestvrij stalen as met een infuuswartel die boven de testkamer was geplaatst en die op zijn beurt via een PE-20 buis was verbonden met een infuuspomp met variabele snelheid. Een kleine diameter, gesmolten-silicabuisje stak inwendig door de sonde, met één uiteinde dat 0,5 mm van de punt van de sonde rustte en het andere uiteinde dat de PE-buis 35 cm onder de infuuswartel verliet. De PE-20 buis werd aan de buitenkant beschermd tegen beschadiging door stalen veermantels. De sondes werden zo ontworpen dat de gehele lengte van het semi-permeabele membraan zich uitstrekte tot onder de tip van de geleidingscanule.

Afzonderlijke groepen dieren werden gebruikt om de effecten van elk van de geteste drugs te onderzoeken. Binnen elk team, werd elk dier willekeurig toegewezen aan de behandeling conditie. Dieren die voertuig injecties kregen werden uitgevoerd in elke ploeg, maar werden gecombineerd in een enkele groep voor statistische analyse. Uiteindelijke groepsgroottes (PFC / AMG) waren als volgt: voertuig (n = 15 / 17), clonidine 20 ug / kg (n = 7 / 6), clonidine 40 ug / kg (n = 9 / 5), lofexidine 75 ug / kg (n = 6 / 6), lofexidine 150 ug / kg (n = 5 / 6), guanabenz 640 ug / kg (n = 4, PFC). Met uitzondering van de dieren die guanabenz kregen, werden alle proefpersonen tweemaal gedialyseerd, eenmaal in de PFC en eenmaal in de AMG met een interval van 3-4 weken tussen de tests.

De sondes werden de dag voor het begin van de microdialyse testen ingebracht. Om occlusie te voorkomen, werd kunstmatige CSF (145 mM Na +, 2,7 mM K +, 1,22 mM Ca 2 +, 1,0 mM Mg 2 +, 150 mM Cl-, 0,2 mM ascorbaat, 2 mM Na 2HPO4, pH 7,4 ± 0,1) ’s nachts doorbloed met een snelheid van 0,06 ul / min. Dialysaat bemonstering en monitoring van de activiteit begon de volgende ochtend. De dialysaat debiet werd verhoogd tot 0,6 ul / min, en de basislijn dialysaat monsters (∼12 ul / monster) werden verzameld om de 20 min. Monsters werden verzameld tot een stabiele basislijn, gedefinieerd als een minimum van drie opeenvolgende monsters waarin dialysaat NE niveaus varieerde met ± 10%, werd bereikt. Na het vaststellen van stabiele NE-niveau’s kregen alle dieren een i.p. injectie (1 ml/kg) van het medicijn of het medium, 40 min. voor een periode van 10 min. van voetschokken. Schokken werden toegediend op een variabel tijdschema met een gemiddeld interval van 40 seconden (10-70 seconden bereik); elke schok (0,6 mA) was 0,5 seconden in duur. De monsters werden gedurende nog eens 120 minuten verzameld (6 monsters). De monsters werden onmiddellijk geanalyseerd met een van de twee vergelijkbare systemen voor hogedrukvloeistofchromatografie met elektrochemische detectie (HPLC-EC). De monsters (10 μl) werden geladen in omgekeerde-fasekolommen (15 × 0,46 cm; HAISIL C18, 5 μm; Sci. Products & Equipment, Concord, Ontario) via manuele injectiepoorten (Reodyne 7125; lus van 20 μl); de reductie- en oxidatiestromen voor NE, dihydroxyfenylazijnzuur (DOPAC), 5-hydoxyindoleazijnzuur (5-HIAA) en homovanillinezuur (HVA) werden gemeten met ESA-coulometrische detectoren met twee kanalen (Coulochem 5100, met een model 5021 conditioneercel en een model 5011 analytische cel, Sci. Products & Equipment). De stromen voor NE werden onafhankelijk van die voor DOPAC en HVA gemeten met gebruikmaking van afzonderlijke kanalen van de Coulochem-detectoren. De mobiele fasen (natriumacetaat 36 mM, SOS 3,1 mM, EDTA 100 μM, 5% acetonitril, op pH 3,7 gebracht met ijsazijn) werden met een snelheid van 1,4 ml/min door elk gesloten systeem gecirculeerd met behulp van Waters 510 HPLC-pompen. De pieken verkregen voor NE, DOPAC en HVA werden geïntegreerd en gekwantificeerd door EZChrom Chromatography Data System (Sci. Products & Equipment). Dialysaatmonsters van individuele ratten werden steeds met hetzelfde HPLC-EC systeem geanalyseerd, en de toewijzing van dieren aan elk systeem werd in alle behandelingsgroepen in evenwicht gebracht. Vóór de bemonstering werd het voedsel uit de kamers verwijderd, maar een waterdrinkbuis was beschikbaar. Aan het einde van de test, werd de bevestiging van de juiste plaatsing van de sonde bepaald door onderzoek van 30 um secties gesneden door de plaatsen van plaatsing van de sonde gekleurd met kresylviolet.

Experiment 2: Effecten van Clonidine op Footshock- en Cocaïne-geïnduceerde Reinstatement

Proefpersonen

De proefpersonen waren 25 mannelijke Long-Evans ratten (Charles River, Quebec) met een gewicht van 350-425 g aan het begin van het experiment. De dieren werden onderhouden zoals beschreven in Experiment 1.

Chirurgie

De dieren werden voorbereid voor de operatie zoals beschreven in Experiment 1. Een intraveneuze katheter (Dow Corning) werd geïmplanteerd in de rechter halsader. Een 3-cm lengte van silastic buisje werd ingebracht in de ader (binnendiameter 0,30 mm, buitendiameter 0,64 mm) en werd verbonden met krimpkous een 9-cm lengte van silastic buisje (binnendiameter 0,51 mm, buitendiameter 0,94 mm) die subcutaan werd doorgegeven aan de bovenkant van de schedel. De katheter werd met zijden hechtingen aan de ader bevestigd en kwam uit in een connector (een gemodificeerde 22 gauge canule; Plastics One, Roanoke, VA) die aan de schedel werd bevestigd met juweliersschroeven en tandheelkundig cement; over de opening van de canule werd een plastic kapje geplaatst. Dieren kregen 1-2 weken de tijd om te herstellen van de operatie.

Apparatuur

De zelftoediening kamers gebruikt in de experimenten waren uitgerust met een intrekbare hendel (Med Associates, St Albans, VT) en een niet-intrekbare “dummy” hendel. Beide hendels bevonden zich 9 cm boven de vloer. Een infuuspomp (Razel Scientific Instruments, Stamford, CT) werd geactiveerd door reacties op de intrekbare, of “actieve”, hendel. Reacties op de dummy hendel werden geregistreerd, maar resulteerden niet in activering van de pomp. Drug oplossing werd geleverd over een periode van 10-s in een volume van 65 ul. Gedurende de infusie periode, een witte stimulus licht net boven de actieve hendel werd verlicht en extra reacties gedurende deze tijd werden geregistreerd, maar resulteerde niet in reactivering van de pomp. Elke kamer voor zelftoediening werd uitgerust met een constante stroom, intermitterende, onontkoombare, elektrische voetschok via een scrambler op de vloer van het rooster (Grason-Stadler Generator #E1064GS of Med Associates). De voetschok werd geleverd gedurende 15 min volgens een variabel tijdschema met een gemiddeld interval van 40 seconden (10-70 seconden bereik). Elke schok (0,6 mA) was 0,5 seconden in duur. Deze intensiteit van de voetschokken is gevonden met behulp van onze apparatuur om de minimale die nodig zijn om betrouwbare reinstatement induceren.

Drugs

Cocaïne HCl werd verkregen van BDH Chemicals (Toronto, Canada) en werd opgelost in fysiologische zoutoplossing. Clonidine HCl werd gekocht bij Sigma (St Louis, MO) en werd opgelost in fysiologische zoutoplossing en geïnjecteerd i.p. (0, 20 en 40 ug / kg).

Procedure

Fase 1: Training. Ratten werden getraind in het zelf toedienen van cocaïne HCl (0,5 mg/kg/infusie, i.v.) volgens een vast-ratio-1 schema van bekrachtiging tijdens een dagelijkse 3 uur durende zelftoedieningssessie. Elke dag werd de helft van de dieren naar de operant kamers gebracht voor hun zelftoedieningssessie in de ochtend, ongeveer drie uur na het doven van de lichten, en de helft van de dieren werd naar de kamers gebracht in de namiddag, ongeveer zeven uur na het doven van de lichten. De groep dieren die de ochtend- en middagsessies kregen, wisselden elkaar dagelijks af, zodat aan het eind van de training alle dieren op beide tijdstippen een gelijk aantal zelftoedieningssessies hadden gekregen. Het was belangrijk dat alle dieren hadden vergelijkbare ervaring zelftoediening vroeg en laat op de dag, omdat tijdens fase 2 alle dieren ontvangen uitdoving sessies in de ochtend, gevolgd door een testsessie die typisch plaatsvond in de middag. Aan het begin van elke sessie werd gedurende 10 seconden een rood huislicht ontstoken voordat de intrekbare hefboom in de kooi werd gebracht. Het licht net boven de actieve hefboom brandde gedurende de eerste 30 seconden na het uitbrengen van de hefboom. De huislamp bleef gedurende de hele sessie branden. Zoals eerder aangegeven, resulteerden reacties op de actieve hendel in activering van de infuuspomp en verlichting van het licht boven de hendel gedurende de 10 seconden dat het geneesmiddel werd toegediend. Extra drukken op de hendel tijdens de periode van toediening van het geneesmiddel werd geregistreerd, maar resulteerde niet in reactivering van de pomp. De trainingsomstandigheden duurden 10 tot 12 dagen. Aan het eind van de training werden de dieren 7 tot 13 dagen ongestoord in de koloniezaal gelaten. Daarna vonden uitdoving en testen plaats. In dit experiment en in Experiment 3B werden groepen dieren toegewezen aan verschillende doses van de testmedicijnen. Alle dieren in elke groep werden vervolgens onderworpen aan drie testcondities; zoutoplossing, cocaïne en voetschok.

Fase 2: Uitdoving en testen. Tijdens extinctie en testen, die plaatsvonden gedurende vier opeenvolgende dagen, werden de dieren 24 uur per dag gehuisvest in de zelf-toedieningskamers. Voedsel en water waren vrij beschikbaar voor de dieren, behalve tijdens de dagelijkse uitdovings- en testsessies. Dieren werden naar de kamers gebracht in de avond voorafgaand aan de eerste dag van uitdoving en testen. Aangezien tijdens de trainingsfase elke dag twee afzonderlijke groepen ratten werden getest, werd één groep dieren getest tijdens de eerste vier dagen van fase 2 en werd de andere groep dieren getest tijdens de volgende vier dagen. Tijdens uitdoving en testen werden alle omstandigheden die aanwezig waren tijdens de training gehandhaafd, behalve dat het drukken op de hefboom niet resulteerde in cocaïne-infuus.

In deze en alle daaropvolgende herplaatsingsexperimenten, kregen de dieren meerdere dagelijkse uitdovingssessies van 1 uur, gescheiden door tussenliggende periodes waarin de hefboom werd teruggetrokken. Op dag 1, kregen de dieren vier uitdovingssessies; op dagen 2-4, kregen de dieren twee tot drie uitdovingssessies, voldoende om een basislijn niveau van reageren van 15 of minder reacties in een uur vast te stellen, gevolgd door een 180 min test sessie. De duur van de tussenliggende periodes werd constant gehouden voor elk experiment en kwam overeen met de vertraging die nodig is voor de absorptie van drugs tussen de injecties vooraf en het begin van de test. In het huidige experiment, de duur van de tussenliggende periodes was 40 min.

Bij de test, werden afzonderlijke groepen dieren voorbehandeld met ofwel 0, 20 of 40 ug / kg, i.p., clonidine vóór elk van de drie tests voor herintreding (zoutoplossing, cocaïne, en footshock), gegeven op opeenvolgende dagen en in een counterbalanced volgorde. Clonidine werd geïnjecteerd 40 min voordat de hendel werd ingebracht. Voor de primingtesten met zoutoplossing en cocaïne kregen de dieren een niet-contingente, i.p. injectie van zoutoplossing of cocaïne (20 mg/kg) 5 min. voor het inbrengen van de hefboom. Voor de voetschoktests werden de dieren blootgesteld aan een korte intermitterende voetschok van 15 minuten onmiddellijk vóór het inbrengen van de hefboom. De testsessies duurden 3 uur. De dosis cocaïne en de parameters van de voetschokken werden gekozen op basis van eerder werk van dit laboratorium (Erb et al. 1996; Erb et al. 1998; Shaham et al. 1998). De doses clonidine werden gekozen op basis van heropvoeringsexperimenten die we hebben uitgevoerd met met heroïne getrainde ratten (Shaham et al. 2000).

Experiment 3A: Effecten van Lofexidine op hoge reactiesnelheden voor sucrose

Omdat het farmacologische profiel voor lofexidine niet zo goed is gekarakteriseerd als dat voor clonidine, werd een experiment uitgevoerd om vast te stellen of, en bij welke doses, lofexidine prestatiestoornissen induceert. De doses in de heropvoedingstesten werden gekozen op basis van de resultaten verkregen in dit experiment.

Proefpersonen

De proefpersonen waren 8 mannelijke Long-Evans ratten (Charles River, Quebec) met een gewicht van 400-550 g aan het begin van het experiment. Ratten werden eerder gebruikt in een experiment gericht op het bestuderen van voetschok-geïnduceerde heropvoering van sucrose zoeken (Buczek et al. 1999). Dieren werden gehouden onder vergelijkbare omstandigheden als beschreven in Experiment 1.

Apparatuur

Elke zelftoediening kamer was uitgerust met twee stationaire hendels, symmetrisch gecentreerd op een zijpaneel, 5 cm boven de vloer. Reacties op een hendel, de “actieve” hendel, activeerde een pomp (Razel Sci. Stamford, CT). Reacties op de andere hefboom, de “dummy”-hefboom, werden geregistreerd maar hadden geen gevolgen. Activering van de pomp resulteerde in een 20 seconden durende levering van 0,18 ml sucrose-oplossing aan een vloeistof druppel bakje gelegen tussen de twee hefbomen. Gedurende de sucrose levering periode, een witte stimulus licht net boven de actieve hendel werd verlicht en extra reacties gedurende deze tijd werden geregistreerd, maar niet resulteerde in reactivering van de pomp.

Drugs

Lofexidine HCl werd royaal geleverd door Keith Davies, Britannia Pharmaceuticals Ltd, UK. Het geneesmiddel werd opgelost in fysiologische zoutoplossing en geïnjecteerd i.p. (0, 80, 120, 160 of 200 ug/kg).

Procedure

Dieren die eerder hadden geleerd om zelf sucrose toe te dienen in een andere studie (Buczek et al. 1999) kregen vervolgens vijf sessies over vijf opeenvolgende dagen waarin ze zelf een 30% sucrose-oplossing toedienden op een FR-1 schema. In de daaropvolgende dagelijkse sessies werden de dieren geïnjecteerd met ofwel voertuig (0 μg/kg) of lofexidine (80, 120, 160 of 200 μg/kg, i.p.) 60 min voor het begin van de zelftoediening sessie. Alle dieren kregen alle doses van lofexidine in een tegengestelde volgorde; de hoogste dosis van lofexidine werd tweemaal getest. Elke sessie waarin dieren werden behandeld met lofexidine werd gevolgd door een zoutoplossing voorbehandelingssessie om de mogelijkheid van carry-over effecten van het geneesmiddel te minimaliseren.

Experiment 3B: Effecten van Lofexidine op Voetschok- en Cocaïne-Geïnduceerde Reinstatement

Proefpersonen

De proefpersonen waren 49 mannelijke Long-Evans ratten (34 van Charles River, Quebec; 15 van Harlan Sprague Dawley, USA) met een gewicht van 350-400 g aan het begin van het experiment. De dieren werden gehouden zoals beschreven in Experiment 1. Er waren geen duidelijke verschillen in reactie tussen dieren van de twee leveranciers in elke fase van het experiment.

Procedure

Fase 1: Training. De dieren werden getraind in het zelf toedienen van cocaïne onder de condities beschreven in Experiment 2.

Fase 2: Uitdoving en testen. In dit experiment waren de tussenliggende perioden, zoals hierboven beschreven, 60 min in duur. Bij de test, werden afzonderlijke groepen dieren voorbehandeld met ofwel 0, 50, 100, 150, of 200 ug / kg, i.p., lofexidine vóór elk van de drie tests voor terugkeer (zoutoplossing, cocaïne, en footshock stress), gegeven op opeenvolgende dagen en in een counterbalanced volgorde (zie Experiment 2). Lofexidine werd geïnjecteerd 60 min voor het inbrengen van de hefboom. De testsessies duurden 3 uur. De doses lofexidine werden gekozen op basis van de resultaten verkregen in Experiment 3A.

Experiment 4: Effecten van Guanabenz op Voetschok- en Cocaïne-Geïnduceerde Reinstatement

Proefpersonen

De proefpersonen waren 18 mannelijke Long-Evans ratten (Charles River, Quebec) met een gewicht van 350-400 g aan het begin van het experiment. De dieren werden onderhouden zoals beschreven in Experiment 1.

Drug

Guanabenz werd gekocht bij Sigma (St Louis, MO) en werd opgelost in fysiologische zoutoplossing en geïnjecteerd i.p. (0, en 640 ug / kg).

Procedure

Phase 1: Training. Dieren werden getraind om zelf cocaïne toe te dienen onder de condities beschreven in Experiment 2.

Phase 2: Uitdoving en testen. In dit experiment waren de tussenliggende perioden, zoals hierboven beschreven, 60 min in duur. Bij de test werden de dieren voorbehandeld met 0 of 640 μg/kg guanabenz, i.p., vóór elk van de twee tests voor herintroductie (geen voetschok, voetschok of zoutoplossing, cocaïne), gegeven op opeenvolgende dagen (zie Experiment 2). Guanabenz werd geïnjecteerd 60 min voor het inbrengen van de hefboom. De testsessies duurden 3 uur. De dosis guanabenz werd gekozen op basis van zijn vervangbaarheid voor 40 μg/kg clonidine in een drug discriminatie procedure (Bennett en Lal 1982).

Statistische analyses

Microdialyse gegevens werden geanalyseerd met behulp van een gemengde factor ANOVA voor de concentratie van extracellulaire NE in 20 min dialysaat monsters; de tussen-subject factor was dosis van clonidine (0, 20, 40 ug/kg), lofexidine (0, 75, of 150 ug/kg), of guanabenz (0 of 640 ug/kg) en de herhaalde maatregel was tijd. Significante tijd/dosis-interacties werden onderworpen aan eenzijdige ANOVA’s voor de factor dosis op specifieke tijdstippen. Waar nodig werden post hoc tests (Fisher’s LSD, p < .05) uitgevoerd om het medium (0 μg/kg) te vergelijken met de drug condities.

De twee afhankelijke maten in de tests voor herintroductie waren het aantal responsen op de actieve hefboom (infusies + time-out responsen) en het aantal responsen op de inactieve hefboom in drie uur. Alle gedragsgegevens worden gepresenteerd als gemiddelden ± SEM. Vanwege de aanzienlijke variabiliteit in het aantal responsen in de verschillende testen voor herintroductie, werden de niet-parametrische statistieken voor verwante (Friedman en Wilcoxon) en niet-verwante (Kruskal-Wallis en Mann-Whiney) steekproeven gebruikt waar nodig.

Voor de sucrose studie (Experiment 3A) waren de afhankelijke maten het aantal responsen op de actieve (versterkte + time-out responsen) en inactieve hefbomen en het aantal bekrachtigingen verkregen. Herhaalde maatregelen ANOVA’s werden uitgevoerd met dosis als de binnen-subject factor. Waar nodig werden post hoc tests (Fisher’s LSD, p < .05) uitgevoerd om het voertuig (0 μg/kg) te vergelijken met de drug condities.