Ammoniumsulfaat Eiwit Precipitatie: The key to Salting-Out

BY admin

| oktober 18, 2021

Zoutneerslag kan een zeer krachtig hulpmiddel zijn om eiwitten te zuiveren door middel van precipitatie. Ammoniumsulfaat is meestal het zout van keuze, omdat het goedkoop is, zeer goed oplosbaar in water, en in staat is veel meer gehydrateerd te worden (een wisselwerking aan te gaan met meer watermoleculen) dan bijna elk ander ionisch oplosmiddel. In de praktijk wordt ammoniumsulfaat hetzij direct als vaste stof toegevoegd, hetzij als (meestal) verzadigde oplossing om de gewenste eiwitten neer te slaan.

Bij lage zoutconcentraties (<0,15M) heeft de toevoeging van meer zout in het algemeen de neiging de oplosbaarheid van eiwitten te vergroten doordat ionen de eiwitmoleculen afschermen van de ladingen van andere moleculen; deze tendens wordt “zouting-in” genoemd. Op een bepaald moment wordt de ionensterkte te hoog en begint ze een negatief effect te hebben op de oplosbaarheid van eiwitten, wat “salting-out” wordt genoemd. Dit gebeurt doordat het opgeloste zout met de eiwitten concurreert om schaarse watermoleculen, waardoor de oppervlaktespanning van het water toeneemt en het eiwit zich dus strakker gaat opvouwen. De vermindering van het eiwitoppervlak betekent minder interacties tussen eiwit en water, waardoor meer hydrofobe interacties tussen eiwitmoleculen mogelijk worden, waardoor aggregatie optreedt en vervolgens neerslag optreedt.

Eiwitten in oplossing kunnen ook worden gefractioneerd, aangezien ze zullen neerslaan als functie van de zoutconcentratie. Op deze manier is het mogelijk specifieke proteïnen te zuiveren door een bepaalde hoeveelheid ammoniumsulfaat toe te voegen om ongewenste proteïnen te doen neerslaan, het supernatant terug te winnen, en vervolgens wat meer ammoniumsulfaat toe te voegen om het gewenste proteïne te doen neerslaan en vervolgens die pellet van neergeslagen proteïne op te slaan. Aangezien het neerslaan met zout alleen de oplosbaarheid van eiwitten beïnvloedt en ze niet denatureert, kan de teruggewonnen fractie voor langere tijd in de zoutoplossing worden opgeslagen zonder zich zorgen te hoeven maken over bacteriële besmetting, aangezien het hoge zoutgehalte elke microbiële groei of protease-activiteit remt.

Omdat ammoniumsulfaat neerslag alleen de oplosbaarheid van eiwitten vermindert en niet denatureert eiwitten kunnen worden geconcentreerd door het verwijderen van de resterende ammoniumsulfaat oplossing dan het eiwit pellet kan worden opgelost in standaard buffers of een lagere concentratie van ammoniumsulfaat. Hydrofobe interactiechromatografie of gelfiltratiechromatografie kan dan worden gebruikt om de eiwitoplossing verder te zuiveren. Ammoniumsulfaat kan ook worden gebruikt om sommige eiwitten ontvouwen door denaturerende stoffen zoals ureum terug te leiden naar hun juiste natieve conformatie door geleidelijk verhogen van de concentratie van ammoniumsulfaat.

Er zijn een aantal beste praktijken die moeten worden overwogen bij het werken met ammoniumsulfaat, zoals:

Gebruik een mortier en stamper te breken klonten en anders malen van de ammoniumsulfaat aan toevoeging en oplossing te vergemakkelijken.
Voeg slechts een kleine hoeveelheid ammoniumsulfaat tegelijk toe, wacht tot het oplost en roer voorzichtig om schuimvorming te voorkomen.
Gebruik een buffer zoals 50 mM HEPES of Tris om het verzurende karakter van ammoniumsulfaat te minimaliseren.
Gebruik ammoniumsulfaat van analytische kwaliteit, omdat lagere kwaliteiten meestal zware metalen contaminatie.

Het proces van zout precipitatie komt met een aantal nadelen. Het zouten van eiwitten vereist voorafgaande kennis van de oplosbaarheid van het eiwit. Bovendien kunnen verontreinigingen in het oorspronkelijke monster nog steeds aanwezig zijn in de fractie die het eiwit van belang bevat; dit proces concentreert het eiwit, maar zuivert het niet. Bovendien kan het nodig zijn om het zout te verwijderen uit het eiwit monster en dus verdere verwerking in de vorm van dialyse of chromatografie nodig zal zijn.

Geef een antwoord Antwoord annuleren