AmpR Increases the Virulence of Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae by Regulating the Initial Step of Capsule Synthesis

Introduction

Klassieke K. pneumoniae (cKp) en hypervirulente K. pneumoniae (hvKp) zijn twee algemene K. pneumoniae pathotypen die momenteel circuleren.1,2 In Noord-Amerika en Europa worden de meeste K. pneumoniae-infecties veroorzaakt door cKp-isolaten, die meestal opportunistische pathogenen zijn die vooral infecties veroorzaken in de gezondheidszorg bij immuungecompromitteerde gastheren. Het meest problematische kenmerk van dit pathotype is het vermogen om een toenemend aantal elementen te verwerven die antimicrobiële resistentie verlenen. Carbapenem-resistente K. pneumoniae (CRKP), geassocieerd met carbapenemases op basis van plasmiden, vormt een duidelijke klinische uitdaging en veroorzaakt invasieve infecties met een hoge mortaliteit.3,4

Rapporten uit Taiwan beschreven een uniek klinisch syndroom van community-verworven, weefselinvasieve K. pneumoniae-infectie bij gezonde personen die zich vaak op meerdere plaatsen presenteerde of zich vervolgens verspreidde, inclusief pyogene leverabcessen.5,6 hvKp werd aangeduid om dit pathotype te onderscheiden van cKp, en de incidentie van infecties door hvKp is de laatste drie decennia gestaag toegenomen in landen in Azië en de Stille Oceaan.7-11 hvKp is gewoonlijk gevoelig voor antimicrobiële stoffen, maar het is ook resistent gebleken, en zelfs een extreem geneesmiddelresistent (XDR) cKp-isolaat dat een deel van een hvKp virulentieplasmide verwierf, veroorzaakte een fatale nosocomiale uitbraak.12-15

Een kenmerk waarvan men aanvankelijk dacht dat het gevoelig en specifiek was voor hvKp-isolaten was een hypermucoviscus fenotype, dat werd gedefinieerd door een positieve stringtest.16 Er ontstond echter enige verwarring omdat niet alle hvKp-isolaten als hypermucoviscus werden aangemerkt, en sommige cKp-isolaten dit kenmerk bezaten.17 Onlangs is aangetoond dat meerdere biomarkers, waaronder peg-344, iroB, iucA, plasmide-gecodeerde rmpA en rmpA2 en kwantitatieve siderofoorproductie, hvKp-isolaten nauwkeurig kunnen voorspellen; deze biomarkers zouden kunnen worden gebruikt om een diagnostische test te ontwikkelen voor gebruik door klinische laboratoria voor optimale patiëntenzorg en voor gebruik in epidemiologische surveillance en onderzoek.18 In deze studie hebben we echter een nieuwe groep niet-hypermucoviscous CRKP-isolaten geïdentificeerd die de meeste hvKp-specifieke genen ontberen. Een pan-genoomwijde associatiestudie (Pan-GWAS), proteoomanalyse en virulentietest in een diermodel toonden aan dat AmpR de virulentie van deze isolaten verhoogt door het reguleren van de initiatie van de kapsel synthese. Bovendien vonden we ook dat ampR gedragen door K-locus 47 (KL47) -stammen in deze studie niet in staat was om de virulentie van KL1 hypermucoviscous K. pneumoniae te verhogen.

Materialen en methoden

Klinische isolaten en gegevensverzameling

Niet-repetitieve klinische K. pneumoniae-isolaten werden verzameld uit routinematig gedetecteerde en opgeslagen monsters van de afdeling Laboratoriumgeneeskunde van 5 ziekenhuizen in de provincies Guangdong en Anhui tussen 2018 en 2019. Alle isolaten werden voor gebruik opgeslagen bij -80°C. Klinische informatie over patiënten werd verkregen. Soortenidentificatie en antimicrobiële gevoeligheidstesten werden uitgevoerd met het VITEK-2 compact systeem (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Frankrijk). De resultaten werden geïnterpreteerd volgens de richtlijnen gepubliceerd door het Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI; document M100-S26).19 De geïdentificeerde soorten van alle isolaten werden bevestigd met matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Frankrijk). CRKP werd gedefinieerd als resistent tegen imipenem of meropenem.

Hypermucoviscous fenotypic Characterization

Om het hypermucoviscous fenotype te identificeren met de string test, werden isolaten geënt op agar platen met 5% schapenbloed en geïncubeerd bij 37°C gedurende een nacht. De stringtest werd positief bevonden wanneer een viskeuze string van meer dan 5 mm kon worden gegenereerd door één enkele kolonie aan te raken met een standaard inoculatielus en de kolonie naar boven te trekken.2

Whole Genome Sequencing (WGS)

Een kweekvolume van 1 ml (optische dichtheid bij 600 nm van 0,6) werd gebruikt voor de extractie van genomisch DNA (gDNA) (Sangon, Shanghai, China). gDNA werd gesequenced op een Illumina HiSeq 2500 sequencer (Illumina, San Diego, CA, USA) met behulp van gepaarde-end 150-bp reads. De genoomassemblage werd uitgevoerd met de novo SPAdes Genome Assembler (versie 3.12.0).20 We voerden capsule typering uit op de geassembleerde sequenties met Kaptive (versie 0.5.1).21 Antimicrobiële resistentiegenen en virulentiefactoren werden geïdentificeerd in de isolaten door het scannen van de genoomcontigs tegen de ResFinder en VFDB databases met ABRicate (versie 0.8.7). Multilocus sequence typing (MLST) en core genome MLST (cgMLST) genotyperingsanalyse werden uitgevoerd met Ridom SeqSphere+ (versie 5.1.0).22 Complex type (CT) werd gedefinieerd door het K. pneumoniae cgMLST schema te volgen (www.cgmlst.org/ncs/schema/2187931). Fylogenetische boom constructie op basis van kern genoom single nucleotide varianten (SNV’s) werd uitgevoerd met behulp van de Harvest suite (versie 1.2) met een 1000-bootstrap test.23 De online tool iTOL werd gebruikt om weer te geven, te manipuleren en annoteren de fylogenetische tree.24 We annoteerden de genoomsequenties met Prokka (versie 1.13.3).25

Pan Genome-Wide Association Study (Pan-GWAS) Analysis

We gebruikten de pan-genoom pijplijn Roary (versie 3.12.0) om geannoteerde assemblies in GFF3-formaat te zetten (geproduceerd door Prokka) en berekenden het pan-genoom.26 We gebruikten Scoary (versie 1.6.16) om het bestand van “https://sanger-pathogens.github.io/Roary/” te nemen, creëerden een trait file en berekenden de associaties tussen alle genen in het accessoire genoom en de traits. We rapporteerden een lijst van genen gesorteerd op sterkte van associatie met P-waarde < 0,01 aangepast met Benjamini-Hochberg’s methode voor meervoudige vergelijkingen correctie.27

Proteoomanalyse

Een 1 mL kweekvolume (optische dichtheid bij 600 nm van 0,6) werd gebruikt voor eiwitextractie. Het monster werd driemaal op ijs gesoniceerd met een ultrasone processor met hoge intensiteit (Scientz) in lysisbuffer (8 M ureum, 1% proteaseremmer cocktail). De overblijvende debris werd verwijderd door centrifugatie bij 12.000 g bij 4°C gedurende 10 min. Tenslotte werd het supernatant verzameld en werd de eiwitconcentratie bepaald met een BCA-kit volgens de instructies van de fabrikant. Voor de ontsluiting werd de eiwitoplossing gereduceerd met 5 mM dithiothreitol gedurende 30 min bij 56°C en gealkyleerd met 11 mM iodoacetamide gedurende 15 min bij kamertemperatuur in het donker. Het eiwitmonster werd vervolgens verdund door toevoeging van 100 mM TEAB met ureum in een concentratie van minder dan 2M. Tenslotte werd trypsine toegevoegd in een verhouding 1:50 trypsine/eiwitmassa voor de eerste digestie ’s nachts en een verhouding 1:100 trypsine/eiwitmassa voor een tweede digestie van 4 uur. De tryptische peptiden werden opgelost in 0,1% mierenzuur (oplosmiddel A) en direct geladen op een zelfgemaakte reversed-phase analytische kolom (15 cm lang, 75 μm i.d.). De gradiënt werd als volgt uitgevoerd: een stijging van 6% tot 23% oplosmiddel B (0,1% mierenzuur in 98% acetonitril) over 26 min, een stijging van 23% tot 35% oplosmiddel B in 8 min, een stijging tot 80% oplosmiddel B in 3 min en het houden op 80% oplosmiddel B voor de laatste 3 min bij een constante stroomsnelheid van 400 nL/min op een EASY-nLC 1000 UPLC-systeem. De peptiden werden onderworpen aan NSI-bron gevolgd door tandem massaspectrometrie (MS/MS) in Q ExactiveTM Plus (Thermo), online gekoppeld aan de UPLC. De toegepaste elektrospray-spanning bedroeg 2,0 kV. Het m/z scanbereik was 350 tot 1800 voor full scan, en intacte peptiden werden gedetecteerd in de Orbitrap met een resolutie van 70.000. Peptiden werden vervolgens geselecteerd voor MS/MS met de NCE-instelling van 28, en de fragmenten werden gedetecteerd in de Orbitrap met een resolutie van 17.500. De data-afhankelijke procedure werd afgewisseld tussen één MS scan gevolgd door 20 MS/MS scans met 15.0 s dynamische uitsluiting. De automatische versterkingsregeling (AGC) werd ingesteld op 5E4. De vaste eerste massa werd ingesteld op 100 m/z. De resulterende MS/MS-gegevens werden verwerkt met behulp van de MaxQuant-zoekmachine (v.1.5.2.8). We gebruikten InterProScan (versie 5.37-76.0) om eiwitdomeinen te annoteren. Een gecorrigeerde p-waarde < 0,05 en een vouw verandering > 1,2 werden beschouwd als significant.

Constructie van de ampR Complement Mutant

K. pneumonia ampR (Supplementary Materials) werd gesynthetiseerd en geflankeerd met 5ʹXbaI en 3ʹHindIII restrictie plaatsen. Dit fragment werd restrictie verteerd en gekloond in pUC57. Het recombinant-DNA werd teruggehaald in Escherichia coli DH5α met ampicillineselectie. Na restrictie digestie werd het ampR fragment geligeerd aan de pBAD33 expressie vector (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. pBAD33-ampR werd gebruikt voor transformatie met behulp van electroporatie als standaard voor laboratorium-geïsoleerde E. coli. De ampR-complementstammen werden bevestigd door polymerasekettingreactie (PCR) (tabel S1). De expressie van ampR werd geïnduceerd door toevoeging van 100 μg/mL arabinose.

Muis Pulmonale Infectie Modellen

Een longontstekingsmodel van K. pneumoniae bij muizen werd gebruikt om de virulentie van isolaten te testen. Zes tot acht weken oude vrouwelijke BALB/c muizen onder specifieke pathogeen-vrije graad werden aangekocht bij Hunan SJA Laboratory Animal Co, Ltd. De muizen werden intraperitoneaal verdoofd met pentobarbital natrium (75 mg/kg) en geïnoculeerd met 1,0 × 107 kolonievormende eenheden (CFU) van K. pneumoniae door niet-invasieve intratracheale instillatie onder direct zicht. De overleving van de muizen werd gedurende 7 dagen na de infectie geobserveerd. Om bacteriële belasting in de longen te beoordelen, werden de organen van geïnfecteerde muizen gehomogeniseerd en opgelost in 1 ml fosfaatbufferoplossing (PBS); 50 ul werd geënt op vloeistof bouillon (LB) agar platen, en CFU telling werd uitgevoerd. Voor histopathologie analyse, werden segmenten van de longen gefixeerd met 10% neutrale formaline, ingebed in paraffine en gekleurd met hematoxyline en eosine voor visualisatie door lichtmicroscopie. Bacteriële belasting en histopathologische analyse werden uitgevoerd na 24 uur infectie.

Extractie en kwantificering van capsulair polysaccharide

Capsulaire polysacchariden werden geëxtraheerd met Zwittergent 3-14 detergens. De hoeveelheid ureumzuur werd vervolgens gemeten volgens de eerder beschreven methode.28 Parallel werden seriële verdunningen van de bacteriële cultuur uitgeplaat om het aantal CFU te bepalen, en de concentratie van capsulaire polysaccharide werd uitgedrukt volgens de hoeveelheid glucuronzuur (ug) voor 109 CFU / ml van het monster. Elk experiment werd uitgevoerd in drievoud.

Statistische analyse

Statistische analyse werd uitgevoerd met GraphPad Prism software versie 8 (La Jolla, Californië).

Resultaten

Isolate Kenmerken

Niet-repetitieve CRKP (n = 135) isolaten werden gebruikt in deze studie. Alle isolaten waren van het sequentietype 11 (ST11) en brachten K. pneumoniae carbapenemase (KPC-2) tot expressie, en 1 isolaat droeg zowel OXA-23 als KPC-2 (figuur S1). De isolaten werden met behulp van het cgMLST-schema aan 16 CT’s toegewezen. De meest voorkomende CTs waren CT1313 (n = 35), CT1291 (n = 20), CT3176 (n = 14), CT1814 (n = 13), en CT2410 (n = 11), gevolgd door 11 andere CTs die elk in minder dan 10 isolaten werden geïdentificeerd (Figuur 1). Alle isolaten werden ingedeeld bij twee KL-types, KL64 (n = 86) en KL47 (n = 49) (Figuur S2). Er werden geen hypermucoviscous isolaten gevonden. Uit de virulentiegenanalyse bleek dat geen isolaten die alle biomarkers voor differentiatie van de hvKp- en cKp-isolaten droegen, eerder waren gerapporteerd (figuur 1, figuur S2).18

Figuur 1 Fylogenetische analyse van 135 isolaten in deze studie. De takken van de verschillende CT type isolaten zijn weergegeven in kleuren. De overeenkomstige isolaten van elk CT-type zijn CT1291 (P1291-1 tot P1291-20), CT1313 (P1313-1 tot P1313-33, AH1313-1 tot AH1313-2), CT1689 (AH1689-1 tot AH1689-8), CT1772 (AH1772-1 tot AH1772-4), CT1814 (AH1814-1 tot AH1814-13), CT1819 (AH1819), CT2405 (P2405-1 tot P2405-9), CT2410 (P2410-1 tot P2410-11), CT2418 (P2418-1 tot P2418-4), CT2444 (P2444), CT2445 (P2445-1 tot P2445-6), CT3175 (AH3175-1 tot AH3175-2), CT3176 (AH3176-1 tot AH3176-14), CT3178 (AH3178-1 tot AH3178-4), CT3179 (AH3179-1 tot AH3179-2), en CT3195 (AH3195). rmpA, rmpA2, magA iroB, peg-344 en iucA werden in een eerdere studie geïdentificeerd voor de differentiatie van hypervirulente K. pneumoniae van klassieke K. pneumoniae.18

Clinical Data Analysis

Er waren geen significante verschillen tussen de CT’s wat betreft demografische gegevens, infectietypen, belangrijkste comorbiditeiten, invasieve ingrepen, Charlson comorbiditeitsindex en Pitt bacteriemie-score, met uitzondering van centraal veneuze katheter, en mortaliteit door alle oorzaken in het ziekenhuis (P = 0,035 en P = 0,001, Fisher’s exact test). Patiënten geïnfecteerd met CT3176 hadden significant hogere mortaliteitscijfers (78,6% vs 37,1%, P = 0,012; 78,6% vs 20,0%, P = 0,001; 78,6% vs 7,7%, P = 0,0003; 78,6% vs 31,0%, P = 0,004; Fisher’s exact test) vergeleken met respectievelijk de CT1313, CT1291, CT1814 en de andere CT-groepen. Het gebruik van centrale veneuze katheters in CT1814 was significant hoger dan dat in CT1313 en CT1291 (84,6% vs 51,4%, P = 0,049; 84,6% vs 35,0%, P = 0,011, Fisher’s exact test) (Tabel 1).

Tabel 1 Demografische gegevens, comorbiditeiten, Invasieve procedures en mortaliteit van patiënten met Carbapenem-resistente Klebsiella pneumoniae-infecties

Pan-GWAS-analyse

Om de genetische basis van CT3176 te identificeren, hebben we een Pan-GWAS-analyse uitgevoerd tussen de CT3176- en niet-CT3176-groepen. We identificeerden 39 genen met bekende functies geassocieerd met CT3176 (P < 0,01 aangepast met Benjamini-Hochberg’s methode) (figuur 2), waaronder virulentiefactoren, genen voor capsulesynthese, antimicrobiële resistentiegenen en multidrug efflux transporters. Onder hen had ampR de grootste associatie met CT3176. We stelden echter vast dat andere CT’s, zoals CT3178 en sommige CT1689-isolaten (AH1689-2 en AH1689-6), ook drager waren van het ampR-gen (figuur 1). Alle isolaten die drager zijn van het ampR-gen behoren tot KL47.

Figuur 2 Pan-GWAS-analyse tussen de CT3176- en niet-CT3176-groepen. Het pangenoom en de associaties werden berekend met Roary en Scoary. Een plotkaart werd gegenereerd met ggplot2.

Proteoomanalyse

Drie ampR+ (AH3176-1, AH3178-1 en AH1689-2) en drie ampR- (AH1689-3, AH1689-4 en AH1689-5) isolaten werden geselecteerd voor proteoomanalyse. In totaal werden in beide groepen 3093 eiwitten geïdentificeerd op basis van 36.727 unieke peptiden. Tenslotte identificeerden we 24 differentieel tot expressie komende eiwitten (DEPs). Daarvan waren er 15 geüpreguleerd, en 9 gedownreguleerd in de ampR+ isolaten in vergelijking met de ampR-isolaten (figuur 3A-C, tabel S2). WcaJ had de hoogste vouwverandering en werd daarom uitgelicht.

Figuur 3 Proteoomanalyse en capsulekleuring. (A) Volcano plot toont de vergelijking van kwantitatieve eiwitexpressie tussen ampR + (AH1689-2, AH3176-1 en AH3178-1) en ampR- (AH1689-3, AH1689-4, en AH1689-5) Klebsiella pneumoniae isolaten. (B, C) Verschillend tot expressie gebrachte eiwitten met een vouwverandering van meer dan 1,2 zijn in kleur gemarkeerd.

Virulentie in diermodellen en kwantificering van Capsule

Met het doel om de rol van ampR in de virulentie van niet-hypermucoviscous CRKP-isolaten te identificeren, selecteerden we drie isolaten (AH3176-1, AH1689-2 en AH1689-3), en testten we de virulentie in een muismodel. AH3176-1 en AH1689-2 waren twee ampR+ isolaten, terwijl AH1689-3 het ampR-isolaat was (Figuur 1). Daarnaast selecteerden we ook twee hypermucoviscous stammen GM2 en GM6 uit onze collectie om de virulentie te testen. Zowel GM2 als GM6 behoren tot KL1, waaronder GM6 ampR-gen draagt en GM2 niet. De ampR-sequentie van de niet-hypermucoviscous KL47-stam verschilde echter van die van de hypermucoviscous KL1-stam, zodat ze in deze studie respectievelijk ampRKL1 en ampRKL47 werden genoemd.

Zoals aangetoond in Figuur 4A, AH3176-1 en AH1689-3:ampRKL47 plus arabinose hadden een overleving van 0% met een inoculum van 1 × 107 kolonievormende eenheden (CFU) op 4 d na infectie, terwijl 20% overleving met AH1689-2, 40% overleving met AH1689-3:ampRKL47 zonder arabinose, 60% overleving met AH1689-3:pBAD33 en ATCC70721, en 80% overleving met AH1698-3 werd waargenomen op 7 d na infectie. Het overlevingspercentage was significant verlaagd na complementatie met het ampRKL47-gen in AH1689-3 (n = 10; P = 0,033, log-rank Mantel-Cox test), wat de belangrijke rol van ampR in virulentie suggereert. Infectie van muizen met AH3176-1 resulteerde in ongeveer 10-100 maal hogere CFU in de longen in vergelijking met andere isolaten (Figuur 4B). De pathologie van de longen vertoonde verschillende gradaties van alveolaire wandverdikking, lymfocyteninfiltratie en intravasculaire bloedingen in de infectiegroep. Onder hen waren de pulmonale pathologische veranderingen veroorzaakt door AH3176-1 het ernstigst, met uitgebreide pulmonale consolidatie en intra-alveolaire bloeding (Figuur 4D-F).

Figuur 4 Virulentiepotentieel van niet-hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae-isolaten in een pulmonaal infectiemodel bij muizen. (A) Het effect van 1 × 107 kolonievormende eenheden (CFU) van AH3176-1, AH1689-2, AH1689-3 en AH1689-3 ampRKL47-complementmutant op de overleving werd beoordeeld. (B) Op 24 uur na infectie (hpi), werden de longen van geïnfecteerde muizen geoogst, en de bacteriële belasting werd bepaald door CFU telling (n = 10; *P < 0,05, **P < 0,01, een-weg ANOVA). Gegevens zijn representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. (C) Uroninezuur productie van verschillende stammen. Een ongepaarde tweezijdige Student’s t-test werd uitgevoerd. Elk gegevenspunt werd driemaal herhaald (n = 3). Gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± s.e.m. *P < 0,05, ns = geen significantie. De longen van muizen zonder infectie (D) of geïnfecteerd met ATCC700721 (E) en AH3176-1 (F) werden verzameld en gekleurd met hematoxyline en eosine. Alle afbeeldingen zijn bij ×40 vergroting. Schaalstaven: 250 μM.

Zoals aangetoond in figuur 5A, was de overlevingskans van muizen geïnfecteerd met GM6 significant lager dan die van GM2 en ATCC700721. Een daling van de overlevingskans werd waargenomen na complementatie van ampRKL1 in GM2. Bovendien was de bacteriële belasting in de longen van muizen besmet met GM6 aanzienlijk hoger dan die van GM2 en ATCC700721 (figuur 5B); HE-kleuring toonde aan dat GM6 infectie uitgebreide consolidatie van de longen en intra alveolaire bloeding veroorzaakte (figuur 5E-G). De overlevingskans werd echter niet beïnvloed als ampRKL47 in GM2 werd ingebracht (figuur 5C).

Figuur 5 Virulentiepotentieel van hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae-isolaten in een pulmonaal infectiemodel in muizen. (A) Het effect van 1 × 106 kolonievormende eenheden (CFU) van GM2, GM6 en GM2 ampRKL1-complementmutant op de overleving werd beoordeeld (n = 10; *P < 0,05, **P < 0,01, log-rank Mantel-Cox test),). (B) Op 24 uur na infectie (hpi), werden de longen van geïnfecteerde muizen geoogst, en de bacteriële belasting werd bepaald door CFU telling (n = 10; **P < 0,01, one-way ANOVA). Gegevens zijn representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. (C) Het effect van 1 × 106 CFU van GM2 en GM2 ampRKL47 complement mutant op de overleving werd beoordeeld. (D) Uroninezuurproductie van verschillende stammen. Er werd een ongepaarde tweezijdige Student’s t-test uitgevoerd. Elk gegevenspunt werd driemaal herhaald (n = 3). Gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± s.e.m. *P < 0,05, ns = geen significantie. De longen van muizen zonder infectie (E) of geïnfecteerd met GM2 (F) en GM6 (G) werden verzameld en gekleurd met hematoxyline en eosine. Alle beelden zijn bij × 40 vergroting. Schaalstaven: 250 μM.

Omdat de capsule de belangrijkste virulentiefactor van K. pneumonia is en WcaJ, die volgens de proteoomanalyse de eerste stap van de capsule synthese reguleert, onderzochten we de hoeveelheden capsulaire polysaccharideproductie. Het resultaat toonde aan dat de ampR-complementaire stammen AH1689-3:ampRKL47 en GM2:ampRKL1 plus arabinose aanzienlijk meer capsulepolysacharide (urinezuur) produceerden dan AH1689-3 en GM2, respectievelijk (figuur 4C, figuur 5D).

Discussie

MLST is de meest gebruikte techniek voor het definiëren van K. pneumoniae-populaties geweest. Met snelle en betaalbare WGS is het mogelijk om hele genomen te vergelijken voor isolaattypering in plaats van slechts een paar loci, zoals in traditionele MLST. Genotypering met cgMLST maakt gebruik van duizenden allelen in het genoom, wat resulteert in een hoger niveau van isolaatdiscriminatie. In deze studie gebruikten we cgMLST om 135 klinische CRKP-isolaten te classificeren en vonden we verschillen tussen CT-types op basis van klinische informatie. Door het beperkte aantal gevallen konden we geen associatie verkrijgen tussen CT-types en klinische uitkomst. De verschillen in sterftecijfers stelden ons echter in staat de isolaten die tot CT3176 behoorden verder te onderzoeken. GWAS analyse toonde aan dat het ampR gen significant geassocieerd was met de CT3176 isolaten.

Vorige studies hebben aangetoond dat de AmpC β-lactamase regulator AmpR, een lid van de LysR familie van transcriptiefactoren, ook meerdere virulentiemechanismen in Pseudomonas aeruginosa controleert.29,30 Tot op heden heeft slechts één artikel de rol van AmpR in het reguleren van de virulentie van K. pneumoniae gerapporteerd. Een klonaal isolaat van K. pneumoniae toonde aan dat weinig bekende virulentiegenen verantwoordelijk waren voor ernstige infecties. AmpR in deze isolaten was betrokken bij de upregulatie van capsulesynthese, gemoduleerde biofilmvorming en type 3 fimbriële genexpressie, evenals kolonisatie van het muriene maagdarmkanaal.31 Het virulentieniveau van deze isolaten blijft echter onduidelijk door het gebrek aan gegevens over dodelijke infectiemodellen. In deze studie hebben we een longontstekingsmodel gebruikt om de verhoogde virulentie van deze ampR-dragende isolaten te bevestigen. Dit zou verklaren waarom patiënten geïnfecteerd met deze isolaten een hoog sterftecijfer hadden.

Voorheen was het gebruikelijk dat ST11-type K. pneumoniae resistent was tegen carbapenems maar niet hypervirulent. In 2017 werd echter een uitbraak gemeld van ziekenhuisinfecties veroorzaakt door ST11 carbapenem-resistente hypervirulente K. pneumoniae-isolaten. Het hypervirulentiefenotype van deze isolaten was te wijten aan de verwerving van een ongeveer 170 kbp pLVPK-achtig virulentieplasmide door klassieke CRKP-isolaten die behoren tot ST11 en serotype K47.15 In tegenstelling tot het bovenstaande rapport werden in deze studie geen virulentieplasmiden gevonden in ST11 CRKP-isolaten met verhoogde virulentie, wat suggereert dat de virulentieverhoging niet het gevolg was van het klassieke mechanisme.32 In tegenstelling tot het virulentieplasmide, dat meerdere virulentiefactoren bevat, kan AmpR de virulentie onafhankelijk verhogen. Dit werd bevestigd door virulentietests van de ampR-complementstam.

WcaJ is het enzym dat de synthese van colaanzuur initieert en de eerste suiker (glucose-1-P) op de lipidedrager undecaprenylfosfaat laadt. De potentiële rol van WcaJ in de virulentie van K. pneumoniae werd onlangs bepaald.33 De resultaten van proteoomanalyse suggereren dat AmpR de virulentie van K. pneumoniae verhoogt door de initiële stap van de capsule synthese te reguleren. Als regulator moet AmpR zich binden aan de genpromotor om zijn regulerende rol te kunnen uitoefenen. Tot op heden zijn er vele kapsel-types geïdentificeerd in K. pneumoniae,34 en de afwezigheid van AmpR-bindingsplaatsen in sommige kapsel-types kan verklaren waarom de virulentie van KL1-isolaten niet kan worden versterkt door de AmpR die gevonden wordt in KL47-isolaten.

Nieuw bewijs heeft gesuggereerd dat hypermucoviscositeit en hypervirulentie verschillende fenotypes zijn die niet synoniem moeten worden gebruikt. Bovendien is het belangrijk om vast te stellen dat een negatieve stringtest onvoldoende is om te bepalen of een isolaat hypervirulent is.35 Een belangrijke bevinding van ons werk was dat we niet-hypermucoviscous ST11 CRKP-subkloon met verhoogde virulentie identificeerden.

De belangrijkste beperking van deze studie is dat er slechts een klein aantal gevallen is; daarom kunnen we de relatie tussen de klinische resultaten en niet-hypermucoviscous hypervirulente CRKP-infectie niet bestuderen. We waren ook niet in staat om ampR knock-out stam te construeren, en dit kan worden verklaard door genomische analyse bleek dat ampR putatively werd gevestigd op plasmide (Figuur S3). Aangezien stammen met het niet-hypermucoviscus fenotype in de kliniek nauwelijks worden onderscheiden, zijn voortdurende surveillance en onderzoek van deze nieuwe stammen dringend noodzakelijk.