Antiastmatische effecten van Sanglong Pingchuan Decoction door het induceren van een gebalanceerde Th1/Th2 immuunrespons
- Abstract
- 1. Inleiding
- 2. Materialen en Methoden
- 2.1. Plantaardige materialen en reagentia
- 2.2. Bereiding van SLPCD
- 2.3. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)-analyse van SLPCD
- 2.4. Experimentele dieren
- 2.5. Sensibilisatie, Challenge, en Behandeling van Muizen
- 2.6. Longhistopathologie Long Histopathology De longweefsels werden 24 uur na de laatste toediening verzameld en vervolgens gefixeerd met 4% paraformaldehyde, ingebed in paraffine, en op 5 μm dikte doorgesneden. Een reeks microsecties werd gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E) voor histologische beoordeling. 2.7. Bronchoalveolar Lavage Fluid (BALF) Collection and Flow Cytometry
- 2.8. Meting van het totale IgE-antilichaam in serum
- 2.9. Meting van Cytokines in BALF
- 2.10. Kwantitatieve Real-Time PCR (qRT-PCR)
- 2.11. Statistische analyse
- 3. Resultaten
- 3.1. HPLC-profiel van SLPCD
- 3.2. SLPCD verminderde de luchtwegontsteking bij astmatische muizen
- 3.3. SLPCD verminderde de hoeveelheid ontstekingscellen in de BALF van astmatische muizen
- 3.4. SLPCD verlaagde het serum totaal IgE-niveau van astmatische muizen
- 3.5. SLPCD Moduleerde de niveaus van Cytokines in BALF van Astmatische muizen
- 3.6. SLPCD reguleerde de mRNA expressieniveaus van cytokines in longweefsels van astmatische muizen
- 4. Discussie
- Disclosure
- Conflicts of Interest
- Authors’ Contributions
- Acknowledgments
Abstract
Doelstelling. Het onderzoeken van de antiastmatische effecten van Sanglong pingchuan afkooksel (SLPCD) en het onderzoeken van de werkingsmechanismen. Methoden. Het serum, bronchoalveolaire lavage vloeistof (BALF), en longweefsel van OVA-geïnduceerde allergische astma muizen werden verzameld 24 uur na de laatste toediening. Longpathologische veranderingen werden waargenomen door H&E kleuring. De ontstekingscellen in BALF werden geteld door middel van flowcytometrie. De niveaus van totaal IgE in serum en cytokinen in BALF werden bepaald door ELISA. De expressieniveaus van cytokine-mRNA in de longen werden bepaald met qRT-PCR. Resultaten. SLPCD remde luchtwegontsteking aanzienlijk, verminderde ontstekingscellen in BALF, verminderde de niveaus van totaal IgE in serum en Th2 cytokines (IL-10 en IL-13) in BALF, en verlaagde de mRNA expressie niveaus van Th2 cytokines (IL-4, IL-5, IL-10, en IL-13) in de longen van astmatische muizen. SLPCD verhoogde echter opmerkelijk het niveau van het Th1 cytokine IFN-γ in BALF en verhoogde het mRNA expressieniveau van Th1 cytokines (IL-2 en IFN-γ) in de longen van astmatische muizen. Conclusie. SLPCD kon de luchtwegontsteking verminderen en de pathogenese in astma muizen verlichten door het induceren van een gebalanceerde Th1/Th2 respons en zou kunnen fungeren als een effectief geneesmiddel voor de behandeling van astma.
1. Inleiding
Astma is een complexe, chronische aandoening van de luchtwegen die wordt gekenmerkt door bronchiale hyperresponsiviteit, luchtwegontsteking en -remodellering, luchtstroomobstructie, en infiltratie van verschillende soorten ontstekingscellen geïnduceerd door cytokinen en andere mediatoren . Astma wordt veroorzaakt door omgevingsfactoren zoals allergenen, virussen en beroepsmatige blootstelling bij personen met een genetische predispositie; de definitieve oorzaak is echter onduidelijk. De incidentie van astma is wereldwijd aanzienlijk toegenomen, vooral bij jonge kinderen, en is een van de meest voorkomende aandoeningen van de luchtwegen geworden. Geschat wordt dat 300 miljoen mensen in verschillende landen aan astma lijden.
Momenteel zijn corticosteroïden de meest effectieve geneesmiddelen voor de behandeling van astma. Hoewel deze geneesmiddelen de astmasymptomen kunnen verbeteren, genezen zij deze ziekte niet. Deze middelen hebben ook ernstige bijwerkingen, vooral bij kinderen, met inbegrip van onderdrukking van het immuunsysteem, secundaire infecties, spieratrofie, osteopenie, osteoporose, cataract en glaucoom . Daarom is de voortdurende zoektocht naar nieuwe, veilige en effectieve geneesmiddelen van het grootste belang.
Vele traditionele Chinese geneesmiddelen worden al eeuwenlang gebruikt bij de behandeling van astma en worden nog steeds op grote schaal gebruikt in Aziatische landen . Onlangs zijn de werkingsmechanismen van talrijke kruidenformules voor de behandeling van allergische astma gerapporteerd. Verschillende plant-afgeleide natuurlijke producten met anti-inflammatoire eigenschappen zijn ook gescreend voor mogelijke toepassing bij de behandeling van astma .
Sanglong pingchuan afkooksel (SLPCD) is een ziekenhuispreparaat voorgeschreven door professor Qing Chang, een nationale veteraan arts van traditionele Chinese geneeskunde geërfde studio mentor, in Shaoxing Ziekenhuis van Traditionele Chinese Geneeskunde. SLPCD is afgeleid van Shegan Mahuang Tang door optelling en aftrekking. Shegan Mahuang Tang is een bekend traditioneel Chinees receptgeneesmiddel dat voor het eerst werd vermeld in Jin Kui Yao Lve. Als de representatieve formulering van het verdrijven van koude, het verlichten van het uitwendige syndroom, het opwarmen van de longen, het elimineren van slijm, en het verlichten van astma, wordt Shegan Mahuang Tang veel gebruikt voor de behandeling van astma, bronchitis bij kinderen, bronchiale astma, longontsteking, oudere acute en chronische bronchitis, emfyseem, en allergische rhinitis . De formule van SLPCD bestond uit dertien traditionele Chinese geneesmiddelen die in tabel 1 zijn vermeld. Een gerandomiseerd onderzoek toonde aan dat SLPCD effectief is bij de behandeling van astma, vooral bij het verminderen van het exacerbatiecijfer. De werkzaamheid van SLPCD is echter niet door gecontroleerde experimenten aangetoond.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
De plantennaam is gecontroleerd met http://www.theplantlist.org met vermelding van de gegevens van toegang tot die website.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
In de huidige studie, om een experimentele basis te leggen voor de klinische toepassing van SLPCD bij de behandeling van astma en om de werkingsmechanismen te onderzoeken, met behulp van OVA-geïnduceerd allergisch astma muismodel, werden de ontstekingsremmende effecten van SLPCD onderzocht door histologisch onderzoek, telling van immuuncellen in bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF), kwantificering van totaal IgE in serum, cytokine in BALF, en de mRNA-expressie van cytokine in longweefsels.
2. Materialen en Methoden
2.1. Plantaardige materialen en reagentia
Cortex Mori (partijnummer: 140901), Pheretima Aspergillum (partijnummer: 150406), met honing verwerkte Herba Ephedrae (partijnummer: 150302), Rhizoma Belamcandae (partijnummer: 141213), Semen Armeniacae Amarum (partijnummer: 150312), roergebakken Fructus Perillae (partijnummer: 150115), Scorpio (partijnummer: 150126), Semen Descurainiae (partijnummer: 150208), met honing gebakken Flos Farfarae (partijnummer: 150301), Herba Houttyniae (partijnummer: 150327), Rhizoma Fagopyri Dibotrydis (partijnummer: 150308), Radix Angelicae Sinensis (partijnummer: 150213), en Radix et Rhizoma Glycyrrhizae (chargenummer: 140917) werden aangekocht in het ziekenhuis voor Chinese geneeskunde van Shaoxing en werden geauthenticeerd door professor Yonghai Jiang van het instituut voor levensmiddelen- en geneesmiddelencontrole van Shaoxing, Zhejiang, China. De standaards van chlorogeenzuur en rutine werden gekocht bij het Zhejiang Institute for Food and Drug Control, Hangzhou, China, en de zuiverheid van beide verbindingen was meer dan 98%.
Ovalbumine (OVA) werd gekocht bij Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA; muis IL-10, IL-13, en IFN-γ opsporende ELISA kits werden gekocht bij Wuhan Boster Biological Technology Co. Ltd., Hubei, China; muis IgE ELISA kit was van RayBiotech Inc., Norcross, GA, USA, foetaal kalfsserum (FCS) was van Gibco, Grand Island, NY, USA. De gezuiverde anti-muis CD16/CD32 (Fc Receptor block), Ly-6G-FITC (kloon: RB6-8C5), F4/80 antigeen PE-Cy5 (kloon: BM8), Ly-6C-APC (kloon HK1.4), Fc epsilon Receptor 1 alpha (FceR1)-APC (kloon: MAR-1), CD117 (c-Kit)-PE-Cy5 (c-Kit, kloon: 2B8), en siglec-F-PE (kloon: E50-2440) antilichamen werden aangekocht bij eBioscience, Inc, San Diego, CA, VS. Trizol-reagens werd gekocht bij Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; revert Aid™ M-MLV reverse transcriptase was van Fermentas, Amherst, NY, USA; ribonuclease inhibitor en oligo(dT)18 waren van Sangon Biotech (Shanghai) Co, Ltd, China; FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) was van Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA. Aluminiumhydroxide gel (Alum) werd gekocht van China Animal Husbandry Industry Co, Ltd, Beijing, China; dexamethason (Dex) was van Hubei Tianyao Pharmaceutical Co, Ltd, Xiangyang, China.
2.2. Bereiding van SLPCD
De op recept verkrijgbare geneesmiddelen van SLPCD (440 g) werden gedurende 30 min. in 8 aliquots gedestilleerd water gemacereerd en vervolgens gedurende 1 uur in water gekookt. Na het eerste afkooksel werden de bezinksels nog eens gedurende 30 min. in 6 aliquots gedestilleerd water gekookt. Het supernatant van het tweemaal afkooksel werd door een steriel gaasje gefiltreerd en geconcentreerd met een rotavapor (Buchi, Zwitserland) onder verminderde druk bij 65°C tot een eindconcentratie van 1,1 g ruw geneesmiddel/ml. Het geconcentreerde afkooksel werd opgeslagen bij -20°C en vervolgens met gedestilleerd water verdund tot verschillende concentraties vóór gebruik.
2.3. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)-analyse van SLPCD
HPLC-analyse werd uitgevoerd met een Diamon C18-kolom (250 mm × 5 mm, 5 μm) en Waters 2996 PDA-detector op het Water 600E HPLC-instrument. De mobiele fase was een mengsel van acetonitril (A) en 0,1% fosforzuur (B). Een lineaire gradiëntelutie werd als volgt uitgevoerd: 0-8 min bij 2% A, 8-35 min bij 6% A, 35-40 min bij 8% A, 40-45 min bij 13% A, 45-70 min bij 14% A, 70-80 min bij 17% A, en 80-90 min bij 17-2% A. De stroomsnelheid was 1 ml/min en het injectievolume was 10 μl. De temperatuur van de kolom werd constant op 30 °C gehouden. De HPLC-analyse van de standaarden (chlorogeenzuur en rutine) en de monsters werd uitgevoerd onder de vastgestelde experimentele omstandigheden zoals hierboven vermeld.
2.4. Experimentele dieren
Vrouwelijke BALB/c muizen van 5 weken oud werden aangekocht bij het Shanghai Experimental Animal Center van de Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China (certificaatnr. SCXK 2007-0005). De muizen werden gedurende 1 week voor gebruik geacclimatiseerd. Knaagdieren laboratorium chow en leidingwater werden ad libitum verstrekt en onderhouden onder gecontroleerde omstandigheden met een temperatuur van 24 ± 1 ° C, vochtigheid van 50 ± 10%, en een 12/12-h licht-donker cyclus. Alle procedures waren strikt in overeenstemming met de Chinese wetgeving inzake het gebruik en de verzorging van proefdieren en met de richtlijnen van het Institute for Experimental Animals van de Zhejiang University en werden goedgekeurd door het universitair comité voor dierproeven.
2.5. Sensibilisatie, Challenge, en Behandeling van Muizen
Vrouwelijke BALB/c muizen werden verdeeld in zes groepen: normale controlegroep (NC), model controlegroep (MC), positieve controlegroep (behandeld met Dex, 2 mg/kg), en SLPCD groepen (5,5, 11, en 22 g/kg). Elke groep bestond uit tien muizen. De luchtwegontsteking bij de muis werd geïnduceerd door OVA. De dieren werden geïmmuniseerd door intraperitoneale injectie van een oplossing die 50 μg OVA en 200 μg aluminiumhydroxide bevatte gedurende 3 dagen. Een boosting sensibilisatie werd gegeven op dag 14. Een week na de laatste sensibilisatie werden de muizen blootgesteld aan verneveld 2% OVA met behulp van PARI TurboBOY N (1205) vernevelaar (PARI GmbH, Duitsland) gedurende 1 uur per dag gedurende 8 dagen. Vier dagen voordat ze werden uitgedaagd, kregen de gesensibiliseerde muizen oraal SLPCD toegediend in doses van 5,5, 11 en 22 g/kg of werden ze intraperitoneaal geïnjecteerd met 2 mg/kg dexamethason (Dex), elke dag gedurende 12 dagen. Model controlegroepen kregen dezelfde hoeveelheid zoutoplossing. Het dosisvolume was 0,2 ml/10g lichaamsgewicht. Tien muizen als normale controlegroep werden alleen gesensibiliseerd en uitgedaagd met een zoutoplossing. De procedures die werden toegepast voor OVA-sensibilisatie en -uitdagingen, evenals de behandeling met SLPCD, werden getoond in Figuur 1.
2.6. Longhistopathologie
Long Histopathology
De longweefsels werden 24 uur na de laatste toediening verzameld en vervolgens gefixeerd met 4% paraformaldehyde, ingebed in paraffine, en op 5 μm dikte doorgesneden. Een reeks microsecties werd gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E) voor histologische beoordeling.
2.7. Bronchoalveolar Lavage Fluid (BALF) Collection and Flow Cytometry
BALF werd verzameld door spoeling van de longen met fosfaat gebufferde oplossing (PBS) toegediend via een endotracheale katheter 24 uur na de laatste toediening. BALF werd gedurende 5 min. gecentrifugeerd en de cellen werden gewassen met ijskoud PBS dat 2% FCS bevatte. De cellen werden geblokkeerd met 0,5 μg gezuiverd anti-muis CD16/CD32 (FcR-blok) antilichaam gedurende 10 min op ijs om niet-specifieke kleuring te remmen en vervolgens gekleurd met de combinatie van anti-muis Ly-6G-FITC, F4/80 antigeen-PE-Cy5 en Ly-6C-APC, of FceR1-APC, CD117-FITC en Siglec-F-PE antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 30 min in het donker. De gekleurde cellen werden gewassen met ijskoud PBS en geresuspendeerd in PBS. Honderdduizend levensvatbare cellen per behandeling werden geanalyseerd met een BD FACScan flowcytometer met gebruikmaking van CellQuest software.
2.8. Meting van het totale IgE-antilichaam in serum
Het serum werd 24 uur na de laatste toediening verzameld. Het totaal IgE antilichaam werd gedetecteerd in individuele serummonsters met de RayBio® muis IgE ELISA kit. De 1:1250 verdunde serummonsters of de IgE-standaard werden toegevoegd aan 96-wells-platen die gecoat waren met een specifiek anti-muis IgE-antilichaam. De platen werden gedurende 2,5 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd en vervolgens viermaal gewassen. Het detecterende antilichaam werd aan elk putje toegevoegd. De platen werden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd vóór toevoeging van mierikswortelperoxidase-geconjugeerd ABC. Na incubatie gedurende 45 min. werden de platen gewassen en gedurende 30 min. bij kamertemperatuur ontwikkeld met TMB. De reactie werd gestopt door toevoeging van 20 μl stopoplossing. De absorptie werd gemeten op een ELISA-afleesapparaat (BIO-RAD 680) bij 450 nm.
2.9. Meting van Cytokines in BALF
De concentraties van Th2 (IL-4, IL-5, IL-10, en IL-13) en Th1 (IFN-γ en IL-2) cytokines in BALF werden gedetecteerd met behulp van commerciële ELISA-kits zoals eerder .
2.10. Kwantitatieve Real-Time PCR (qRT-PCR)
De mRNA expressieniveaus van Th2 (IL-4, IL-5, IL-10, en IL-13) en Th1 (IFN-γ en IL-2) cytokines in longweefsels werden bepaald met behulp van qRT-PCR. Het totale RNA werd geïsoleerd uit gehomogeniseerd longweefsel met behulp van het Trizol-reagens volgens het protocol van de fabrikant, en omgekeerde transcriptie werd uitgevoerd zoals eerder . Vervolgens werd amplificatie uitgevoerd in 20 pi reactie met behulp van FastStart Universal SYBR Green Master. Real-time PCR werd uitgevoerd met behulp van een ABI 7400 Real-Time PCR-systeem. Primers voor qRT-PCR werden gesynthetiseerd door Sangon Biotech (Shanghai) Co, Ltd., China. (China), en de sequenties werden vermeld in tabel 2. De qPCR-cyclus werd als volgt uitgevoerd: aanvankelijke denaturatie bij 95°C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 95°C gedurende 10 s, annealing bij 60°C gedurende 1 min. GAPDH werd gebruikt als endogene controle. De efficiëntie en specificiteit van de amplificatie van de primers werden voor elke set primers geverifieerd. De expressieniveaus van de geteste genen ten opzichte van GAPDH werden bepaald volgens de methode en als voudige inductie .
Gen
Primersequentie
Productgrootte (bp)
GAPDH
5′-AGCCTCGTCCCGTAGACAA-3′
104
5′-AATCTCCACTTTGCCACTGC-3′
IL-2
5′-CCCAAGCAGGCCACAGAATTGAAA-3′
81
5′-AGTCAAATCCAGAACATGCCGCAG-3′
IFN-γ
5′- TCTTGAAAGACAATCAGGCCATCA -3′
233
5′- GAATCAGCAGCGACTCCTTTTCC -3′
IL-4
5′-CAAACGTCCTCACAGCAACG-3′
203
5′-CTTGGACTCATTCATGGTGC-3′
IL-5
5′- GCTGGCCTCAAACTGGTAATGTA -.3′
100
5′- GGCAATGGTGCATGTCTGTAACCTC -3′
IL-10
5′- GCTCTTACTGACTGGCATGAG -.3′
105
5′- CGCAGCTAGGAGCATGTG -3′
IL-13
5′- GCTTGCCTTGGTGCTCGCC -.3′
175
5′- GGGCTACACAGAACCCGCCA -3′
Tabel 2
Primer-sequenties gebruikt voor qRT-PCR.
2.11. Statistische analyse
De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking (SD) en onderzocht op hun statistische significantie van verschil met ANOVA en een Tukey post hoc test. -waarden van minder dan 0,05 werden als statistisch significant beschouwd.
3. Resultaten
3.1. HPLC-profiel van SLPCD
Het gehalte aan chlorogeenzuur en rutine in SLPCD werd geanalyseerd met behulp van HPLC. In vergelijking met standaardreferentieverbindingen werden chlorogeenzuur en rutine geïdentificeerd en bepaald (figuur 2). De regressievergelijkingen van de kalibratiecurve van de standaarden waren A = 3719,7C – 102166 (R2=0,9999) en A = 9137,3C – 408038 (R2=0,9996) voor respectievelijk chlorogeenzuur en rutine. De concentraties chlorogeenzuur en rutine in SLPCD bedroegen respectievelijk 1,4 mg/g en 0,15 mg/g.
(a)
(b)
(a)
(b)
Figuur 2
HPLC-chromatogrammen van SLPCD. Representatieve chromatogrammen van standaard referentieverbindingen (a) en SLPCD (b) werden getoond. ① Chlorogeenzuur en ② rutine.
3.2. SLPCD verminderde de luchtwegontsteking bij astmatische muizen
Het effect van SLPCD op de longontsteking bij door OVA veroorzaakte astmatische muizen werd waargenomen via H&E kleuring, en de resultaten werden getoond in figuur 3. De astma model muizen vertoonden meer ernstige interstitiële, peribronchiolaire, en perivasculaire inflammatoire cel infiltratie in de long in vergelijking met normale controle muizen. Als een positieve controle, Dex aanzienlijk verlicht de infiltratie van long interstitiële, peribronchiolar, en perivasculaire inflammatoire cellen in astma muizen. De ontstekingsinfiltraten in de longen van de muizen met OVA-challenge werden ook aanzienlijk verzwakt door SLPCD in vergelijking met de modelcontrole.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
Figuur 3
Effecten van SLPCD-behandeling op histopathologische veranderingen in de longen. De longsecties werden gekleurd met hematoxyline en eosine. De getoonde lichtfotomicrofoto’s waren representatief voor longsecties van tien muizen per groep. (a) Normale controle (NC); (b) model controle (MC); (c) dexamethason (Dex, positieve controle); (d) SLPCD (5,5 g/kg); (e) SLPCD (11 g/kg); en (f) SLPCD (11 g/kg).
3.3. SLPCD verminderde de hoeveelheid ontstekingscellen in de BALF van astmatische muizen
Om de effecten van SLPCD op de infiltratie van ontstekingscellen in de long van door OVA geïnduceerde astmatische muizen vast te stellen, werd de telling van de ontstekingscellen met inbegrip van eosinofielen (Sigilec F+), basofielen (CD117+), neutrofielen (Ly-6C+y-6), macrofagen (F4/), monocyten (Ly6G-Ly6C+), en mestcellen (FcER1+) in BALF uitgevoerd door flowcytometrie. Zoals getoond in figuur 4, de aantallen eosinofielen (1756-voudig), macrofagen (114-voudig), neutrofielen (110-voudig), basofielen (91.7-voudig), monocyten (45.8-voudig), en mestcellen (6.9-voudig) in de BALF van astmatische muizen waren duidelijk verhoogd in vergelijking met normale controle muizen. Dex verminderde de aantallen van een verscheidenheid aan geteste ontstekingscellen in de BALF van astmatische muizen aanzienlijk (), en kwam bijna overeen met de niveaus van normale muizen. De aantallen van deze ontstekingscellen in BALF van astmatische muizen werden significant dosisafhankelijk verminderd door SLPCD in vergelijking met de model controlegroep (, , of ).
Figuur 4
Effect van SLPCD op de rekrutering van ontstekingscellen in BALF in OVA-geïnduceerde astma muizen. De BALF werd verzameld 24 uur na de laatste toediening en celsamenstelling werd geanalyseerd door FACS beschreven in de tekst. De waarden worden gepresenteerd als gemiddelden ± SD (). Significante verschillen ten opzichte van astmatisch model controlegroep (MC) worden aangeduid als , , en . Dex: dexamethason (positieve controle), NC: normale controlegroep.
3.4. SLPCD verlaagde het serum totaal IgE-niveau van astmatische muizen
De effecten van SLPCD op het serum totaal IgE-niveau bij astmatische muizen werden getoond in Figuur 5. De totale IgE-antistofspiegels in het serum van astmatische muizen waren aanzienlijk hoger dan die van normale controlemuizen (). Als een positief geneesmiddel, Dex aanzienlijk verlaagd het serum totaal IgE-antilichaam niveaus in OVA-geïnduceerde astmatische muizen (). De totale IgE-antistofniveaus in het serum van de astmatische muizen werden aanzienlijk dosisafhankelijk verlaagd door SLPCD in vergelijking met de modelcontrolegroep ().
Figuur 5
Effecten van SLPCD op de niveaus van totaal IgE in serum van OVA-geïnduceerde astmatische muizen. Het serum werd 24 uur na de laatste toediening verzameld en de niveaus van totaal IgE werden gemeten met behulp van ELISA-kits die in de tekst worden beschreven. De waarden worden gepresenteerd als gemiddelden ± SD (). Significante verschillen ten opzichte van de astmatische model controlegroep (MC) worden aangeduid als . Dex: dexamethason (positieve controle) en NC: normale controlegroep.
3.5. SLPCD Moduleerde de niveaus van Cytokines in BALF van Astmatische muizen
De niveaus van Th2 (IL-4, IL-5, IL-10, en IL-13) en Th1 (IFN-γ en IL-2) cytokines in BALF werden gemeten door ELISA. Zoals blijkt uit figuur 6, OVA uitdaging leidde tot de significante toename van het niveau van IL-10 en IL-13 en daling van die van IFN-γ in de BALF van de astmatische muizen in vergelijking met de normale controlegroep ( of ). Het gehalte aan IL-4, IL-5 en IL-2 in de BALF van de model-controlemuizen bleek echter zeer laag te zijn en dicht bij de detectiegrens te liggen. De toediening van SLPCD in drie doses en Dex verminderde de gehalten aan IL-13 en IL-10 aanzienlijk, en verhoogde die van IFN-γ in BALF van OVA-geïnduceerde astmatische muizen opmerkelijk in vergelijking met model-controlemuizen ( of ) (figuur 6).
Figuur 6
Effecten van SLPCD op de niveaus van cytokinen in BALF in OVA-geïnduceerde astma muizen. De BALF werd 24 uur na de laatste toediening verzameld. De niveaus van Th1 (IL-10 en IL-13) en Th1 (IFN-γ) cytokines in BALF werden gemeten met ELISA kits beschreven in de tekst. De waarden worden gepresenteerd als gemiddelden ± SD (). Significante verschillen ten opzichte van de astmatische model controlegroep (MC) worden aangeduid als en . Dex: dexamethason (positieve controle) en NC: normale controlegroep.
3.6. SLPCD reguleerde de mRNA expressieniveaus van cytokines in longweefsels van astmatische muizen
De effecten van SLPCD op de mRNA expressie van Th1 en Th2-type cytokines in longweefsels van door OVA geïnduceerde astmatische muizen werden gedetecteerd met behulp van qRT-PCR, en de resultaten werden getoond in Tabel 3. In vergelijking met de normale controle muizen, werden de expressieniveaus van Th2 cytokine mRNAs (IL-4, IL-5, IL-10, en IL-13) duidelijk verhoogd en die van Th1 cytokine mRNAs (IL-2 en IFN-γ) werden aanzienlijk verlaagd in longweefsels van astmatische muizen (P < 0,001). De toediening van SLPCD in drie doses en Dex resulteerde in significante downregulatie van de mRNA expressieniveaus van Th2 cytokines IL-4, IL-5, IL-10, en IL-13 en upregulatie van die van Th1 cytokines IL-2 en IFN-γ in longweefsels van astmatische muizen in vergelijking met de astmatische modelgroepen (P < 0.05, P < 0.01, of P < 0.001).
Groep
Dosis
IL-4
IL-5
IL-10
IL-13
IL-2
IFN-γ
NC
–
1.00±0.14
1.00±0.23
1.00±0.19
1.00±0.31
1.00±0.19
1.00±0.13
MC
–
38.91±2.96
5.22±0.64
7.49±0.23
142.3±14.6
0.73±0.13
0.59±0.15
CTX (mg/kg)
50
19,08±2,62
2,56±0,42
5,07±0.67
44.00±7.74
1.20±0.20
2.14±0.34
SLPCD (g/kg)
5.5
21.70±4.64
4.06±0.38
6.68±0.68
71.26±10.62
1.28±0.20
1.12±0.20
11
21.30±3.71
3.74±0.37
6.21±0.44
65.4±11.99
1.33±0.26
1.53±0.21
22
23.09±3.27
3.07±0.34
6.03±0.65
61.51±8.77
1.49±0.34
1.71±0.23
De longweefsels werden 24 uur na de laatste toediening verzameld en de mRNA expressieniveaus van GAPDH en cytokinen werden gedetecteerd door qRT-PCR met behulp van specifieke primers. Het housekeeping gen GAPDH werd gebruikt als endogene controle. De waarden worden gepresenteerd als gemiddelden ± SD (). Significante verschillen ten opzichte van de astmatische model controlegroep (MC) worden aangeduid als , , en . Dex: dexamethason (positieve controle) en NC: normale controlegroep.
Tabel 3
Effect van SLPCD op de mRNA expressieniveaus van cytokines in longweefsels van door OVA geïnduceerde astmatische muizen.
4. Discussie
Astma is wereldwijd een volksgezondheidsprobleem geworden, vooral in de ontwikkelde landen . Glucocorticoïden zijn de eerstelijnstherapie voor de behandeling en controle van astma. Hoewel deze geneesmiddelen astmasymptomen konden verbeteren, werden zij strikt gecontroleerd voor aanhoudend gebruik wegens hun ernstige bijwerkingen . Nieuwe astmatherapeutische benaderingen zijn dus noodzakelijk. Veel traditionele Chinese geneesmiddelen vertonen verschillende biologische activiteiten, waaronder antibacteriële, schimmelwerende, ontstekingsremmende, anti-anafylaxie en immunomodulerende effecten, die potentieel hebben voor de behandeling van astma. Er zijn verschillende modellen van allergische bronchopulmonale ontsteking bij experimentele muizen beschreven. Het OVA-geïnduceerde allergische astma muismodel bootst veel kenmerken van menselijke astma na, en heeft een grote acceptatie verworven. Daarom onderzochten we de antiastmatische effecten van SLPCD en onderzochten we de moleculaire mechanismen met behulp van dit model.
SLPCD bestaat uit 13 traditionele Chinese geneesmiddelen. Cortex Mori, Pheretima Aspergillum, en Herba Ephedrae zijn de primaire bestanddelen die de longen dispergeren en astma verlichten. Sperma Armeniacae Amarum, roergebakken Fructus Perillae, Sperma Descurainiae, en met honing gebakken Flos Farfarae zijn aanvullende bestanddelen die slijm verminderen, hoest en astma verlichten. Tot de hulpbestanddelen behoren Rhizoma Belamcandae, Herba Houttyniae, en Rhizoma Fagopyri Dibotrydis die het hittekwaad opruimen en oppervlakkige kwaden verdrijven, alsmede Scorpio en Radix Angelicae Sinensis die bloedstuwing verdrijven, collateraal baggeren, spasmolyse en astma stoppen. Radix et Rhizoma Glycyrrhizae harmoniseert alle geneesmiddelen. Samen vullen alle componenten elkaar aan om de resultaten te bereiken van het verspreiden van de longen, het laten afdalen van Qi, en het verlichten van hoest en astma. De kwaliteitscontrole van SLPCD gebruikt in deze studie werd uitgevoerd met behulp van HPLC, en twee referentie chemicaliën (chlorogeenzuur en rutine) werden geïdentificeerd als belangrijke index componenten (figuur 2).
Allergische astma wordt gedefinieerd als een luchtweg acute-on-chronische ontstekingsziekte met karakteristieke eosinofiele rekrutering, hyperplasie van gobletcellen, slijm hypersecretie, collageenafzetting, gladde spiercel hypertrofie, en subepitheliale fibrose . In deze studie werden de effecten van SLPCD behandeling op longontsteking in OVA-geëxalciteerde astmatische muizen beoordeeld via H&E kleuring. De typische allergische ophoping en infiltratie van ontstekingscellen werden waargenomen in longweefsels van astmatische modelmuizen. De behandeling met SLPCD verminderde de ontstekingsinfiltraten in de longweefsels van astmatische muizen (Figuur 3), wat suggereert dat SLPCD de luchtwegontsteking aanzienlijk verminderde.
De ontstekingsimmuuncellen spelen een sleutelrol in de pathogenese en de ernst van astma. De ontstekingscellen die vanuit regionale lymfeklieren naar de luchtwegen worden gerekruteerd, kunnen cytokines en chemokines afscheiden, wat resulteert in hyperreactiviteit van de luchtwegen. Het verminderen van de ontstekingscellen in de luchtwegen is een effectieve manier om astma te behandelen. Om te bevestigen dat SLPCD de infiltratie van ontstekingscellen kan remmen, telden we verder eosinofielen, macrofagen, neutrofielen, basofielen, monocyten, en mestcellen in BALF. OVA inhalatie leidde tot significante toenames in de tellingen van deze zes soorten ontstekingscellen in de BALF (figuur 4). De toename vouwen waren 1756, 114, 110, 91.7, 45.8, en 6.9 vouwen voor eosinofielen, macrofagen, neutrofielen, basofielen, monocyten, en mestcellen, respectievelijk, wat wijst op een bevredigende vaststelling van een verergerd astma model in deze studie. Behandeling met SLPCD verminderde aanzienlijk en dosis-afhankelijk het aantal van deze ontstekingscellen, vooral eosinofielen, in BALF in vergelijking met astmatische muizen (figuur 4). Deze resultaten suggereerden dat SLPCD de infiltratie van de ontstekingscellen in de longen verminderde bij OVA-geïnduceerde astmatische muizen, hetgeen consistent is met de resultaten van de histopathologische observatie.
Het is bekend dat de verhoging van IgE antilichaam niveaus gecorreleerd was met allergische ontsteking van de luchtwegen en bronchiale hyperreactiviteit in astma model muizen. Coyle et al. meldden dat anti-IgE antilichamen eosinofiele luchtwegontsteking en bronchiale hyperreactiviteit bij astmatische muizen verzwakten. Allergeen-geïnduceerde IgE activeerde eosinofielen, basofielen en mestcellen om cytokinen IL-4, IL-5, IL-10, en IL-13 af te scheiden. Daarom hebben we de serum totale IgE niveaus beoordeeld en vonden dat SLPCD de serum totale IgE niveaus aanzienlijk kon verlagen in OVA-challenged astmatische muizen (figuur 5).
Het onevenwicht van Th1/Th2 cellen wordt beschouwd als de immunologische oorzaak van astma . Bij astma is de activiteit van Th1-cellen verminderd, terwijl de activiteit van Th2-cellen is geactiveerd, wat resulteert in een toename van Th2-type cytokinen en een afname van Th1-cytokinen . Th2 cellen gemigreerd naar de long scheiden de prototypische Th2 type cytokines IL-4, IL-5, en IL-13 af, wat resulteert in goblet cel hyperplasie, bronchoconstrictie, en eosinofilie in de luchtwegen . In vitro kan IL-13 de productie van IgE bemiddelen en mogelijk een sleutelrol spelen in de pathogenese van IgE-gemedieerde allergische aandoeningen. IL-13 kan ook de overleving van eosinofielen bevorderen en bijdragen tot de pathologische activiteiten van deze cellen bij astma. Muizen die IL-13 overexpresseren repliceren verschillende kenmerken van astma, waaronder pulmonale eosinofilie, epitheliale hyperplasie, luchtwegobstructie, en hyperreactie op cholinerge.
Het onderdrukken van de productie van Th2 cytokines zou nuttig blijken te zijn voor allergeen immunotherapie . Aan de andere kant kunnen Th1-geactiveerde cellen de ontsteking van astmatische luchtwegen remmen . Th1 cytokines, zoals IFN-γ, remmen allergeen-geïnduceerde eosinofiel rekrutering en IgE-afgifte via downregulatie van GATA-3, IL-4, en IL-5 expressie in het longweefsel van het astma model. In deze studie hebben we het effect van SLPCD op de cytokineniveaus in BALF van de astmatische muizen geschat. De resultaten toonden aan dat SLPCD dosis-afhankelijk niet alleen de niveaus van IL-13 en IL-10 verminderde, maar ook het niveau van IFN-γ verhoogde in de BALF van de astmatische muizen (Figuur 6). De remmende werking van SLPCD behandeling op de productie van Th2 cytokines was consistent met het effect op de niveaus van totaal IgE in serum.
Er werd gerapporteerd dat IL-5 een belangrijke rol speelt in de proliferatie, differentiatie, maturatie, en migratie naar weefselplaatsen van eosinofielen. De expressieniveaus van IL-5 mRNA in bronchiale biopten van astmatici waren verhoogd in vergelijking met niet-astmatische controles. De mRNA expressie niveaus van IL-5 waren gecorreleerd met de klinische ernst van astma. De accumulatieve allergeen provocatie verhoogde de IL-4 mRNA expressie in BALF cellen en perifere CD4+ en CD8+ T cellen. Van IL-10 is ook aangetoond dat het een rol speelt bij astma. De toename van IL-13 transcripten in BAL cellen van patiënten met milde astma na lage dosis allergeen provocatie is consistent met het hogere expressie niveau van IL-13 mRNA in bronchiale mucosa . De effecten van SLPCD behandeling op het mRNA expressieniveau van cytokines in longweefsels van de astmatische muizen werden verder bepaald met behulp van qRT-PCR. SLPCD behandeling verlaagde de mRNA expressie niveaus van Th2 cytokines (IL-4, IL-5, IL-10, en IL-13) aanzienlijk en verhoogde die van Th1 cytokines (IL-2 en IFN-γ) in de longen van astmatische muizen. Deze resultaten bevestigden verder de regulerende effecten van SLPCD-behandeling op Th1- en Th2-cytokineresponsen in longweefsels van astmatische muizen.
In conclusie, SLPCD kon luchtwegontsteking aanzienlijk remmen, ontstekingscellen in BALF verminderen, de serum totale IgE-niveaus verlagen, en de inhoud van cytokinen in BALF en de mRNA-expressie van cytokinen in longen van astmatische muizen moduleren. Deze resultaten suggereerden dat SLPCD de luchtwegontsteking kon verminderen en de pathogenese in een muismodel van astma kon verlichten door het induceren van een gebalanceerde Th1/Th2-respons en het klinisch gebruik ervan kon valideren als een effectief geneesmiddel bij de behandeling van astma.
Disclosure
Het huidige adres van Binnian Zhu is ACON Biotech (Hangzhou) Co., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd, Hangzhou 310030, China.
Conflicts of Interest
De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn.
Authors’ Contributions
Binnian Zhu en Jun Dong hebben gelijkelijk bijgedragen aan dit onderzoekswerk.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Grant-in-Aid van het Shaoxing Science and Technology Project (nr. 2014B700722).
De longweefsels werden 24 uur na de laatste toediening verzameld en vervolgens gefixeerd met 4% paraformaldehyde, ingebed in paraffine, en op 5 μm dikte doorgesneden. Een reeks microsecties werd gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E) voor histologische beoordeling.
2.7. Bronchoalveolar Lavage Fluid (BALF) Collection and Flow Cytometry
BALF werd verzameld door spoeling van de longen met fosfaat gebufferde oplossing (PBS) toegediend via een endotracheale katheter 24 uur na de laatste toediening. BALF werd gedurende 5 min. gecentrifugeerd en de cellen werden gewassen met ijskoud PBS dat 2% FCS bevatte. De cellen werden geblokkeerd met 0,5 μg gezuiverd anti-muis CD16/CD32 (FcR-blok) antilichaam gedurende 10 min op ijs om niet-specifieke kleuring te remmen en vervolgens gekleurd met de combinatie van anti-muis Ly-6G-FITC, F4/80 antigeen-PE-Cy5 en Ly-6C-APC, of FceR1-APC, CD117-FITC en Siglec-F-PE antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 30 min in het donker. De gekleurde cellen werden gewassen met ijskoud PBS en geresuspendeerd in PBS. Honderdduizend levensvatbare cellen per behandeling werden geanalyseerd met een BD FACScan flowcytometer met gebruikmaking van CellQuest software.
2.8. Meting van het totale IgE-antilichaam in serum
Het serum werd 24 uur na de laatste toediening verzameld. Het totaal IgE antilichaam werd gedetecteerd in individuele serummonsters met de RayBio® muis IgE ELISA kit. De 1:1250 verdunde serummonsters of de IgE-standaard werden toegevoegd aan 96-wells-platen die gecoat waren met een specifiek anti-muis IgE-antilichaam. De platen werden gedurende 2,5 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd en vervolgens viermaal gewassen. Het detecterende antilichaam werd aan elk putje toegevoegd. De platen werden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd vóór toevoeging van mierikswortelperoxidase-geconjugeerd ABC. Na incubatie gedurende 45 min. werden de platen gewassen en gedurende 30 min. bij kamertemperatuur ontwikkeld met TMB. De reactie werd gestopt door toevoeging van 20 μl stopoplossing. De absorptie werd gemeten op een ELISA-afleesapparaat (BIO-RAD 680) bij 450 nm.
2.9. Meting van Cytokines in BALF
De concentraties van Th2 (IL-4, IL-5, IL-10, en IL-13) en Th1 (IFN-γ en IL-2) cytokines in BALF werden gedetecteerd met behulp van commerciële ELISA-kits zoals eerder .
2.10. Kwantitatieve Real-Time PCR (qRT-PCR)
De mRNA expressieniveaus van Th2 (IL-4, IL-5, IL-10, en IL-13) en Th1 (IFN-γ en IL-2) cytokines in longweefsels werden bepaald met behulp van qRT-PCR. Het totale RNA werd geïsoleerd uit gehomogeniseerd longweefsel met behulp van het Trizol-reagens volgens het protocol van de fabrikant, en omgekeerde transcriptie werd uitgevoerd zoals eerder . Vervolgens werd amplificatie uitgevoerd in 20 pi reactie met behulp van FastStart Universal SYBR Green Master. Real-time PCR werd uitgevoerd met behulp van een ABI 7400 Real-Time PCR-systeem. Primers voor qRT-PCR werden gesynthetiseerd door Sangon Biotech (Shanghai) Co, Ltd., China. (China), en de sequenties werden vermeld in tabel 2. De qPCR-cyclus werd als volgt uitgevoerd: aanvankelijke denaturatie bij 95°C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 95°C gedurende 10 s, annealing bij 60°C gedurende 1 min. GAPDH werd gebruikt als endogene controle. De efficiëntie en specificiteit van de amplificatie van de primers werden voor elke set primers geverifieerd. De expressieniveaus van de geteste genen ten opzichte van GAPDH werden bepaald volgens de methode en als voudige inductie .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.11. Statistische analyse
De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking (SD) en onderzocht op hun statistische significantie van verschil met ANOVA en een Tukey post hoc test. -waarden van minder dan 0,05 werden als statistisch significant beschouwd.
3. Resultaten
3.1. HPLC-profiel van SLPCD
Het gehalte aan chlorogeenzuur en rutine in SLPCD werd geanalyseerd met behulp van HPLC. In vergelijking met standaardreferentieverbindingen werden chlorogeenzuur en rutine geïdentificeerd en bepaald (figuur 2). De regressievergelijkingen van de kalibratiecurve van de standaarden waren A = 3719,7C – 102166 (R2=0,9999) en A = 9137,3C – 408038 (R2=0,9996) voor respectievelijk chlorogeenzuur en rutine. De concentraties chlorogeenzuur en rutine in SLPCD bedroegen respectievelijk 1,4 mg/g en 0,15 mg/g.
(a)
(b)
(a)
(b)
3.2. SLPCD verminderde de luchtwegontsteking bij astmatische muizen
Het effect van SLPCD op de longontsteking bij door OVA veroorzaakte astmatische muizen werd waargenomen via H&E kleuring, en de resultaten werden getoond in figuur 3. De astma model muizen vertoonden meer ernstige interstitiële, peribronchiolaire, en perivasculaire inflammatoire cel infiltratie in de long in vergelijking met normale controle muizen. Als een positieve controle, Dex aanzienlijk verlicht de infiltratie van long interstitiële, peribronchiolar, en perivasculaire inflammatoire cellen in astma muizen. De ontstekingsinfiltraten in de longen van de muizen met OVA-challenge werden ook aanzienlijk verzwakt door SLPCD in vergelijking met de modelcontrole.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.3. SLPCD verminderde de hoeveelheid ontstekingscellen in de BALF van astmatische muizen
Om de effecten van SLPCD op de infiltratie van ontstekingscellen in de long van door OVA geïnduceerde astmatische muizen vast te stellen, werd de telling van de ontstekingscellen met inbegrip van eosinofielen (Sigilec F+), basofielen (CD117+), neutrofielen (Ly-6C+y-6), macrofagen (F4/), monocyten (Ly6G-Ly6C+), en mestcellen (FcER1+) in BALF uitgevoerd door flowcytometrie. Zoals getoond in figuur 4, de aantallen eosinofielen (1756-voudig), macrofagen (114-voudig), neutrofielen (110-voudig), basofielen (91.7-voudig), monocyten (45.8-voudig), en mestcellen (6.9-voudig) in de BALF van astmatische muizen waren duidelijk verhoogd in vergelijking met normale controle muizen. Dex verminderde de aantallen van een verscheidenheid aan geteste ontstekingscellen in de BALF van astmatische muizen aanzienlijk (), en kwam bijna overeen met de niveaus van normale muizen. De aantallen van deze ontstekingscellen in BALF van astmatische muizen werden significant dosisafhankelijk verminderd door SLPCD in vergelijking met de model controlegroep (, , of ).
3.4. SLPCD verlaagde het serum totaal IgE-niveau van astmatische muizen
De effecten van SLPCD op het serum totaal IgE-niveau bij astmatische muizen werden getoond in Figuur 5. De totale IgE-antistofspiegels in het serum van astmatische muizen waren aanzienlijk hoger dan die van normale controlemuizen (). Als een positief geneesmiddel, Dex aanzienlijk verlaagd het serum totaal IgE-antilichaam niveaus in OVA-geïnduceerde astmatische muizen (). De totale IgE-antistofniveaus in het serum van de astmatische muizen werden aanzienlijk dosisafhankelijk verlaagd door SLPCD in vergelijking met de modelcontrolegroep ().
3.5. SLPCD Moduleerde de niveaus van Cytokines in BALF van Astmatische muizen
De niveaus van Th2 (IL-4, IL-5, IL-10, en IL-13) en Th1 (IFN-γ en IL-2) cytokines in BALF werden gemeten door ELISA. Zoals blijkt uit figuur 6, OVA uitdaging leidde tot de significante toename van het niveau van IL-10 en IL-13 en daling van die van IFN-γ in de BALF van de astmatische muizen in vergelijking met de normale controlegroep ( of ). Het gehalte aan IL-4, IL-5 en IL-2 in de BALF van de model-controlemuizen bleek echter zeer laag te zijn en dicht bij de detectiegrens te liggen. De toediening van SLPCD in drie doses en Dex verminderde de gehalten aan IL-13 en IL-10 aanzienlijk, en verhoogde die van IFN-γ in BALF van OVA-geïnduceerde astmatische muizen opmerkelijk in vergelijking met model-controlemuizen ( of ) (figuur 6).
3.6. SLPCD reguleerde de mRNA expressieniveaus van cytokines in longweefsels van astmatische muizen
De effecten van SLPCD op de mRNA expressie van Th1 en Th2-type cytokines in longweefsels van door OVA geïnduceerde astmatische muizen werden gedetecteerd met behulp van qRT-PCR, en de resultaten werden getoond in Tabel 3. In vergelijking met de normale controle muizen, werden de expressieniveaus van Th2 cytokine mRNAs (IL-4, IL-5, IL-10, en IL-13) duidelijk verhoogd en die van Th1 cytokine mRNAs (IL-2 en IFN-γ) werden aanzienlijk verlaagd in longweefsels van astmatische muizen (P < 0,001). De toediening van SLPCD in drie doses en Dex resulteerde in significante downregulatie van de mRNA expressieniveaus van Th2 cytokines IL-4, IL-5, IL-10, en IL-13 en upregulatie van die van Th1 cytokines IL-2 en IFN-γ in longweefsels van astmatische muizen in vergelijking met de astmatische modelgroepen (P < 0.05, P < 0.01, of P < 0.001).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
De longweefsels werden 24 uur na de laatste toediening verzameld en de mRNA expressieniveaus van GAPDH en cytokinen werden gedetecteerd door qRT-PCR met behulp van specifieke primers. Het housekeeping gen GAPDH werd gebruikt als endogene controle. De waarden worden gepresenteerd als gemiddelden ± SD (). Significante verschillen ten opzichte van de astmatische model controlegroep (MC) worden aangeduid als , , en . Dex: dexamethason (positieve controle) en NC: normale controlegroep.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Discussie
Astma is wereldwijd een volksgezondheidsprobleem geworden, vooral in de ontwikkelde landen . Glucocorticoïden zijn de eerstelijnstherapie voor de behandeling en controle van astma. Hoewel deze geneesmiddelen astmasymptomen konden verbeteren, werden zij strikt gecontroleerd voor aanhoudend gebruik wegens hun ernstige bijwerkingen . Nieuwe astmatherapeutische benaderingen zijn dus noodzakelijk. Veel traditionele Chinese geneesmiddelen vertonen verschillende biologische activiteiten, waaronder antibacteriële, schimmelwerende, ontstekingsremmende, anti-anafylaxie en immunomodulerende effecten, die potentieel hebben voor de behandeling van astma. Er zijn verschillende modellen van allergische bronchopulmonale ontsteking bij experimentele muizen beschreven. Het OVA-geïnduceerde allergische astma muismodel bootst veel kenmerken van menselijke astma na, en heeft een grote acceptatie verworven. Daarom onderzochten we de antiastmatische effecten van SLPCD en onderzochten we de moleculaire mechanismen met behulp van dit model.
SLPCD bestaat uit 13 traditionele Chinese geneesmiddelen. Cortex Mori, Pheretima Aspergillum, en Herba Ephedrae zijn de primaire bestanddelen die de longen dispergeren en astma verlichten. Sperma Armeniacae Amarum, roergebakken Fructus Perillae, Sperma Descurainiae, en met honing gebakken Flos Farfarae zijn aanvullende bestanddelen die slijm verminderen, hoest en astma verlichten. Tot de hulpbestanddelen behoren Rhizoma Belamcandae, Herba Houttyniae, en Rhizoma Fagopyri Dibotrydis die het hittekwaad opruimen en oppervlakkige kwaden verdrijven, alsmede Scorpio en Radix Angelicae Sinensis die bloedstuwing verdrijven, collateraal baggeren, spasmolyse en astma stoppen. Radix et Rhizoma Glycyrrhizae harmoniseert alle geneesmiddelen. Samen vullen alle componenten elkaar aan om de resultaten te bereiken van het verspreiden van de longen, het laten afdalen van Qi, en het verlichten van hoest en astma. De kwaliteitscontrole van SLPCD gebruikt in deze studie werd uitgevoerd met behulp van HPLC, en twee referentie chemicaliën (chlorogeenzuur en rutine) werden geïdentificeerd als belangrijke index componenten (figuur 2).
Allergische astma wordt gedefinieerd als een luchtweg acute-on-chronische ontstekingsziekte met karakteristieke eosinofiele rekrutering, hyperplasie van gobletcellen, slijm hypersecretie, collageenafzetting, gladde spiercel hypertrofie, en subepitheliale fibrose . In deze studie werden de effecten van SLPCD behandeling op longontsteking in OVA-geëxalciteerde astmatische muizen beoordeeld via H&E kleuring. De typische allergische ophoping en infiltratie van ontstekingscellen werden waargenomen in longweefsels van astmatische modelmuizen. De behandeling met SLPCD verminderde de ontstekingsinfiltraten in de longweefsels van astmatische muizen (Figuur 3), wat suggereert dat SLPCD de luchtwegontsteking aanzienlijk verminderde.
De ontstekingsimmuuncellen spelen een sleutelrol in de pathogenese en de ernst van astma. De ontstekingscellen die vanuit regionale lymfeklieren naar de luchtwegen worden gerekruteerd, kunnen cytokines en chemokines afscheiden, wat resulteert in hyperreactiviteit van de luchtwegen. Het verminderen van de ontstekingscellen in de luchtwegen is een effectieve manier om astma te behandelen. Om te bevestigen dat SLPCD de infiltratie van ontstekingscellen kan remmen, telden we verder eosinofielen, macrofagen, neutrofielen, basofielen, monocyten, en mestcellen in BALF. OVA inhalatie leidde tot significante toenames in de tellingen van deze zes soorten ontstekingscellen in de BALF (figuur 4). De toename vouwen waren 1756, 114, 110, 91.7, 45.8, en 6.9 vouwen voor eosinofielen, macrofagen, neutrofielen, basofielen, monocyten, en mestcellen, respectievelijk, wat wijst op een bevredigende vaststelling van een verergerd astma model in deze studie. Behandeling met SLPCD verminderde aanzienlijk en dosis-afhankelijk het aantal van deze ontstekingscellen, vooral eosinofielen, in BALF in vergelijking met astmatische muizen (figuur 4). Deze resultaten suggereerden dat SLPCD de infiltratie van de ontstekingscellen in de longen verminderde bij OVA-geïnduceerde astmatische muizen, hetgeen consistent is met de resultaten van de histopathologische observatie.
Het is bekend dat de verhoging van IgE antilichaam niveaus gecorreleerd was met allergische ontsteking van de luchtwegen en bronchiale hyperreactiviteit in astma model muizen. Coyle et al. meldden dat anti-IgE antilichamen eosinofiele luchtwegontsteking en bronchiale hyperreactiviteit bij astmatische muizen verzwakten. Allergeen-geïnduceerde IgE activeerde eosinofielen, basofielen en mestcellen om cytokinen IL-4, IL-5, IL-10, en IL-13 af te scheiden. Daarom hebben we de serum totale IgE niveaus beoordeeld en vonden dat SLPCD de serum totale IgE niveaus aanzienlijk kon verlagen in OVA-challenged astmatische muizen (figuur 5).
Het onevenwicht van Th1/Th2 cellen wordt beschouwd als de immunologische oorzaak van astma . Bij astma is de activiteit van Th1-cellen verminderd, terwijl de activiteit van Th2-cellen is geactiveerd, wat resulteert in een toename van Th2-type cytokinen en een afname van Th1-cytokinen . Th2 cellen gemigreerd naar de long scheiden de prototypische Th2 type cytokines IL-4, IL-5, en IL-13 af, wat resulteert in goblet cel hyperplasie, bronchoconstrictie, en eosinofilie in de luchtwegen . In vitro kan IL-13 de productie van IgE bemiddelen en mogelijk een sleutelrol spelen in de pathogenese van IgE-gemedieerde allergische aandoeningen. IL-13 kan ook de overleving van eosinofielen bevorderen en bijdragen tot de pathologische activiteiten van deze cellen bij astma. Muizen die IL-13 overexpresseren repliceren verschillende kenmerken van astma, waaronder pulmonale eosinofilie, epitheliale hyperplasie, luchtwegobstructie, en hyperreactie op cholinerge.
Het onderdrukken van de productie van Th2 cytokines zou nuttig blijken te zijn voor allergeen immunotherapie . Aan de andere kant kunnen Th1-geactiveerde cellen de ontsteking van astmatische luchtwegen remmen . Th1 cytokines, zoals IFN-γ, remmen allergeen-geïnduceerde eosinofiel rekrutering en IgE-afgifte via downregulatie van GATA-3, IL-4, en IL-5 expressie in het longweefsel van het astma model. In deze studie hebben we het effect van SLPCD op de cytokineniveaus in BALF van de astmatische muizen geschat. De resultaten toonden aan dat SLPCD dosis-afhankelijk niet alleen de niveaus van IL-13 en IL-10 verminderde, maar ook het niveau van IFN-γ verhoogde in de BALF van de astmatische muizen (Figuur 6). De remmende werking van SLPCD behandeling op de productie van Th2 cytokines was consistent met het effect op de niveaus van totaal IgE in serum.
Er werd gerapporteerd dat IL-5 een belangrijke rol speelt in de proliferatie, differentiatie, maturatie, en migratie naar weefselplaatsen van eosinofielen. De expressieniveaus van IL-5 mRNA in bronchiale biopten van astmatici waren verhoogd in vergelijking met niet-astmatische controles. De mRNA expressie niveaus van IL-5 waren gecorreleerd met de klinische ernst van astma. De accumulatieve allergeen provocatie verhoogde de IL-4 mRNA expressie in BALF cellen en perifere CD4+ en CD8+ T cellen. Van IL-10 is ook aangetoond dat het een rol speelt bij astma. De toename van IL-13 transcripten in BAL cellen van patiënten met milde astma na lage dosis allergeen provocatie is consistent met het hogere expressie niveau van IL-13 mRNA in bronchiale mucosa . De effecten van SLPCD behandeling op het mRNA expressieniveau van cytokines in longweefsels van de astmatische muizen werden verder bepaald met behulp van qRT-PCR. SLPCD behandeling verlaagde de mRNA expressie niveaus van Th2 cytokines (IL-4, IL-5, IL-10, en IL-13) aanzienlijk en verhoogde die van Th1 cytokines (IL-2 en IFN-γ) in de longen van astmatische muizen. Deze resultaten bevestigden verder de regulerende effecten van SLPCD-behandeling op Th1- en Th2-cytokineresponsen in longweefsels van astmatische muizen.
In conclusie, SLPCD kon luchtwegontsteking aanzienlijk remmen, ontstekingscellen in BALF verminderen, de serum totale IgE-niveaus verlagen, en de inhoud van cytokinen in BALF en de mRNA-expressie van cytokinen in longen van astmatische muizen moduleren. Deze resultaten suggereerden dat SLPCD de luchtwegontsteking kon verminderen en de pathogenese in een muismodel van astma kon verlichten door het induceren van een gebalanceerde Th1/Th2-respons en het klinisch gebruik ervan kon valideren als een effectief geneesmiddel bij de behandeling van astma.
Disclosure
Het huidige adres van Binnian Zhu is ACON Biotech (Hangzhou) Co., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd., Ltd, Hangzhou 310030, China.
Conflicts of Interest
De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn.
Authors’ Contributions
Binnian Zhu en Jun Dong hebben gelijkelijk bijgedragen aan dit onderzoekswerk.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Grant-in-Aid van het Shaoxing Science and Technology Project (nr. 2014B700722).