Antibiotische gevoeligheden van indicatorbacteriën Escherichia coli en Enterococci spp. geïsoleerd uit eenden in Morogoro Municipality, Tanzania
Methodieken
Studiegebied en eendenbemonstering
Deze cross-sectionele studie werd uitgevoerd in Morogoro Municipality tussen november 2014 en maart 2015 waar 100 Muscovy eenden (Carina moschata) werden bemonsterd uit 26 achtertuin koppels . Studie eenden werden willekeurig geselecteerd uit elk koppel waar 5-10% van de kudde grootte werd bemonsterd . De bemonsterde vogels omvatten 86 wijfjes en 14 mannetjes. Voor de bemonstering werd basisinformatie over management, voeding, gebruik en verwijdering van ongebruikte antibiotica verzameld met behulp van een vragenlijst (Additional file 1). De geselecteerde eenden werden manueel gefixeerd en een steriel wattenstaafje werd in de cloaca gestoken om fecaal materiaal te verzamelen. De monsters werden bewaard in een koelbox met ijspak en vervoerd naar het laboratorium van de Sokoine University of Agriculture voor analyse. Voor de consistentie werden alle 100 eenden bemonsterd door twee onderzoekers die door de laboratoriumtechnologen waren opgeleid in het nemen van veegdoekjes bij vogels.
Isolatie en identificatie van E. coli en Enterococci spp.
Fecesmonsters werden uitgeplaat op MacConkey agar (Oxoid, Basingstoke, UK) en gedurende 24 uur geïncubeerd in aërobe omstandigheden voor de isolatie van E. coli . Verdachte kolonies werden verder geïdentificeerd op basis van koloniale morfologie, Gram-kleuring en biochemische tests. Voor de isolatie van Enterococcen spp. werden de monsters uitgeplaat op Slanetz-Bartley agar (Oxoid, Basingstoke, UK) en gedurende 48 uur geïncubeerd onder aërobe omstandigheden en geïdentificeerd op basis van koloniale morfologie en biochemische tests . Tijdens de isolatie en identificatie werden E. coli ATCC25922 en Enterococcus faecium ATCC 2912 opgenomen als controlestammen.
Antibiotische gevoeligheid
Alle E. coli- en Enterococci-isolaten werden getest op antibiotische gevoeligheid met behulp van de schijfdiffusiemethode en geïnterpreteerd volgens de CLSI . Antimicrobiële gevoeligheidstesten werden uitgevoerd op een aantal antibiotica die algemeen gebruikt worden in de menselijke geneeskunde in Tanzania. Vier antibiotica voor E. coli werden getest in de aangegeven concentraties: ampicilline 10 µg, cefotaxime 30 µg, trimethoprim-sulfamethoxine 25 µg en tetracycline 30 µg. Enterococcen werden getest tegen ampicilline 10 µg, erytromycine 15 µg, rifampine 5 µg, tetracycline 30 µg en trimethoprim-sulfamethoxine 25 µg. Alle antibioticaschijven waren van Oxoid, Basingstoke, UK.
Ethische overwegingen
De toestemming om deze studie uit te voeren werd verleend door de Morogoro Municipal Livestock Officer en ethische goedkeuring voor de studie werd gegeven door de Ethische Commissies van de Sokoine University of Agriculture, Tanzania. Voorafgaand aan de bemonstering werd mondelinge toestemming verkregen van elk van de boeren.
Resultaten
Van de 100 gekweekte fecesmonsters had 91% E. coli, waarvan 64 (70,3%) resistentie vertoonden tegen verschillende geteste antibiotica (tabel 1). Meervoudige antibioticaresistentie aangetoond door E. coli waren: 28 (30,8%) isolaten tegen vier antibiotica, 35 (38,5%) tegen drie antibiotica, 13 (14,3%) tegen twee antibiotica, 11 (12,1%) isolaten tegen één antibioticum. Enterococcus werd uit alle monsters geïsoleerd en 42% toonde resistentie tegen verschillende geteste antibiotica. Vijf procent van de Enterococcus-isolaten was resistent tegen alle antibiotica, 13% tegen vier antibiotica, 21% tegen drie antibiotica, 26% tegen twee antibiotica en 28% tegen één getest antibioticum. De resultaten over het beheer van eenden en hun mogelijke toegang tot antibioticaresiduen zijn samengevat in tabel 2. Van de 26 geïnterviewde boeren hield 92,3% zich bezig met het extensief beheren van eenden, waarbij ze toegang hadden tot dumpplaatsen. Er werd geen toediening van diergeneesmiddelen aan eenden gerapporteerd, maar de respondenten meldden dat ze andere dieren behandelden met tetracyclines/oxytetracycline.
Discussie
De huidige studie toonde aan dat het E. coli-isolatiepercentage 91% bedroeg, terwijl alle eenden Enterococcen huisvestten en de isolaten een hoge mate van multi-antibioticaresistentie vertoonden. Deze studie werpt licht op het feit dat de indicatorbacteriën van vrije scharreleenden in Tanzania kunnen worden gebruikt in studies van antibioticaresistentie. Dit suggereert dat het probleem van antibioticaresistentie wijdverbreid is, zelfs bij bacterie-isolaten van dieren die geen antibioticumtherapie krijgen. Dit heeft gevolgen voor de volksgezondheid, aangezien eenden voedsel zoeken in de omgeving van hun huis en hun fecale uitwerpselen overal rondslingeren. De resistente bacteriën kunnen hun weg vinden naar de voedselketen en de mens aantasten of het resistente gen kan worden overgedragen op pathogene bacteriën
De geschatte prevalentie van antibioticaresistentie in E. coli die tijdens deze studie werden geïsoleerd, is vergelijkbaar met de resistentie die in Maleisië werd gemeld. In Nigeria is een lage prevalentie van 8,6% gerapporteerd, waarschijnlijk als gevolg van het gebruik van verschillende antibiotica zoals ofloxacine, nalidixinezuur en gentamycine . De hoge prevalentie van antibioticaresistentie die tijdens deze studie werd waargenomen, is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat eenden voortdurend worden blootgesteld aan antibioticaresiduen afkomstig van dierlijke en menselijke lozingen, omdat ze op grote schaal worden gebruikt. Studies tonen aan dat antibiotica die gebruikt worden bij voedseldieren slecht geabsorbeerd worden in de darm en dat de moederverbinding wordt uitgescheiden in de feces. Dit wordt ondersteund door verschillende studies die hoge gehalten aan antibioticaresiduen in rioolwater en dierlijk afval hebben gerapporteerd . Daarom wordt de normale flora in scharreleenden voortdurend blootgesteld aan antibioticaresiduen, waardoor ze resistentie ontwikkelen, zoals werd waargenomen tijdens deze studie.
De resistentie van E. coli tegen ampicilline was het hoogst (81%) in vergelijking met andere antibiotica die in de studie werden gebruikt, vergelijkbaar met een eerder verslag in Slowakije, waar de resistentie 87,8% bedroeg . In het algemeen blijkt uit studies dat 60-70% van de E. coli-isolaten resistentie tegen ampicilline heeft ontwikkeld. Dit kan worden veroorzaakt door een te intensief gebruik van ampicilline in de menselijke praktijk, waardoor de residuen ervan potentiële bronnen zijn van milieucontaminatie waar eenden hun voedsel zoeken. In het geval van sulfamethoxine bedroeg de resistentie 76%, zoals eerder vastgesteld door Van Tuat. De antibacteriële resistentie van tetracycline in deze studie was 59%, terwijl die in Slowakije 37,5% was en die in Nigeria 75%. Interessant is dat E. coli ook antibacteriële resistentie vertoonde tegen cefotaxime met 63%, een antibioticum dat niet algemeen gebruikt wordt bij de behandeling van de dieren in Tanzania. Eenden kunnen toegang krijgen tot cefotaxime-residuen op stortplaatsen waar menselijke feces en weggegooide medicijnresten worden gevonden (tabel 2). Er is echter hoge resistentie tegen cefotaxime waargenomen bij bacteriën geïsoleerd uit verschillende rioolstelsels van gezondheidsinstellingen.
Meervoudige resistentie van E. coli tegen meer dan één antibioticum werd ook waargenomen in de studie. De bevindingen waren te hoog in vergelijking met de studie uitgevoerd in Vietnam waar meervoudige antibioticaresistentie van E. coli 16,7% bedroeg tegen vier antibiotica, tegen drie antibiotica 20% en tegen twee antibiotica 23,3% . Het voorkomen van meervoudige resistentie tegen geneesmiddelen suggereerde dat vee een rol speelde als reservoirs van resistente bacteriën voor milieuverontreiniging. Gebleken is dat bacteriepopulaties die geïsoleerd zijn uit de darmen van dieren die aan antibiotica zijn blootgesteld, vijf maal meer kans lopen resistent te zijn tegen een bepaald antibioticum. De niet-resistente bacteriën verwerven gewoonlijk de extra-chromosomale antibioticaresistentieplasmiden (R-plasmiden) van de resistente bacteriën wanneer zij in nauw contact met elkaar komen. De waargenomen resistentie kan worden toegeschreven aan een irrationeel gebruik van antibiotica waarbij een aanzienlijke hoeveelheid residuen in het milieu terechtkomt. Andere factoren die de ontwikkeling van resistentie kunnen veroorzaken, zijn de gemakkelijke beschikbaarheid en het ongebreidelde gebruik van breedspectrum-antibiotica bij de voorlopige behandeling van infecties, zelfs in gezondheidsinstellingen. Het gebrek aan handhaving van de voorschriften inzake het gebruik van antibiotica als onderdeel van infectiecontroleprogramma’s kan het resistentiepatroon in aanzienlijke mate hebben beïnvloed.
Enterococci spp. zijn natuurlijke commensalen van de menselijke en dierlijke darm. Alle studie-eenden hadden Enterococci spp. in hun darminhoud, die 42% resistentie vertoonden tegen verschillende geteste antibiotica. De bevindingen van deze studie toonden echter een hoge resistentie tegen rifampine (62%), ampicilline (62%) en tetracycline (42%). Multidrug-resistentie werd ook waargenomen bij meer dan 65% van de isolaten. Zoals eerder vermeld, kan de waargenomen resistentie van de bacteriën tegen verschillende antibiotica die getest werden in afwezigheid van gebruik van de geneesmiddelen bij eenden, te wijten zijn aan residuen die geloosd worden in de omgeving waar eenden scharrelen en gemakkelijk blootgesteld kunnen worden aan antibiotica en andere resistente bacteriën. Wanneer resistente bacteriën in contact komen met de niet-resistente, kan uitwisseling van genetisch materiaal plaatsvinden en kan het resistente gen worden verworven. Elders hebben studies gerapporteerd dat Enterococci spp. geïsoleerd uit eenden resistentie vertoonden tegen macroliden en lincosamide antibiotica . Niettemin is Enterococci spp. intrinsiek resistent tegen verschillende groepen antibiotica, waaronder cefalosporines en aminoglycosiden. Bovendien bevatten veel stammen overdraagbare genetische elementen voor verworven resistentie tegen verschillende antibiotica zoals tetracycline . Andere studies naar antibioticaresistentie bij Enterococci spp. geïsoleerd uit eenden zijn uitgevoerd met het antibioticum vancomycine . Verdere vatbaarheidsstudies van Enterococci spp. tegen vancomycine worden in de toekomst gesuggereerd, aangezien het antibioticum tegenwoordig een veelgebruikt geneesmiddel is in de menselijke geneeskunde in Tanzania.
De vragenlijststudie ondersteunt verder de laboratoriumwaarneming van hoge resistentiegraad getoond door E. coli en Enterococcus spp. Er werd waargenomen dat antibiotica op grote schaal worden gebruikt bij de behandeling van dieren en mensen. Ongeacht het niet-gebruik van geneesmiddelen voor diergeneeskundig gebruik in dompers, worden zij door het extensieve beheer van de dompers blootgesteld aan het milieu met antibioticaresiduen en andere bacteriën van dieren en mensen, die antibiotica hebben gekregen. Dit wordt ondersteund door de bevindingen dat de waargenomen resistenties betrekking hadden op antibiotica die gewoonlijk bij mens en dier worden gebruikt (tabel 2). Resistentiebacteriën zijn geïsoleerd uit verschillende bronnen, waaronder rioolwaterlozing en het milieu. Medicijnresten en containers werden lukraak weggegooid in de huishoudelijke omgeving, waardoor eenden aan het antibioticum kunnen worden blootgesteld. Daarom kan het intensieve managementsysteem van eenden helpen om de onnodige blootstelling van vogels aan antibioticaresiduen te minimaliseren.
Conclusie
Over het algemeen was de antibioticaresistentie van E. coli en Enterococcus spp. in deze studie hoog. Dit toont de rol aan van vee en kippen, die voortdurend antibiotica gebruiken, als potentiële primaire bronnen van antibiotica-resistentiegenen voor bacteriën geïsoleerd uit eenden. Het isoleren van multi-antibiotica-resistente E. coli en Enterococcus spp. van eenden dient als potentiële dragers van antibiotica-resistente stammen voor de mens en vormt een ernstig probleem voor de volksgezondheid.
Beperkingen
In deze studie werden slechts 100 eendenmonsters uit de gemeente Morogoro verzameld, waardoor de generalisatie van de resultaten beperkt is om te worden gebruikt als representatief voor de status van antimicrobiële resistentie met E. coli en Enterococcus spp. in eenden in Tanzania. Ook het aantal geteste antibiotica was gering. Het testen op antibioticumgevoeligheid van bacteriën met de schijfdiffusietestmethode kan inferieur zijn aan bouillon-microdilutiemethoden. Ook werden in de studie niet de resistentiegenotypes bepaald bij E. coli en Enterococcus spp. die resistent waren tegen verschillende soorten antibiotica. Niettemin werkt de aanwezigheid van andere dieren ter plaatse waar eendenbemonstering werd uitgevoerd als verwarrende factoren op de resistentiepercentages waargenomen in bacterie-isolaten van eenden.