[Antigen retrieval: its significance and drawbacks in immunohistochemistry]

Een van de grootste problemen in de immunohistochemie is het behoud van zowel een goede morfologie als de immunoreactiviteit van antigenen in weefselcoupes. Verschillende technieken om de immunoreactiviteit van antigenen terug te vinden (unmasking) na routinematige weefselpreparaten, zoals fixatie, dehydratie en inbedding, zijn ontwikkeld en vinden nu hun weg naar gebruik voor immunokleuringen in niet alleen cytohistologisch onderzoek maar ook pathoklinische diagnoses. In dit verslag worden eerst de mechanismen en de betekenis van zowel fixatie als antigeen retrieval onderzocht vanuit het oogpunt van de inactivering van proteïnen. Ten tweede werden enkele praktische problemen en opmerkingen in twee van de meest populaire ontmaskeringstechnieken, enzym digestie en heat-induced epitope retrieval (HIER), besproken om de technieken nauwkeurig aan te passen in de immunohistochemie. Het belangrijkste artefact dat door fixatie wordt veroorzaakt is het maskeren van weefselantigenen als gevolg van crosslinking tussen de aminozuurresiduen van eiwitten. Het is belangrijk voor elk antigeen een geschikte fixatieconditie te kiezen, rekening houdend met de biochemische aard en de resistentie tegen fixatie. (tabel 2), en de fixatiecondities zo laag mogelijk te houden zodat de immunoreactiviteit van het antigeen gemakkelijk kan worden teruggevonden met behulp van diverse ontmaskeringstechnieken (tabel 3, fig. 1). Antigeen retrieval op zich is het proces dat eiwitdenaturatie in weefsels veroorzaakt, net als vele andere eiwitinactiveringsprocessen (tabel 1). Enzym digestie kan de maskerende delen van eiwitten rond een antigeen etsen om het epitoop bloot te leggen. Hoewel enzymatische ontsluiting betrekkelijk eenvoudig is en de behandelingsconditie gemakkelijk te controleren, zijn de resultaten niet noodzakelijk dramatisch en consistent, afhankelijk van het type of de partij enzymen. Men moet dus zijn/haar eigen ontsluitingshandleiding vinden om het beste kleuringresultaat voor elk antigeen te verkrijgen (bv. Tabel 4). Zo gaf pepsinedigestie de beste resultaten bij de immunokleuring van broom-deoxyuridine (BrdU) en prolifererend celnucleair antigeen (PCNA), terwijl andere enzymen weinig effect hadden (Tabel 5). Verwarming kan ook de polypeptide ruggengraat splijten en de door fixatie gevormde cross-links verbreken. Het verhittingseffect op het terughalen van antigeen is temperatuurafhankelijk en lijkt evenredig te zijn met het product van temperatuur en tijd. In het geval van PCNA immunokleuring op paraformaldehyde gefixeerde paraffine-ingebedde secties, was verhitting bij 90 graden C gedurende ten minste 3 minuten vereist, maar naarmate de verhittingstoestand ernstiger werd, namen ook de niet-specifieke achtergrondkleuren toe (Tabel 6), wat een van de ernstigste problemen is bij het terughalen van antigeen (Fig. 2a, c). Een mogelijke keuze om dergelijke ongewenste resultaten te vermijden is de combinatie van suboptimale verwarming (bij 80 graden C gedurende 10-15 min) en pepsinedigestie (Fig. 2b, d). Een belangrijke theoretische overweging voor het gebruik van een dergelijke drastische denaturatiemethode is de vraag of de gemaskeerde antigeen-epitopen voldoende kunnen worden blootgelegd zonder aanleiding te geven tot vals-positieve (of vals-negatieve) resultaten met eerder vertrouwde antilichamen. Het lijkt erop dat elk antigeen een “op maat gemaakt” weefselpreparaat vereist voor een optimaal behoud van zijn antigeniciteit en precieze lokalisatie. Naarmate de immunologie, de moleculaire biologie, de genetica of de embryologie zich verder ontwikkelen, zal de behoefte aan meervoudige immunokleuring in combinatie met andere technologieën zoals in situ hybridisatie toenemen om de ruimtelijke en functionele relaties tussen verschillende moleculen in situ te analyseren. Antigeen retrieval zou dan een krachtige strategie worden.