Antilichaamvalidatie

Hulpmiddelen “Technical Resource Centers “Antilichaam Technische Hulpmiddelen “Antilichaamvalidatie

Niet alle antilichamen zijn geldig voor elk experiment en elke conditie, zij moeten worden gevalideerd voor de specifieke toepassing en diersoort. Momenteel bestaat er geen standaardmethode voor “antilichaamvalidatie”, wat de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van experimenten sterk kan beïnvloeden. Tijdschriften en subsidieverlenende instanties hebben stappen ondernomen om deze lacune aan te pakken. Velen stellen nu eisen om expliciet aan te geven hoe u een antilichaam voor een specifiek gebruik zult valideren. Helaas zijn er geen universeel aanvaarde criteria voor de validatie van antilichamen. Het is dus aan elke onderzoeker om elk antilichaam voor de beoogde toepassing te valideren.

Basisvalidatie

Standaardmethoden voor antilichaamvalidatie omvatten western blot, ELISA, flowcytometrie en IHC. De meeste onderzoekers voelen zich op hun gemak met deze beproefde methoden. Het validatieproces kan tijdrovend zijn omdat de onderzoeker of de fabrikant het antilichaam voor elke toepassing moet valideren. Dit probleem wordt nog verergerd doordat de omstandigheden voor elke test verschillend zijn. Zo is een western blot afhankelijk van de denaturering van eiwitten. Een voor western blot gevalideerd antilichaam kan dus goed werken in denaturerende omstandigheden, maar kan antigenen in hun natieve conformatie (d.w.z. ELISA) niet herkennen.1 Evenzo kan een antilichaam dat voor de natieve eiwitaffiniteit is gevalideerd, hetzelfde antigeen niet binden na denaturatie of fixatie.

De bovengenoemde methoden spelen een noodzakelijke rol bij de validering van antilichamen. We kunnen echter niet alleen op deze methoden vertrouwen, omdat zij niet representatief zijn voor de steeds groter wordende toepassingen. Het betrouwbaarheidsniveau van de gevalideerde antilichamen kan worden verhoogd door andere validatietechnieken op te nemen.

Old Techniques, New Uses

Om de tekortkomingen van de basisvalidatie van antilichamen aan te pakken, is een groep wetenschappers onlangs bijeengekomen om “een reeks standaardrichtlijnen voor het valideren van antilichamen voor te stellen”.2 Zij stellen voor dat onderzoekers naast de basisvalidatiemethoden voor antilichamen beginnen te leunen op conceptuele pijlers. Deze omvatten genetische strategieën, onafhankelijke antilichaamstrategieën, en gemerkte eiwitexpressie.2

• Genetische strategieën: CRISPR-Cas9 and More

  Genetische strategieën bestaan uit technieken zoalsCRISPR-Cas9, RNAi, en siRNA knockdown, gebruikt in combinatie met een eiwitdetectie-assay. Deze methoden detecteren elke niet-specifieke binding door het antilichaam in kwestie na het weg- of uitschakelen van het desbetreffende gen. Als het antilichaam specifiek is, zou er geen of een verminderd signaal van het antilichaam moeten worden gedetecteerd in de uitgeklopte respectievelijk uitgeklopte cellijnen.

• Onafhankelijke antilichaambenadering

  Het gebruik van onafhankelijke antilichamen is een andere methode waarmee niet-specifieke binding kan worden opgespoord. Bij de onafhankelijke-antilichaambenadering worden twee verschillende (onafhankelijke) antilichamen gebruikt die aan hetzelfde antigeen maar aan verschillende epitopen binden. Daarom moeten de twee antilichamen hetzelfde detectiepatroon vertonen en geen off-target binding.2 Deze techniek vereist meerdere monsters voor het testen om te controleren op variabele expressie van het doeleiwit, wat duur en tijdrovend kan worden.2 Bovendien is de validatietechniek afhankelijk van de beschikbaarheid van meerdere antilichamen die verschillende epitopen op hetzelfde doeleiwit herkennen. GenScript biedt epitope binning aan inMonoExpress™ mAb diensten die “onafhankelijke antilichamen” voor eiwitantigenen omvatten.

• Tagged Protein Expression

  Analyse van de detectie van gemerkte doeleiwitten kan ook een manier bieden om de niet-specifieke binding van antilichamen te meten. Bij deze methode worden de doeleiwitten gemodificeerd met ofwel een affiniteitstag (bv. FLAG) of een fluorescerend eiwit (bv. GFP). Vervolgens wordt, net als bij de aanpak met onafhankelijke antilichamen, het detectiepatroon van het te valideren antilichaam vergeleken met dat van het tag-specifieke antilichaam. Hoewel deze methode eenvoudig is, moet ervoor worden gezorgd dat de gemerkte eiwitten tot expressie worden gebracht op endogene niveaus, omdat “overexpressie de detectie van bindingsgebeurtenissen buiten het doel kan maskeren”.2

  Recombinante antilichamen als alternatief voor monoklonale antilichamen?

  Een recente oproep tot actie met betrekking tot de validatie van antilichamen suggereerde dat onderzoekers alleen recombinante antilichamen zouden gebruiken, in plaats van polyklonale of zelfs monoklonale antilichamen. Monoklonale antilichamen worden geproduceerd met behulp van hybridoma cellijnen. Jammer genoeg kunnen hybridoma cellijnen afsterven, hun antilichaam-coderende genen verliezen, of niet groeien wanneer ze uit de diepvries worden gehaald.3 Bovendien kunnen door hybridoma geproduceerde monoklonale antilichamen zich binden aan meer dan één doelwit. Daarom kunnen deze problemen worden opgelost door de sequentie te bepalen van het antilichaam dat door het hybridomeer wordt gecodeerd en het antilichaam recombinant te produceren. Bovendien kunnen recombinante antilichamen, vanwege de vastgelegde sequentie, een extra validatielaag bieden ten opzichte van het gebruik van alleen de bovengenoemde technieken.3

  Deze aanvullende validatiemethoden stellen voor om “bewijs te leveren dat een antilichaam zijn doel bindt, en in de meeste gevallen zouden zij ook evaluatie van potentiële kruisreactiviteit onder de geteste omstandigheden mogelijk moeten maken”.2 De oude en nieuwe strategieën zullen echter waarschijnlijk in combinatie moeten worden uitgevoerd om antilichamen naar behoren te valideren.

Het kiezen van de juiste antilichaam validatiemethode

Met al deze problemen rond antilichamen, hoe kiest u de juiste methode?

Voreerst moet u beslissen in welke assay u het antilichaam zult gebruiken. Bij de CRISPR-Cas9-methode bijvoorbeeld wordt het doeleiwit niet gemodificeerd en wordt gevalideerd dat het antilichaam geen kruisreactiviteit vertoont met andere eiwitten. U kunt deze techniek dus gebruiken om antilichamen voor een grote verscheidenheid van tests te valideren, waaronder western blot, IHC, immunocytochemie (ICC), flowcytometrie, ELISA, immunoprecipitatie (IP), chromatine-immunoprecipitatie (ChIP), en omgekeerde-fase-eiwitbepaling.2 Vanwege de moeilijkheden met het tot expressie brengen van een gemodificeerd eiwit, wordt het valideren van een antilichaam met behulp van gemerkte eiwitexpressie echter alleen voorgesteld voor western blots, IHC, ICC en flowcytometrie.

Ten tweede moet de onderzoeker zich bewust zijn van de monsterbeperkingen van dergelijke validatiemethoden. Zowel CRISPR-Cas9/KO als tagged protein expressietechnieken kunnen bijvoorbeeld niet worden gebruikt om antilichamen te valideren in menselijke weefselmonsters en lichaamsvloeistoffen, zoals plasma en serum.2 Dat komt omdat u bij mensen geen genetische manipulatie kunt uitvoeren, in tegenstelling tot in cellijnen.

Ten slotte moet de onderzoeker, ongeacht het antilichaam en de respectieve validatiemethode die door de antilichaamleverancier wordt gebruikt, ten minste één validatiestrategie uitvoeren in hun specifieke toepassing of monstercontext.2

Validatie van elk antilichaam voor uw specifieke toepassing en diersoort is de sleutel tot het bereiken van reproduceerbare en betrouwbare resultaten. De informatie zal u helpen bij het nemen van een beslissing over de geschikte methoden die u in uw laboratorium kunt gebruiken. Voor verdere hulp bij de validatie van antilichamen of andere toepassingen, bezoekt u GenScript Antibody Technical Resources.

Opgenomen van inhoud gecreëerd door BitesizeBio namens GenScript.