Antimicrobiële peptiden: Their Role as Infection-Selective Tracers for Molecular Imaging

Abstract

Antimicrobiële peptiden (AMPs) zijn een heterogene klasse van verbindingen die in een verscheidenheid van organismen, waaronder de mens, worden aangetroffen en, tot nu toe, zijn honderden van deze structuren geïsoleerd en gekarakteriseerd. Zij kunnen worden omschreven als natuurlijke microbiciden, die selectief cytotoxisch zijn voor bacteriën, terwijl zij minimale cytotoxiciteit vertonen voor de zoogdiercellen van het gastheerorganisme. Hun werking berust op hun relatief sterke elektrostatische aantrekkingskracht op de negatief geladen bacteriecellen en een relatief zwakke interactie met de eukaryote gastheercellen. Het vermogen van deze peptiden om zich op te hopen op de plaats van infectie, gecombineerd met de minimale cytotoxiciteit van de gastheer, motiveerde dit overzicht om de rol en het nut van AMPs voor PET te belichten, met de nadruk op hun werkingsmechanisme en de verschillende interacties met de bacteriële cel. Deze details zijn essentiële informatie voor hun selectieve eigenschappen. Wij beschrijven ook de strategie, het ontwerp en het gebruik van deze peptiden als potentiële radiofarmaca aangezien hun combinatie met nucleaire geneeskunde modaliteiten zoals SPECT of PET niet-invasief onderzoek van het gehele lichaam mogelijk zou maken voor de opsporing van occulte infectie die bijvoorbeeld koorts van onbekende oorsprong veroorzaakt.

1. Inleiding

Vergeleken met andere conventionele technologieën kunnen met tomografische beeldvorming ziekteprocessen diep in het lichaam, niet-invasief en betrekkelijk snel worden geëvalueerd. Het is dan ook niet verwonderlijk dat moleculaire beeldvorming het onderzoek van diverse ziekteprocessen sterk heeft verbeterd en een essentieel instrument is geworden op het gebied van de oncologie, zowel voor onderzoek als voor patiëntenzorg . Een ander groot voordeel van beeldvorming is de mogelijkheid om een holistische, driedimensionale beoordeling van het gehele orgaan of lichaam te geven, die minder snel wordt beperkt door steekproeffouten en daarom goed correleert met het algehele ziekteproces. Hoewel de voortdurende vooruitgang op het gebied van moleculaire beeldvorming ongeëvenaarde mogelijkheden heeft geboden voor meer verfijnde methoden om ziekten te monitoren, blijven de instrumenten voor de evaluatie van infectie en ontsteking beperkt. Twee beeldvormingsmethoden die momenteel op grote schaal in de kliniek worden gebruikt, zijn hoge-resolutie computertomografie (CT) die anatomische (en dus late) veranderingen meet, of 18F-gelabelde 2-fluoro-deoxy-D-glucose (18F-FDG)-positronemissietomografie (PET), die een algemene marker van metabolische activiteit is. Aangezien 18F-FDG ook accumuleert op plaatsen van infectie en ontsteking als gevolg van het verhoogde glucosemetabolisme op deze plaatsen, is het dus niet specifiek voor infectie. Daarom werd het steeds belangrijker om meer specifieke en selectieve infectie beeldvormende middelen te ontwikkelen. Rechtstreekse, ex vivo, etikettering van leukocyten wordt beschouwd als de “gouden standaard” voor beeldvorming van infecties met PET. Helaas is dit proces zeer bewerkelijk en tijdrovend en vereist het de hantering van bloedproducten. Als alternatief kunnen indirect gelabelde leukocyten worden verkregen met behulp van radioactief gemerkte moleculen, zoals chemotactische peptiden of cytokinen, die zich binden aan receptoren op de leukocyten. Helaas hebben de biologische effecten van sommige van de leukocytenreceptor-gerichte verbindingen hun klinisch gebruik als infectiespecifieke moleculaire beeldvormingsagentia beperkt. Hoewel de meest gelabelde leukocyten, neutrofielen en lymfocyten, vrij selectief zijn voor infectie, zijn er gevallen waarin zij een infectie niet kunnen opsporen of zich ophopen op niet-geïnfecteerde plaatsen. Indien de infectie geen immuunrespons uitlokt, zullen de gelabelde leukocyten zich niet ophopen op de geïnfecteerde loci, wat het geval kan zijn bij een ernstig immuungecompromitteerde persoon, of in het geval van infectie door bepaalde pathogenen, zoals Mycobacterium tuberculosis of Pneumocystis carinii. Sommige niet-infectieuze immuunaandoeningen, zoals reumatoïde artritis, kunnen ook een immuunrespons uitlokken en de tracer ophopen. Door het gebruik van verschillende tracers zijn verschillende doelgerichte strategieën mogelijk om infectie met PET in beeld te brengen.

Tracers die rechtstreeks interageren met de pathogene microben die verantwoordelijk zijn voor infectie, zijn van nature zeer specifiek voor infectie en zouden zich, in tegenstelling tot gelabelde leukocyten, niet moeten ophopen in steriele ontstekingen. Tot deze soorten tracers behoren radioactief gemerkte antibiotica en antimicrobiële peptiden. Technetium-99m gelabelde ciprofloxacine (-ciprofloxacine) is de meest bestudeerde op antibiotica gebaseerde tracer voor SPECT-infectiebeeldvorming die zich richt op DNA Gyrase, een enzym dat aanwezig is in alle delende bacteriën en waarvan wordt aangenomen dat het zich niet ophoopt in dode bacteriën of steriele ontstekingen. Er hebben zich enkele problemen voorgedaan bij het gebruik ervan als tracer voor SPECT-infectiebeeldvorming met betrekking tot de slechte radiochemische zuiverheid en stabiliteit. Meer recent is gerapporteerd dat lokalisatie bij geïnfecteerde haarden voornamelijk plaatsvindt door verhoogde extravasatie en stagnatie. Dit proces vindt ook plaats op niet-geïnfecteerde plaatsen met verhoogde vasculaire permeabiliteit en -ciprofloxacine kan zich ophopen op plaatsen van steriele ontsteking waardoor de specificiteit voor infectie wordt verminderd.

Antimicrobiële peptiden (AMP) hebben de belangstelling getrokken als potentiële doelvectoren voor de ontwikkeling van PET-tracers ontworpen voor de detectie van infectie. Deze peptiden worden aangetroffen in een verscheidenheid van organismen, waaronder de mens, en tot dusver zijn er honderden geïsoleerd en gekarakteriseerd. Aangenomen wordt dat deze peptiden als breedspectrum-microbiciden fungeren en deel uitmaken van het aangeboren immuunsysteem van veel eukaryoten, waaronder de mens. Ongeacht hun oorsprong delen zij veel gemeenschappelijke eigenschappen, zoals een positieve netto lading, amfipathie en, in de meeste gevallen, membraanactiviteit. Door hun rol in het lichaam als natuurlijk microbicide zijn deze antimicrobiële peptiden selectief cytotoxisch voor bacteriën, terwijl zij minimale cytotoxiciteit vertonen voor cellen van het gastheerorganisme. Aangenomen wordt dat het kationische karakter van de peptiden resulteert in een relatief sterke elektrostatische aantrekking tot negatief geladen bacteriële cellen en een relatief zwakke aantrekking tot de eukaryote gastheercellen, die gewoonlijk minder negatief geladen zijn dan prokaryoten, en verondersteld wordt de basis te vormen van dit celtype-discriminatie. Het vermogen van deze peptiden om zich op te hopen op de plaats van infectie, gecombineerd met hun bijna verwaarloosbare cytotoxiciteit of aantrekkingskracht op gastheercellen, maakt deze peptiden aantrekkelijk als doelvectoren voor PET-beeldvorming van infectie.

2. Overzicht van antimicrobiële peptiden

Antimicrobiële peptiden zijn evolutionair geconserveerde biomoleculen die deel uitmaken van de verdedigingsmechanismen in veel organismen, variërend van prokaryoten tot meercellige dieren zoals de mens. Zij maken deel uit van de eerste verdedigingslinie tegen pathogene microben bij hogere dieren en bij vele lagere levensvormen; zij vormen de enige verdedigingslinie tegen pathogene en saprofytische microben. De selectieve cytotoxiciteit van deze peptiden, waarbij zij de pathogene microben aanvallen en de gastheercellen ongemoeid laten, is het gevolg van de fundamentele verschillen in samenstelling en structuur van de gastheercellen ten opzichte van die van de pathogene bacteriën en gisten. Hoewel sommige AMP’s immunomodulerende effecten en/of chemotactisch gedrag vertonen, is een gemeenschappelijk kenmerk van deze antimicrobiële peptiden dat zij amfipathisch zijn maar een algemene positieve lading bezitten . Ongeveer 1500 antimicrobiële peptiden zijn gekarakteriseerd in een breed scala van organismen en de classificatie van deze peptiden kan gecompliceerd zijn door de grote mate van sequentieverschil tussen de verschillende peptiden. Er is echter getracht een indeling te maken op basis van aminozuursamenstelling en secundaire structuren.

Drie grote groepen (tabel 1) zijn geïdentificeerd, namelijk α-helicale peptiden, cysteïne-bevattende β-sheet peptiden, en flexibele peptiden rijk aan specifieke aminozuren zoals proline, tryptofaan, histidine, arginine, en glycine .

2.1. α-Helical Antimicrobial Peptides

Over ongeveer 30 tot 50% van alle antimicrobiële peptiden geïdentificeerd en bestudeerd tot op heden bevatten overheersende α-helical structuren. Dit kan te wijten zijn aan het relatieve gemak waarmee deze peptiden chemisch kunnen worden gesynthetiseerd, wat een uitgebreide karakterisering in het laboratorium mogelijk maakt. Deze peptiden bestaan meestal uit 12-40 aminozuurresiduen en bevatten een overvloed aan helixstabiliserende residuen zoals alanine, leucine en lysine, maar nooit cysteïne. In waterige oplossingen zijn deze peptiden vaak ongestructureerd, maar zij nemen hun amfipathische α-helixconformatie aan wanneer zij met een celmembraan of in een membraan-imimetische omgeving geassocieerd zijn. Vaak zijn deze peptiden niet strikt α-helixen en kunnen zij een interne knik bevatten.

2.2. β-Sheet Antimicrobiële Peptiden

De andere belangrijke groep van antimicrobiële peptiden zijn die welke typisch twee tot tien cysteïneresiduen bevatten die één tot vijf disulfidebindingen tussen de ketens vormen. Deze bindingsinteractie stelt deze peptiden in staat de β-sheetconformatie aan te nemen. De meeste β-sheet antimicrobiële peptiden maken deel uit van de defensinefamilie en deze peptiden zijn evolutionair geconserveerd bij planten, schimmels, insecten, weekdieren en gewervelde dieren. Defensines bestaan meestal uit twee tot drie antiparallelle β-sheets die gestabiliseerd worden door drie tot vier intramoleculaire disulfidebindingen; in sommige gevallen wordt echter een α-hellicaal of ongestructureerd segment aangetroffen aan de N- of C-terminus. In tegenstelling tot de α-helische antimicrobiële peptiden, die in waterige oplossingen ongestructureerd zijn, behouden de defensines onder dergelijke omstandigheden een compacte bolvormige structuur. Afgezien van de algemene overeenkomst in secundaire structuur bezitten de meeste van zoogdieren afgeleide α-defensines twee bijkomende gemeenschappelijke kenmerken, namelijk een uitstekende lus als gevolg van een geconserveerde arginine/glutamaat zoutbrug en een β-bulge veroorzaakt door een geconserveerd glycine-X-cysteïne (X: een willekeurig aminozuur) motief tussen de eerste en tweede cysteïneresiduen .

2.3. Flexibele antimicrobiële peptiden rijk aan specifieke aminozuren

Een minderheid van antimicrobiële peptiden bevat een hoog aandeel van bepaalde aminozuren zoals proline, tryptofaan, histidine, arginine, en glycine. Tot de representatieve leden van deze klasse behoren het tryptofaanrijke indolicidine van runderen en tritrpticine van varkens, het histidinerijke menselijke histatine, en het arginine- en proline-rijke PR-39 van varkens. Door hun ongewone aminozuursamenstelling hebben deze peptiden zeer variabele secundaire structuren. Het 13-aminozuur indolicidine (ILPWKWPWWPWRR), bijvoorbeeld, neemt een grotendeels verlengde conformatie aan in de aanwezigheid van zwitterionische micellen bestaande uit stoffen zoals dodecyl-fosfocholine of anionisch natrium-dodecylsulfaat.

3. Mechanismen van celspecificiteit en selectiviteit van antimicrobiële peptiden

Inherente verschillen in de microbiële versus de gastheercelsamenstelling en -architectuur van het membraan dragen bij tot de selectiviteit van de antimicrobiële peptiden. Regulering van de expressie of de lokalisatie van de peptiden wordt ook geacht ongewenste interacties met kwetsbare gastheercellen te voorkomen.

3.1. Target Specificity and Selective Cell Toxicity

Een biologisch membraan kan worden beschouwd als eenvoudigweg een vloeibaar mozaïek bestaande uit fosfolipiden, afgewisseld met eiwitten. In verschillende organismen kunnen glyceriden en sterolen ook bijdragen tot de biochemische architectuur en oppervlaktetopologie van dergelijke membranen. Er bestaan echter fundamentele verschillen tussen de membranen van microbiële en dierlijke cellen, waardoor de antimicrobiële peptiden onderscheid kunnen maken tussen deze cellen en selectief de ene boven de andere kunnen worden gericht, zoals geschetst in figuur 1 .

Figuur 1

Membraantargeting van antimicrobiële peptiden en basis van hun selectiviteit (aangepast uit ).

3.2. Membraansamenstelling, lading en hydrofobiciteit

De kerncomponent van bijna alle natuurlijke biomembranen is de fosfolipide-bilaag. Deze bilagen zijn amfipathisch, wat betekent dat ze zowel hydrofobe als hydrofiele gebieden hebben. Eukaryote en prokaryote celmembranen verschillen echter aanzienlijk qua precieze samenstelling en celenergetica (figuur 2). Fosfatidylcholine (PC) en zijn analoog sfingomyeline (SM), alsmede fosfatidylethanolamine (PE), hebben onder fysiologische omstandigheden geen lading. Cholesterol en andere sterolen, zoals ergosterol, die overvloedig voorkomen in eukaryote membranen, maar zeer zelden in prokaryote membranen, zijn in het algemeen ook neutraal geladen (figuur 2) . Gehydroxyleerde fosfolipiden zoals fosfatidylglycerol (PG), cardiolipine (CL), en fosfatidylserine (PS) bezitten onder fysiologische omstandigheden een netto negatieve lading. Men kan zien hoe de lading van het membraan voornamelijk te wijten is aan de verhouding en locatie van de verschillende fosfolipiden, waarbij celmembranen die hoofdzakelijk bestaan uit PG, CL en PS, zoals het geval is in de meeste pathogene bacteriën, zeer elektronegatief zijn, terwijl membranen die rijk zijn aan PC, PE of SP de neiging hebben een netto neutrale lading te hebben, zoals het geval is in celmembranen van zoogdieren.

Figuur 2

Vergelijkende lipidenarchitectuur van microbiële en menselijke cytoplasmamembranen. Cytoplasmamembranen van bacteriële (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, of Bacillus subtilis) en schimmel (Candida albicans) pathogenen worden vergeleken met die van de menselijke erytrocyt wat betreft relatieve samenstelling en verdeling tussen binnen- en buitenmembraanbladen. Membraanbestanddelen variërend van anionisch (links) tot neutraal (rechts) zijn CL, PG, PE, PC, SM, en sterolen (cholesterol of ergosterol, ST). Merk op dat het duidelijke verschil tussen microbiële pathogenen en menselijke erytrocyten gelegen is in de fosfolipidensamenstelling en asymmetrie. Aangenomen wordt dat deze verschillen verantwoordelijk zijn voor de selectieve antimicrobiële peptideaffiniteit voor microbiële cellen versus gastheercellen, voorzover die bestaat voor een bepaald antimicrobieel peptide. Sleutels: open, E. coli; horizontaal arcerend, S. aureus; gearceerd, B. subtilis; geruit, C. albicans; effen, menselijke erytrocyt (aangepast van ).

3.3. Membraanasymmetrie

Hoewel celmembranen noch symmetrisch, noch statisch zijn, kunnen verschillen tussen zoogdier- en microbiële fosfolipidebilagen dienen als potentiële doelwitten voor antimicrobiële peptiden. In sommige cellen, zoals de rundererytrocyt, bevindt zich slechts 2% van het totale PE-gehalte op het buitenste membraanblad. Verschillen in membraansymmetrie, verzadiging van fosfolipide bilagen, en compositorische stoichiometrie zullen de vloeibaarheid van het membraan en de faseovergang beïnvloeden. Op soortgelijke wijze kan ook de lading van het binnenste en buitenste blad van de cellulaire bilaag verschillend zijn. Microbiële liganden en receptoren als doelwitten voor antimicrobiële peptiden

Uit experimenten is gebleken dat D- en L-aminozuur versies van antimicrobiële peptiden vergelijkbare bindingsaffiniteiten vertonen met doelcellen, hetgeen suggereert dat stereospecifieke receptoren niet betrokken zijn bij de targeting van pathogene cellen . Verschillende studies lijken dit echter te weerleggen en suggereren dat bepaalde eiwitten die zich in het microbiële celmembraan bevinden, kunnen dienen als bindende doelwitten voor bepaalde klassen van antimicrobiële peptiden, zoals histatines. Dit zou de bevindingen ondersteunen waarom histadines betrokken zijn bij lokale verdedigingsmechanismen met bepaalde soorten pathogenen en zijn teruggevonden in tand- of huidwonden. Sommige onderzoekers stellen ook dat anionische componenten van celmembranen, bijvoorbeeld CL, PG, of lipopolysaccharide (LPS), kunnen dienen als pseudoreceptoren, die de initiële interactie tussen het antimicrobiële peptide en het microbiële celtarget mogelijk maken. Antimicrobieel bindende receptoren kunnen dus een alternatieve weg zijn van AMP-interactie met de bacteriële celenvelop.

3.5. Transmembraanpotentiaal

Het transmembraanpotentiaal is nog een andere manier waarop microbiële en zoogdiercellen van elkaar verschillen, en wel in de ladingsscheiding die bestaat tussen de binnenste en buitenste lagen van het cytoplasmamembraan. Een elektrochemische gradiënt die het gevolg is van de verschillende snelheid waarmee protonen over het celmembraan worden uitgewisseld, wordt het transmembraanpotentiaal (Δψ) genoemd. Een normale zoogdiercel heeft een Δψ tussen -90 en -110 mV. Ziekteverwekkende bacteriën daarentegen vertonen doorgaans een Δψ in het bereik van -130 tot -150 mV. Dit aanzienlijke verschil in elektrochemische potentiaal kan een andere factor zijn die antimicrobiële peptiden in staat stelt onderscheid te maken tussen gastheer- en doelwitcellen .

4. Selective Toxicity Based on Antimicrobial Peptide Design

In het waterige intercellulaire milieu wordt aangenomen dat veel antimicrobiële peptiden uitgebreide of ongestructureerde conformaties aannemen, hoewel dit misschien niet het geval is als er intramoleculaire bindingen aanwezig zijn, die een specifieke conformatie in een verscheidenheid van omgevingen zullen verzekeren als gevolg van geïnduceerde rigiditeit. Zodra het antimicrobiële peptide zich aan het celmembraan van een pathogene microbe bindt, kan het aanzienlijke conformatieveranderingen ondergaan en een specifieke conformatie aannemen, zoals een α-helix. Studies suggereren dat dynamische en/of inherente conformaties van antimicrobiële peptiden van invloed zijn op hun selectieve cytotoxiciteit. Bovendien kunnen antimicrobiële peptiden een conformatieverandering, zelf-associatie of oligomerisatie ondergaan binnen het membraan van het doelpathogeen, maar niet binnen het membraan van de gastcel om de celspecifieke toxiciteit te verhogen. Zhang en collega’s gebruikten synthetische testpeptiden die uniform kationisch waren, maar varieerden in conformatie en verlengde, cyclische, α-helische en β-sheet structuren omvatten. Er werd vastgesteld dat alle testpeptiden in staat waren tot interactie met en penetratie door lipidemonolagen bestaande uit PG, een negatief geladen fosfolipide. Echter, alleen de α-helische en verlengde peptiden waren in staat tot interactie met het meer neutraal geladen PC membraan. In dezelfde studie werd ook vastgesteld dat β-sheet peptiden in staat waren om fosfolipiden te transloceren van het binnenste naar het buitenste blad bij concentraties die lager waren dan die welke nodig waren om het membraan te permeabiliseren. Evenzo toonden Kol en medewerkers aan dat peptiden met een vergelijkbare conformatie, maar rijk aan histidine en lysine en zonder tryptofaan, ook in staat waren om significante niveaus van fosfolipide translocatie te induceren. Uit deze studies kan worden geconcludeerd dat antimicrobiële peptiden niet alleen interageren met fosfolipidemembranen van slechts specifieke samenstelling en symmetrie, maar dat zij ook in staat zijn om de hermodellering van de membranen in specifieke cellen te beïnvloeden.

4.1. In Vivo Preferentiële Affiniteit voor Microbiële versus Zoogdiercellen

Welling en collega’s voerden een in vivo experiment uit waarbij zij de bindingsaffiniteit testten van een radioactief gemerkt fragment van het kationische ubiquicidine antimicrobiële peptide -UBI 29-41 voor microbiële cellen in vergelijking met gastheercellen. In de studie werden dieren geïnfecteerd met Candida albicans, Klebsiella pneumonia, of Staphylococcus aureus. Steriele ontstekingen werden ook opgewekt in de dijspieren van de dieren door injectie van door verhitting gedode micro-organismen of gezuiverde LPS, om als controle te dienen. De radioactief gemerkte peptiden stapelden zich in aanzienlijke mate op in de geïnfecteerde plaatsen in vergelijking met steriele of niet-geïnfecteerde ontstoken lichaamsdelen. Dit in vivo experiment toonde aan dat de peptiden onderscheid konden maken tussen gastheer- en microbiële cellen en zich ook ophoopten op de geïnfecteerde plaatsen. Door middel van scintigrafische metingen werd vastgesteld dat de radioactief gemerkte peptiden zich snel ophoopten in geïnfecteerde weefsels en dat de ophopingssnelheid in geïnfecteerde weefsels tot vijfmaal hoger was dan in niet-geïnfecteerde weefsels. Deze snelle lokalisatie werd geïnterpreteerd als zouden de peptiden een hogere of preferentiële affiniteit hebben voor het celoppervlak van het doelwit in vergelijking met dat van het celoppervlak van de gastheer.

4.2. De lokalisatie van cytotoxische antimicrobiële peptiden beperkt de blootstelling van kwetsbare gastheerweefsels

Het is mogelijk dat de cytotoxiciteit van gastheercellen in veel meercellige organismen wordt beperkt door hun lokalisatie in weefsels die niet kwetsbaar zijn voor hun cytotoxische effecten. Bij de meeste dieren worden deze peptiden door cellen uitgescheiden op relatief inerte en robuuste oppervlakken, zoals de epithelia van de darmen of de longen, of bij amfibieën, op de huid. Op deze plaatsen is de kans op interactie met potentieel schadelijke microben het grootst, en de expressie van de meeste antimicrobiële peptiden is hetzij constitutief, hetzij snel induceerbaar, zodat zij deel kunnen uitmaken van de eerste verdediging tegen ziekteverwekkers . Een andere manier om gevoelig gastheerweefsel tegen antimicrobiële peptiden te beschermen is door ze op te nemen in korrels in de fagocyterende leukocyten, die de ziekteverwekkers opslokken en blootstellen aan dodelijke concentraties antimicrobiële peptiden en oxidatiemiddelen. De defensineklasse van antimicrobiële peptiden wordt op deze wijze ingezet, aangezien zij tot de meest toxische en minst selectieve van de door de gastheer geproduceerde antimicrobiële peptiden behoren. De lichtzure micro-omgeving binnen het rijpe fagolysosoom is ook de meest effectieve omgeving voor de defensines, aangezien zij onder deze omstandigheden een maximale cytotoxiciteit vertonen. Mechanismen van de werking van antimicrobiële peptiden

De over het algemeen geconserveerde structuren van antimicrobiële peptiden, in een grote verscheidenheid van organismen, geven enkele aanwijzingen over hun werkingsmechanismen. Onder fysiologische omstandigheden zijn zij bijna uitsluitend amfipathisch en kationisch, hetgeen hun selectiviteit op doelcellen ten goede zou komen. Het ideale antimicrobiële peptide moet een lage cytotoxiciteit voor de gastheercel hebben, maar toxisch zijn voor een breed scala van pathogene microben. De antimicrobiële determinanten moeten gemakkelijk toegankelijk zijn en mogen niet aan verandering of wijziging onderhevig zijn. In het algemeen hebben antimicrobiële peptiden amfipathische structuren waardoor zij kunnen interageren met fosfolipidemembranen, structuren die essentieel zijn voor alle pathogenen . Parameters zoals conformatie (), hydrofobiciteit (), hydrofoob moment (), lading (), polaire hoek (), en amfipathiciteit () zijn alle belangrijk voor de werking van antimicrobiële peptiden. Bovendien zijn al deze determinanten onderling gerelateerd en zal wijziging van een van deze kenmerken leiden tot wijziging van de andere

5.1. Conformatie ()

Hoewel antimicrobiële peptiden in een groot aantal gastheerorganismen kunnen worden aangetroffen en verschillende aminozuursequenties hebben, kunnen zij op basis van hun secundaire structuur in een paar discrete groepen worden ingedeeld. De twee grootste groepen omvatten peptiden met een β-blad of α-helix secundaire structuur. De meerderheid van de resterende antimicrobiële peptiden zijn die welke een ongewoon hoog aandeel hebben van één of meer aminozuren zoals tryptofaan of proline en arginine. De α-helicale peptiden worden vaak aangetroffen in de intercellulaire vloeistof van insecten en amfibieën en nemen in het algemeen in waterige oplossing een ongestructureerde of verlengde conformatie aan, waarbij zij pas bij interactie met een fosfolipidemembraan hun spiraalvormige structuur aannemen. De reden hiervoor is dat de intramoleculaire waterstofbruggen die nodig zijn voor een α-helic conformatie worden verstoord in een polair oplosmiddel zoals water. In een membraan worden de polaire waterstofbruggen afgeschermd van het lipofiele (apolaire) membraanmilieu door de α-helicatie. De helixconformatie stelt ook de apolaire zijketens bloot aan het neutrale lipide milieu in het membraan. Hoewel de primaire structuur van de β-sheet klasse van antimicrobiële peptiden een zekere mate van ongelijksoortigheid in aminozuursequentie vertoont, hebben zij alle gemeenschappelijke kenmerken met betrekking tot de amfipathische structuur, waarbij zij verschillende hydrofiele en hydrofobe domeinen bezitten. De meeste antimicrobiële peptiden zijn in het algemeen kationisch en hebben ladingen variërend van +2 tot +9, waarbij vele sterk negatief geladen domeinen bezitten. Deze positieve lading is belangrijk voor de aantrekkingskracht op en de interactie met de anionische celmembranen van bacteriën en andere pathogene micro-organismen. Ook de relatief minder anionische membranen van de gastheer trekken de antimicrobiële peptiden niet elektrostatisch aan en kunnen de peptiden een zekere selectiviteit op de doelcellen verlenen. Pathogene bacteriën zijn over het algemeen rijk aan zure fosfolipiden zoals CL, PG en PS. Daarnaast geven de teichoëzuur- en teichuronzuren van de celwanden van Gram-positieve bacteriën en de LPS van Gram-negatieve bacteriën een extra elektronegatieve lading aan het bacteriële celoppervlak. Er is vastgesteld dat de Δψ van bacteriën doorgaans 50% hoger is dan die van zoogdiercellen en er is geopperd dat antimicrobiële peptiden op elektroforetische wijze op het oppervlak van pathogene microben kunnen worden geconcentreerd. Hoewel vele studies de kationiciteit van antimicrobiële peptiden in verband konden brengen met hun antimicrobiële activiteit, bestaat er geen strikt lineair verband. Dathe en medewerkers toonden in studies met analogen van magainine aan dat verhoging van de kationiciteit van +3 tot +5 resulteerde in een toename van de antibacteriële activiteit tegen zowel Gram-positieve als Gram-negatieve soorten. Zij merkten echter op dat er een grens was aan de kationiciteit, waarna een toename van de positieve lading de antibacteriële activiteit niet langer deed toenemen. Aangenomen wordt dat deze afname van de antibacteriële activiteit het gevolg is van het feit dat de peptiden zo sterk aan de negatief geladen fosfolipide hoofdgroep binden dat translocatie van het peptide in de cel onmogelijk is. Amfipathiciteit () en hydrofoob moment ()

Amfipathiciteit is een bijna universeel kenmerk onder antimicrobiële peptiden en wordt bereikt door een aantal verschillende peptidestructuren. De amfipathische α-helix is een van de meest voorkomende en eenvoudigste van deze kenmerken. Door de afwisseling van anionische en kationische aminozuurresiduen op elke drie tot vier posities kan het peptide een secundaire structuur aannemen die een optimale elektrostatische interactie met amfipathische fosfolipidemembranen mogelijk maakt (figuur 3). Door deze eigenschap kan het peptide cytotoxische activiteit uitoefenen op niet alleen negatief geladen celmembranen, maar ook op die met een neutrale lading of amfipathisch van aard .

Figuur 3

Statistische analyse van de residuverdeling in de 20-residue N-terminale stretch α-helicale AMP’s uit natuurlijke bronnen. Een grafische voorstelling van de frequentie van verschillende soorten residu’s op elke positie op een spiraalvormige wielprojectie wordt getoond. De ongelijke verdeling van hydrofobe en geladen peptiden draagt bij tot de amfipathische aard van het peptide (aangepast van Tossi et al. ).

Amfipathiciteit van een peptide kan worden beschreven door zijn hydrofoob moment () dat kan worden berekend als de vectoriële som van de individuele aminozuurhydrofobiciteiten, genormaliseerd naar een ideale helix. Een toename van het hydrofoob moment correleert met een verhoogde permeabilisatie van het doelcelmembraan. Dit is vooral belangrijk bij interacties met lipidemembranen die neutraal geladen zijn, waar ladingsfactoren waarschijnlijk niet de vereiste aantrekkingskracht op en interactie met het doelcelmembraan tot stand kunnen brengen. Evenals de α-helicale antimicrobiële peptiden vertonen ook de β-sheet gastheerbeschermende peptiden amphipathiciteit. Dit komt tot uiting in een variabel aantal β-strengen die hydrofobe en hydrofiele oppervlakken vormen. De β-strengen, die vaak antiparallel zijn, worden gestabiliseerd door disulfidebindingen op regelmatige afstanden of door cyclisatie van de peptide-backbone. Door deze intramoleculaire binding behouden β-sheet antimicrobiële peptiden een stijve conformatie, zelfs in waterige extracellulaire vloeistof, en wordt ook multimerisatie vergemakkelijkt, aangezien de hydrofobe oppervlakken zullen samenklonteren om blootstelling aan het waterige milieu te vermijden. Hoewel het exacte mechanisme waarmee amfipathische antimicrobiële peptiden membraanverstoring in het celmembraan bewerkstelligen momenteel nog niet is vastgesteld, grotendeels omdat de exacte conformatie van de peptiden in de membranen niet bekend is, hebben studies aangetoond dat gesegregeerde amfipathiciteit in zowel α-helicale als β-sheet antimicrobiële peptiden een diepgaand effect heeft op peptideverstoring van natuurlijke biomembranen .

5.4. Hydrophobicity ()

De hydrofobiciteit van een peptide kan worden gedefinieerd als het percentage hydrofobe aminozuurresiduen waaruit de primaire structuur bestaat. Voor de meeste antimicrobiële peptiden bedraagt de hydrofobiciteit ongeveer 50% en is zij essentieel voor de werking van het peptide, aangezien zij het peptide in staat stelt tot interactie met en penetratie in de fosfolipide bilaag. Hoewel een zekere mate van hydrofobiciteit essentieel is voor de werking van het antimicrobiële peptide, zal een te grote hydrofobiciteit de kans vergroten dat het de cellen van de gastheer vernietigt en de specificiteit voor microbiële cellen verminderen. Wieprecht en collega’s bestudeerden het verband tussen de hydrofobiciteit van peptiden en hun vermogen om biomembranen te permeabiliseren. Met behulp van magainine-analogen als model antimicrobiële peptiden, waren zij in staat om factoren zoals hydrofoob moment, heliciteit, en lading vrijwel constant te houden, terwijl zij analogen van variabele hydrofobiciteit produceerden. Hun experimenten toonden aan dat hydrofobiciteit weinig of geen effect had op het vermogen van het peptide om zich aan het membraan te binden of het te permeabiliseren wanneer het uitsluitend uit PG bestond. Echter, in membranen bestaande uit een 3 : 1 verhouding van PC : PG, hadden de peptiden met de hoogste hydrofobiciteit een ongeveer 60-voudig hoger permeabiliserend vermogen dan het minst hydrofobe peptide, en in membranen bestaande uit alleen PC was er een 300-voudig verschil.

5.5. Polar Angle ()

De polaire hoek van een peptide verwijst naar de relatieve verhouding van polaire en niet-polaire facetten van het peptide dat in een amfipathische helix is gevormd. Een spiraalvormig peptide waarvan het ene facet geheel uit polaire aminozuurresiduen bestaat en het andere facet geheel uit apolaire residuen, zou een polaire hoek van 180° hebben. Minder scheiding tussen de domeinen, of een overvloed aan hydrofobe residuen, zou leiden tot een lagere polaire hoek. Studies uitgevoerd door Uematsu en Matsuzaki op zowel synthetische als natuurlijk voorkomende peptiden hebben aangetoond dat een lagere polaire hoek en dus een meer hydrofoob facet meer bevorderlijk is voor membraanpermeabilisatie. De polaire hoek is ook gecorreleerd met de stabiliteit van peptide-geïnduceerde poriën in biomembranen. Zij toonden ook aan dat antimicrobiële peptiden met kleinere polaire hoeken in staat waren om hogere niveaus van membraanpermeabilisatie en -translocatie te induceren dan peptiden met grotere polaire hoeken. De poriën gevormd door de peptiden met kleinere polaire hoeken waren echter minder stabiel dan die gevormd door peptiden met grotere polaire hoeken. Hydrofobe en hydrofiele eigenschappen van antimicrobiële peptiden spelen een cruciale rol bij de interacties met en permeabilisatie van fosfolipide celmembranen. Hoewel er in de natuur een grote verscheidenheid van antimicrobiële peptiden bestaat, zijn de belangrijkste kenmerken en secundaire structuren bewaard gebleven. Extremen van kenmerken zoals amfipathiciteit, lading, hydrofoob moment, of polaire hoek zijn niet gunstig, omdat zij de neiging om ofwel antimicrobiële activiteit compromitteren of leiden tot verhoogde gastheercel cytotoxiciteit. De minimale lading die peptiden moeten bezitten om enige vorm van antimicrobiële activiteit te kunnen uitoefenen, blijkt +2 te zijn. Deze minimale kationiciteit is belangrijk omdat zij de initiële elektrostatische aantrekking tot het bacteriële membraan, dat negatief geladen is, mogelijk maakt. Het maakt ook de verplaatsing mogelijk van andere kationen die reeds aan het celmembraan van het doelwit gebonden zijn en de translocatie naar het inwendige van de membraanbilaag. Evenzo moet de hydrofobiciteit van het peptide matig zijn, aangezien zeer hydrofobe antimicrobiële peptiden zich zouden richten op membranen met een netto-neutrale lading, zoals de gastheercellen, hetgeen zou leiden tot een vermindering van de doelselectiviteit en schade aan het gastheerorganisme. Hieruit blijkt dat de selectieve targeting van pathogene microben grotendeels het gevolg is van een evenwicht tussen elektronegativiteit en hydrofobiciteit van de antimicrobiële peptiden.

6. Initiële interacties met het doelcelmembraan

De initiële interactie tussen het antimicrobiële peptide en het fosfolipidemembraan van de cel is belangrijk omdat deze de selectiviteit van de doelcel bepaalt en ook van invloed is op eventuele latere interacties met de doelcel. De eerste interacties worden grotendeels bepaald door fysische en chemische kenmerken van zowel het antimicrobiële peptide als het membraan van de doelcel. Elektrostatische interacties

Elektrostatische interacties worden algemeen geacht verantwoordelijk te zijn voor de initiële targeting van de microbiële cel. Een studie van Matsuzaki correleerde de kationiciteit van antimicrobiële peptiden met hun vermogen tot membraanbinding, en het feit dat kationiciteit een geconserveerd kenmerk is van bijna alle antimicrobiële peptiden in een breed scala van organismen ondersteunt dit argument nog verder. Elektrostatische krachten werken over een groot bereik en de overvloed aan lysine- en arginineresiduen in antimicrobiële peptiden, die worden aangetrokken door de negatief geladen fosfaatgroepen van biomembranen, verleent verdere geloofwaardigheid aan de theorie dat deze interacties verantwoordelijk zijn voor de initiële aantrekking tot het celmembraan van het doelwit. In Gram-negatieve bacteriën wordt aangenomen dat de antimicrobiële peptiden de kationen verdringen die normaal met het LPS geassocieerd zijn, aangezien antimicrobiële peptiden een bindingsaffiniteit voor het LPS bezitten die ongeveer drie orden van grootte groter is dan de tweewaardige kationen die gewoonlijk met dit deel geassocieerd zijn. Bacteriestammen waarvan het LPS sterk gesubstitueerd is met 4-amino-4-deoxy-L-arabinose of sterk geacyleerd is, vertonen een grotere resistentie tegen positief geladen antimicrobiële peptiden, waardoor de theorie dat de elektrostatische lading belangrijk is voor de interactie met het doelcelmembraan, nog geloofwaardiger wordt. Gram-positieve bacteriën hebben geen LPS of buitencelmembraan, maar wel een dikke celwand die bestaat uit teichuron- of teichoëzuurpolymeren. Deze sterk anionische structuren zijn ideale doelwitten voor de kationische antimicrobiële peptiden. Stammen van Staphylococcus aureus waarvan de teichoëzuren zijn gemodificeerd, waardoor de anionische lading is toegenomen, zijn gevoeliger voor kationische antimicrobiële peptiden. Het feit dat de meeste bacteriën een sterke elektrochemische gradiënt (Δψ) hebben ten opzichte van zoogdiercellen, zou ook de doelselectiviteit van antimicrobiële peptiden verhogen. Sommige studies hebben aangetoond dat zowel natuurlijk voorkomende als synthetische peptiden even goed met het membraan interageren, ongeacht of D-amino of L-aminozuren worden gebruikt. Dit zou suggereren dat interacties met biomembranen niet afhankelijk zijn van receptor-ligand mechanismen; andere studies hebben echter aangetoond dat dit wellicht niet het geval is met alle antimicrobiële peptiden. Nisine, een natuurlijk voorkomend cyclisch peptide met een krachtige antimicrobiële werking, blijkt zich specifiek te binden aan bacterieel membraangebonden lipide II . Evenzo is aangetoond dat tachyplesine een specifieke affiniteit heeft voor LPS. De gegevens uit deze studies suggereren dat receptorgemedieerde binding belangrijk is voor celtargeting in een klein aantal antimicrobiële peptiden.

7. Gebeurtenissen na initiële membraanbinding

Experimentele bepaling van initiële aantrekkingskracht van peptiden tot en interactie met celmembranen is gewoonlijk eenvoudiger dan bepaling van interacties die hierop volgen. Een verscheidenheid van methodologieën zoals circulair dichroïsme, röntgenkristallografie, kernspinresonantie, omgekeerde fase hogedrukvloeistofchromatografie en oppervlakteplasmonresonantie, naast andere technieken, zijn gebruikt om peptide-membraaninteracties te verduidelijken. Er wordt echter gesuggereerd dat de antimicrobiële doeltreffendheid en mechanismen uiterst gevoelig zijn voor omstandigheden zoals pH, osmotische sterkte, viscositeit van de oplossing en temperatuur, zodat alle gegevens die met bovengenoemde technieken zijn verkregen met betrekking tot deze omstandigheden moeten worden bekeken. Na de initiële membraanbinding dringen antimicrobiële peptiden door het buitenste fosfolipidemembraan, een fase die wordt aangeduid als drempelconcentratie, en kunnen zo hun cytotoxische werking in het inwendige van de cel uitoefenen. Voor het binnendringen van de peptiden in de cel is een minimumaantal, of drempelconcentratie, antimicrobiële peptiden nodig om zich aan het oppervlak van het lipidemembraan op te hopen. Deze gebeurtenis kan worden beïnvloed door andere factoren dan concentratie, zoals het vermogen van de peptiden om te multimeriseren en ook kenmerken van het fosfolipidemembraan zelf, zoals de lipidensamenstelling, de grootte van de hoofdgroepen en de vloeibaarheid. Het transmembraanpotentiaal van de bilaag kan ook de manier beïnvloeden waarop het peptide het membraan binnenkomt, aangezien een hoogst negatief transmembraanpotentiaal porievorming zal vergemakkelijken door het positief geladen peptide in het membraan te trekken.

8. Veranderingen in peptideconformatie bij interactie met het membraan

Veel antimicrobiële peptiden, vooral die met α-helische secundaire structuren ondergaan significante conformationele herschikking bij het binnengaan van het apolaire milieu van het binnenmembraan. De α-helicale antimicrobiële peptiden zijn normaal ongeordend in de extracellulaire omgeving, vertonen willekeurige spoel- of verlengde structuren, maar conformeren zich snel aan een gestructureerde α-helix wanneer ze geassocieerd worden met het biomembraan. Sommige antimicrobiële peptiden kunnen deze conformatieverandering alleen ondergaan in associatie met een negatief geladen bilaagmembraan. Dit kan te wijten zijn aan de manier waarop de lipiden in dergelijke membranen zijn gerangschikt, waarbij de fosfolipide hoofdgroepen een optimale periodiciteit van de kationische aminozuurresiduen in het peptide induceren, wat op zijn beurt een correcte conformatie in de schroefvormige secundaire structuur bevordert. Er is gesuggereerd dat deze eigenschap ervoor zorgt dat de antimicrobiële peptiden alleen in de aanwezigheid van het celmembraan van het doelwit, in dit geval een negatief geladen bacterie, worden “geactiveerd” tot de cytotoxische vorm, en niet lukraak gastheercellen beschadigen die geen doelwit zijn. De intramoleculaire disulfidebindingen in β-sheet peptiden zorgen ervoor dat zij hun secundaire structuur behouden, zelfs in een waterige omgeving, en dat zij dus niet de drastische conformatieherschikkingen ondergaan die bij α-helische peptiden worden waargenomen, hoewel quaternaire peptidestructuren bij het binnendringen van het membraan uit elkaar kunnen vallen, hetgeen selectieve toxiciteit in de hand zou kunnen werken. Na de eerste interactie met het celmembraan kunnen veel peptiden zelfassociatie ondergaan die, in combinatie met lipide-peptide-interacties, kan leiden tot het ontstaan van complexe structuren die bijdragen tot de cytotoxische effecten van het peptide. De aminozuursequentie en de conformatie van het antimicrobiële peptide in monomere vorm zullen bepalend zijn voor zijn vermogen om deze structuren te vormen. In amfipathische peptiden kunnen de hydrofobe domeinen interageren met de apolaire hydrofobe kern van de lipide bilaag, waardoor het peptide dieper in het membraan wordt gedreven. Als alternatief kunnen zij ook interageren met de hydrofobe facetten van andere peptiden, waardoor multimerisatie wordt bevorderd in een poging om blootstelling van deze facetten aan het waterige milieu te voorkomen. Dit type multimerisatie en interactie met het inwendige van de lipidebilaag kan ertoe leiden dat zich in het biomembraan poriën of kanalen vormen die met peptiden zijn bekleed, hetgeen tot verlies van integriteit en permeabilisatie leidt. Aangezien biomembranen zeer variabel zijn qua samenstelling en structuur, is het mogelijk dat een peptide zich op een aantal verschillende manieren gedraagt wanneer het geassocieerd wordt met verschillende celmembranen. Verschillende modellen zijn voorgesteld om de porievorming te beschrijven die wordt waargenomen in membranen die zijn blootgesteld aan antimicrobiële peptiden.

8.1. Het Vat-Staaf Model

Dit mechanisme van membraan porie vorming is zo genoemd omdat de transmembraan peptiden, of peptide complexen, die het kanaal bekleden in een ton-achtige ring zijn gepositioneerd, waarbij de peptiden transmembraan notenbalken vormen. Amfipathische peptiden zijn zo georiënteerd dat de hydrofobe domeinen interageren met de apolaire koolwaterstofstaarten die zich in het inwendige van het lipidemembraan bevinden, terwijl de hydrofiele domeinen zo zijn georiënteerd dat zij naar het waterige kanaal van de porie zijn gericht en de bekleding ervan vormen. Aanvankelijk accumuleren de monomere peptiden aan het celoppervlak en ondergaan zij een conformatieverandering wanneer zij in contact komen met het membraan (figuur 4). Aangenomen wordt dat hierdoor de fosfolipide hoofdgroepen opzij worden geduwd en het membraan wordt verdund. Hierdoor kan het hydrofobe deel van het peptide het apolaire binnenste van het membraan binnendringen, terwijl de kationische aminozuren van het antimicrobiële peptide interageren met de negatief geladen hoofdgroepen. Wanneer de drempelconcentratie van de peptiden wordt bereikt, kunnen de peptidemonomeren aggregeren tot multimeren, waardoor de peptiden verder in het hydrofobe centrum van het membraan worden gedrukt, aangezien de aggregatie voorkomt dat de hydrofiele delen van het peptide worden blootgesteld aan de hydrofobe delen van het binnenmembraan (figuur 4(a)). Naarmate steeds grotere aantallen peptidemonomeren aggregeren, wordt de porie in het membraan groter.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

8.2. Het toroïdale porie- of worm-gatmechanisme

Dit mechanisme van porievorming is goed bestudeerd met behulp van de α-helicale magainine-peptiden. Bij contact met het geladen celmembraan, nemen de ongeorganiseerde peptiden de α-helische structuur aan. Aanvankelijk oriënteren de helixen zich zo dat zij evenwijdig zijn met het membraanoppervlak. De polaire fosfolipide hoofdgroepen worden verplaatst en het membraanoppervlak wordt verzwakt, wat resulteert in een positieve krommingsspanning in het membraan. Als gevolg van deze rek en verdunning wordt het membraan gedestabiliseerd en wordt het vatbaarder voor verdere peptide-interacties. Zodra een drempelconcentratie van peptiden is bereikt, heroriënteren de peptiden zich zodat zij loodrecht op het membraan staan en beginnen te multimeriseren, zodat de hydrofiele delen van de peptiden niet in contact komen met de hydrofobe delen van het membraan (figuur 4(b)). De nieuw gevormde toroïdale porie is onstabiel en bij het uiteenvallen wordt een deel van de peptiden in het binnenste blad van het celmembraan geduwd. Daarom wordt aangenomen dat de desintegratiestap van deze voorbijgaande poriën belangrijk is omdat zij de peptiden in staat stelt zich naar de intracellulaire ruimte te transloceren, waar zij op andere doelwitten kunnen inwerken. Het Tapijtmodel

Het tapijtmodel van membraanpermeabilisatie is gebaseerd op diffuse werking van vele monomere peptiden op het celmembraan. Wanneer voldoende hoge concentraties van bepaalde antimicrobiële peptiden op het celmembraan aanwezig zijn, worden sommige fosfolipiden van het membraan verplaatst, waardoor de vloeibaarheid van het membraan verandert of de barrière-eigenschappen van het membraan worden verzwakt. Het cumulatieve effect van deze verplaatsingen is dat het membraan wordt verzwakt en zijn integriteit verliest. Zoals eerder gezegd, worden de antimicrobiële peptiden aanvankelijk door elektrostatische aantrekkingskrachten op het membraan aangetrokken. Er worden geen specifieke kanalen of poriën gevormd en aangenomen wordt dat permeabilisatie en verlies van membraanintegriteit het gevolg zijn van de ongunstige energetische eigenschappen die de dispersie van de fosfolipiden teweegbrengt (figuur 4(c)).

9. Impact of Bacterial Infections to Human Health and Traditional Methods of Infection Diagnosis

Geschat wordt dat tot 85% van de patiënten die in het ziekenhuis ernstig ziek zijn, koorts hebben maar geen andere uiterlijke tekenen van infectie vertonen. Aangezien langdurige episoden van koorts fataal kunnen zijn, is het van essentieel belang dat een onderliggende infectie zo snel mogelijk wordt opgespoord, zodat de juiste behandeling kan worden ingesteld. Traditionele diagnosemethoden kunnen onderzoek van weefselbiopsieën en het kweken van pathogenen omvatten, een vaak onnauwkeurige en tijdrovende taak die het begin van de behandeling kan vertragen. Diagnostische beeldvormingsprocedures worden ook gebruikt en kunnen computertomografie (CT) of magnetische resonantie beeldvorming (MRI) omvatten. Met deze technieken kunnen infecties in een vroeg stadium echter meestal niet worden opgespoord, omdat er morfologische veranderingen in de weefsels moeten optreden, een kenmerk dat meestal met gevorderde infecties wordt geassocieerd. Bovendien zijn ze meestal gericht op specifieke delen van het lichaam, wat betekent dat het mogelijk is dat de infectie wordt gemist, of dat de ware omvang van de infectie niet wordt gedetecteerd. Met gallium-radiolabel gemerkte antilichamen of -immunoglobulinen of complexen zoals 67/68Ga-citraat kunnen worden gebruikt om met behulp van SPECT- of PET-scanning de gebieden aan te wijzen waar leukocytentransport plaatsvindt. Met deze technieken kan echter geen definitief onderscheid worden gemaakt tussen geïnfecteerde weefsels en weefsels die ontstoken maar steriel zijn, aangezien in beide gevallen leukocytentransport optreedt. Gezien de hoge specifieke affiniteit van natuurlijk voorkomende antimicrobiële peptiden voor pathogene bacteriën of schimmels, in tegenstelling tot cellen van het gastheerorganisme, werd overwogen dat zij zouden kunnen worden gebruikt om de resolutie van diagnostische beeldvormingsprocessen te helpen .

9.1. Het gebruik van antimicrobiële peptiden als radiofarmaceutica

In principe moet een radiofarmaceutisch middel dat voor beeldvorming van infecties wordt gebruikt, een snelle detectie van bacteriën en een snelle klaring uit de niet-geïnfecteerde plaatsen mogelijk maken. Het moet ook een hoge en specifieke opname op de geïnfecteerde plaats vertonen, met minimale hoeveelheden die zich ophopen in steriel of niet-doelweefsel. De verbinding moet ook een lage toxiciteit hebben en mag geen immuunrespons opwekken. Zeer belangrijk is dat het onderscheid kan maken tussen een steriele en een geïnfecteerde ontsteking. Aangezien antimicrobiële peptiden over het algemeen een breed werkingsspectrum hebben tegen een breed scala van ziekteverwekkende gisten en bacteriën, zijn zij ideale doelmoleculen voor infecties waarbij de vermoedelijke ziekteverwekker niet is geïdentificeerd. Bovendien vereist hun werkingswijze dat zij zich fysiek met de ziekteverwekker associëren, zodat zij een gamma- of positronuitzendende bron, zoals technetium-99m (99mTc) of gallium-67 (67Ga), naar de exacte plaats van de infectie kunnen brengen. Hun gebrek aan affiniteit voor de cellen van het gastheerorganisme betekent ook dat zij zich niet ophopen in steriele ontstoken weefsels. Radioactief gemerkte antimicrobiële peptiden zijn ook aantrekkelijk omdat zij snel uit het bloedvatenstelsel worden verwijderd en door het lichaam worden uitgescheiden. Bovendien zijn zij ook in staat door te dringen in de extravasculaire weefsels en zich zo in zeer korte tijd op te hopen op geïnfecteerde plaatsen. Idealiter zou de radiolabelingsprocedure van een doelmolecule het mogelijk moeten maken een radionuclide stevig aan de molecule te hechten zonder dat dit een nadelige invloed heeft op het doelgericht vermogen of de farmacokinetiek van de molecule. De labeling kan direct of indirect worden uitgevoerd. i) Bij directe labeling (figuur 5a) wordt het radionuclide via een covalente binding aan het doelmolecuul gehecht. In het geval van peptidetargetingmoleculen kan een covalente binding worden gevormd tussen het radionuclide en een geschikt vrij amideresidu van Lys en Arg . Het gebruik van het tyrosineresidu kan problemen in verband met de labeling veroorzaken, zoals aspecifieke of slechte binding, in vivo instabiliteit van het complex en ongewenste veranderingen in de peptidestructuur, zoals de splitsing van interne disulfidebindingen, waardoor de werking kan veranderen. ii) Een indirecte labelingstrategie kan worden gebruikt door toevoeging van chelaatvormers aan het doelmolecuul (figuur 5 b)). Er zijn bifunctionele chelaten gebruikt om peptide-dragermoleculen met radionucliden te labelen. De chelaatvormer kan vooraf met de radionuclide worden geladen voordat hij aan het dragermolecuul wordt gebonden, of hij kan eerst aan het dragermolecuul worden gebonden en vervolgens aan de nuclide worden blootgesteld voor chelering in een proces dat bekend staat als postlabeling. Postlabeling heeft het voordeel dat het dragermolecuul gedurende lange tijd kan worden opgeslagen totdat het nodig is, en dat de radionuclide, die aan verval onderhevig is, kan worden toegevoegd kort voordat het radiofarmaceuticum wordt toegediend. Dit komt de commercialisering van het dragermolecuul ten goede en maakt de technologie gemakkelijker te gebruiken in ziekenhuizen of klinieken .

(a)

(b)

(a)
(b)

9.2.

Het 59-aminozuur residu tellende antimicrobiële peptide ubiquicidin (UBI) is een 6,7 kDa peptide dat voor het eerst werd ontdekt in cytosolische extracten van de muismacrofaag (figuur 6). Dit peptide bleek antimicrobiële effecten te vertonen tegen Salmonella typhimurium en Listeria monocytogenes. Vervolgens werd het aangetroffen in een groot aantal andere organismen, waaronder de mens. Aangezien het van nature in de mens voorkomt, is ubiquicidine geen immunogene entiteit, waardoor het geschikt is voor toediening als diagnostisch hulpmiddel. Het heeft ook een hoge affiniteit voor bacteriële cellen, maar richt zich niet op zoogdiercellen, waardoor het niet toxisch is voor de patiënt en selectief is in die zin dat het zich waarschijnlijk niet ophoopt op steriele ontstekingsplaatsen. Verscheidene studies zijn uitgevoerd op fragmenten van ubiquicidine, zowel in vitro als in vivo, om te beoordelen in hoeverre het zich kan binden aan bacteriële cellen.

Figuur 6

Primaire structuur van ubiquicidine zoals oorspronkelijk gerapporteerd door Hiemstra en medewerkers .

Welling en collega’s evalueerden het gehele gelabelde ubiquicidine en verschillende radioactief gelabelde fragmenten van het peptide, waaronder UBI1-18 (KVHGSLARAGKVRGQTPK), UBI29-41 (TGRAKRRMQYNRR), UBI18-29 (KVAKQEKKKKKT), UBI18-35 (KVAKQEKKKKKTGRAKRR), UBI31-38 (RAKRRMQY), en UBI22-35 (QEKKKKKTGRAKRR) voor hun vermogen om zich in vitro te binden aan bacteriële cellen en/of menselijke leukocyten. Zij ontdekten dat de ubiquicidine-peptidefragmenten UBI 18-35, UBI 31-38, UBI 22-35, en UBI 29-41 aanzienlijk hogere bindingsaffiniteiten vertoonden voor de bacteriële cellen dan voor de menselijke leukocyten. De in vivo resultaten, verkregen door scintigrafie van experimenteel geïnfecteerde muizen na intraveneuze toediening van de verschillende radioactief gemerkte peptiden, toonden aan dat de UBI18-35 en UBI29-41 peptiden de meest veelbelovende kandidaten bleken te zijn. Na een periode van 2 uur en 24 uur na de toediening waren de bindingsratio’s tussen leukocyten en bacteriën 1 : 36, 1 : 166, en 1 : 73, 1 : 220 voor respectievelijk UBI18-35 en UBI29-41. De onderzoekers concludeerden dat UBI29-41 en UBI18-35 de optimale peptiden waren voor het onderscheiden van infecties van steriele ontstekingen.

9.3. Human Clinical Trials of -Ubiquicidin 29-41 as an Infection Imaging Agent

Akhtar en medewerkers onderzochten de werkzaamheid van -UBI 29-41 als een infectie-imaging agent bij achttien patiënten met vermoedelijke prothese- of weke delen infecties. Met behulp van scintigrafie om het radioactief gemerkte peptide te controleren, konden de onderzoekers de doelwit-niet-doelwitverhouding (T/NT) van het beeldvormingsmiddel controleren. De infectie bij de patiënten werd bevestigd door middel van een kweek van bacteriën van de geïnfecteerde plaats, of wanneer dit niet mogelijk was door volledig bloedonderzoek. Uit de studie bleek dat alle patiënten het radiogelabelde peptide goed verdroegen, dat er geen significante veranderingen in hun vitale functies werden waargenomen en dat er geen gerelateerde bijwerkingen werden waargenomen na de toediening van de -UBI 29-41. De T/NT-verhouding werd bepaald na 30, 60 en 120 minuten, waarbij de scan na 30 minuten de hoogste gemiddelde T/NT-waarde liet zien. De voorste scan van het gehele lichaam (figuur 7) gaf informatie over de biodistributie van de tracer en de wegen waarlangs deze door het lichaam wordt geëlimineerd. Gebleken is dat de tracer vooral via de urinewegen wordt geëlimineerd en dat ook enige perfusie-afhankelijke leveractiviteit is waargenomen. De beeldvormingsagent bleek een gevoeligheid van 100% en een specificiteit van 80% te hebben. De onderzoekers concludeerden dat de -UBI 29-41 een positieve voorspellende waarde had van 92,9%, een negatieve voorspellende waarde van 100%, en een algemene diagnostische nauwkeurigheid van 94,4%. Het radioactief gemerkte peptide vertoonde werkzaamheid tegen een reeks verschillende bacteriën, waaronder Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus en Streptococcus pyogenes. De onderzoekers waren van mening dat -UBI 29-41 een zeer gevoelig en specifiek beeldvormingsmiddel is voor het opsporen van weke delen en botinfecties bij de mens.

Figuur 7

Anterieur beeld van het gehele lichaam, genomen op 30 min na de injectie van de tracer, waarop de nieren (gestippelde pijl), de lever (vaste pijl) en de urineblaas (bolpijl) te zien zijn (aangepast van ).

10. Discussion and Perspective

Het gebruik van nucleaire geneeskunde modaliteiten zoals SPECT of PET stelt clinici in staat om op niet-invasieve wijze het gehele lichaam te onderzoeken op fysiologische processen zoals occulte infectie op cellulair niveau en, afgezien van het feit dat dit een nuttig instrument is voor fysiologisch en medisch onderzoek, zijn deze zeer gevoelige technologieën in staat om ziekten te detecteren zonder, of voorafgaand aan, anatomische verandering (koorts van onbekende oorsprong). Tot op heden wordt gebruik gemaakt van radioactief gemerkte leukocyten, monoklonale antilichamen tegen cytokinen/leukocyten en tracers die geassocieerd zijn met specifieke moleculaire doelwitten of metabolische processen. Aan radioactief gemerkte leukocyten kleven beperkingen (verandering van de leukocytenfunctie door stralingsschade), namelijk dat zij een omslachtige farmakinetiek hebben en ook betrekkelijk niet-specifiek zijn. Bovendien kunnen gelabelde leukocyten en tracers met een hoog moleculair gewicht, zoals antilichamen, slechts in beperkte mate doordringen in geïnfecteerde of zieke weefsels. Dit laatste overzicht verduidelijkt het wijdverbreide potentieel van AMP’s om te worden geëvalueerd als beeldvormende sondes, gezien hun unieke selectieve betrokkenheid bij bacteriën. Een eenvoudige zoekopdracht in de literatuur, waarbij gezocht wordt naar “antimicrobiële peptiden”, levert ca. 6000 publicaties op. Zodra de query echter wordt gecombineerd met de term “beeldvorming”, levert dit slechts 63 publicaties op; slechts 17 daarvan hebben klinische relevantie (-UBI-29-41 gerelateerde studies/onderzoeken). Dit is een belangrijke vaststelling omdat dit ubiquicidinefragment een bijna perfecte drager kan zijn voor targeting moleculen voor het opsporen van infecties. Bij de klinische proeven bij mensen die Akhtar en collega’s met -UBI-29-41 hebben uitgevoerd, zijn geen aanwijzingen gevonden voor cytotoxiciteit bij de patiënten, hetgeen de bevindingen van de huidige studie ondersteunt. Ook al werd gesteld dat de signaal-ruisverhouding laag is, toch wordt het al 10 jaar met succes gebruikt. In 2010 werden de klinische studies tot nu toe door de Murphy et al. gerechtvaardigd op grond van hun diagnostische waarde over de eerste periode van 7 jaar. -UBI 29-41 meta-analyse kwamen hoge waarden voor sensitiviteit (96,3%), specificiteit (94,1%), en nauwkeurigheid (95,3%) met hoge positief voorspellende (95,1%) en negatief voorspellende waarden (95,5%) . Vanaf 2011 werden zeven bijkomende klinische studies (waaraan in totaal meer dan 160 patiënten deelnamen) met succes uitgevoerd en al deze studies toonden aan dat -UBI29-41-SPECT een zeer nauwkeurig en selectief diagnostisch instrument is voor botinfectie bij diabetische voet , heupprothesen of andere implantaatgerelateerde infecties ; bovendien detecteert het ook osteomyelitis en infectieuze endocarditis . Er kan worden gesteld dat dit toepassingsgebied voor -UBI29-41 beeldvorming zal blijven groeien, ook omdat onderzoek met andere alternatieve radio-isotopen dan in de toekomst een nieuwe groep radiofarmaceutische middelen voor medische diagnostische beeldvorming met klinische PET/CT of PET/MRI kan opleveren. Nieuwe radio-isotopen zoals 68Ga, 82Rb of 62Cu kunnen op verzoek worden geproduceerd door een radio-isotopengenerator zonder dat daarvoor een cyclotron ter plaatse nodig is, en kunnen dienen als radionucliden voor PET. 68Ga heeft belangstelling gewekt als positronemitter voor moleculaire beeldvorming vanwege enkele van de voordelen die het als tracer biedt. Het heeft een radioactieve halveringstijd van 67,71 minuten, waardoor het compatibel is met de biokinetiek van de meeste radiofarmaceutica met een laag moleculair gewicht, zoals peptiden, oligonucleotiden, aptameren of antilichaamfragmenten. Het nucleaire verval van de isotoop vindt hoofdzakelijk plaats door positronemissie (89%), met een gemiddelde positronenergie van 740 keV. Bovendien is de coördinatiechemie van Ga3+ goed begrepen, wat nuttig is bij het ontwerpen van chelaatvormers die kunnen worden gebruikt om deze radionuclide aan een doelvector te koppelen. Onlangs werd UBI29-41 geconjugeerd aan de macrocyclus 1,4,7-triazacyclononaan-1,4,7-triazijnzuur (NOTA) en vervolgens gelabeld met 68Ga . Deze benadering werd aanvankelijk gebruikt met 1,4,7,10-tetraazacyclododecaan-N′,N′′,N′′′′ ′-tetraazijnzuur (DOTA) om de peptidederivaten te verkrijgen zoals DOTA-TOC of DOTA-TATE voor 68Ga-complexatie die vervolgens tumor-receptor-gebaseerde PET-beeldvorming mogelijk maakte. In een preklinische studie met 68Ga-NOTAUBI29-41-PET werd aangetoond dat de macrocyclusconjugatie het vermogen van het peptide om zich in vivo selectief aan bacteriën te binden niet aantastte. Naast UBI zijn er andere verbindingen geëvalueerd voor beeldvorming van infectie en ontsteking, maar het merendeel van de beschikbare antimicrobiële peptiden blijft onderontwikkeld wat betreft beeldvorming van infectie. In 2000 werden de humane neutrofiele peptiden (HNP1-3) naast andere peptiden beschouwd als nuttige agentia voor de beeldvorming van infecties; als onderdeel van het afweermechanisme in monocyten/lymfocytenculturen spelen HNP’s een chemotactische rol als bemiddelende moleculen. Deze dubbelzinnige rol kan een nadeel zijn bij de ontwikkeling van HNP’s voor beeldvorming; vandaar dat het gebruik van bepaalde peptiden als doelvectoren enkele secundaire beperkingen kan hebben, ondanks hun gunstige cellulaire eigenschappen. Aangezien radiofarmaceutica meestal worden toegediend via i.v. injectie, kunnen de peptiden gevoelig zijn voor enzymatische degradatie of destabilisatie van het radio-isotoop zoals gerapporteerd voor 18F-UBI29-41 . Het van lactoferrine afgeleide peptide hLF(1-11) toonde een grote gevoeligheid als infectieagens gericht tegen multidrug-resistente Acinetobacter baumannii stammen; de binding aan Candida albicans, een schimmel, en de hepatobiliaire excretie maakten het echter minder gunstig voor beeldvorming. Bovendien vertoonde hLF immuunactiverende of bactericide effecten, afhankelijk van de toegediende dosis, dat wil zeggen, ondervonden met een negatief terugkoppelingsmechanisme door interleukine-10 modulatie . Een ander voorbeeld, het AMP Latarcin-2a, geëxtraheerd uit het gif van de Centraal-Aziatische spin Lachesana tarabaevi, heeft ongewenste lytische activiteit tegen Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën, erytrocyten, en gist bij micromolaire concentraties en maakt het dus minder geschikt voor bacteriële detectie met PET . Bovendien zijn de meeste bacteriën in staat om zowel oppervlaktegebonden als secretorische proteasen te produceren, een verdedigingsstrategie die AMP’s kan afbreken of inactiveren. Bijgevolg zou het gebruik van van AMP’s afgeleide verbindingen als beeldvormingsagentia resulteren in vals-negatieve diagnoses waarbij een persisterende infectie gemakkelijk verkeerd kan worden ingeschat of volledig over het hoofd kan worden gezien. Door deze specifieke bacteriën-intrinsieke verdedigingsmechanismen te begrijpen, kan vermeden worden om kwetsbare AMP-afgeleide structuren te gebruiken als beeldvormingsagentia voor infecties. Er zij ook op gewezen dat, op enkele structuren na, het onderzoek geen bacteriespecifiek receptorachtig doelwit aan het licht heeft gebracht dat de potentiële peptiden aanvult als liganden of allosterische modulatoren. Tumorcellen daarentegen brengen specifieke receptoren tot expressie, integrine-, bombesine-, of somatostatine-liganden of -antagonisten, die het doelwit zijn van SPECT- of PET-tracers. Bovendien vertoont het immuunsysteem van de gastheer, wanneer het op infecties reageert, pathologische trajecten die met PET kunnen worden afgebeeld. Geactiveerde macrofagen kunnen fungeren als een equivalent gastheer-afhankelijk doelwit dat met 18F-FDG niet-specifiek kan worden gevisualiseerd, maar de werkelijke bacteriële belasting blijft overzien. Daarentegen werken AMP-afgeleide peptiden in een gastheer-onafhankelijk mechanisme: radiogelabelde peptiden zullen binden aan vrije en aan celadhesieve maar niet aan gefagocytiseerde bacteriën en bijgevolg worden bacteriën onzichtbaar voor -UBI29-41-SPECT zodra zij door macrofagen zijn opgenomen. Het gebruik van deze modaliteit maakt het mogelijk een infectie vroegtijdig op te sporen voordat er morfologische veranderingen in het lichaam hebben plaatsgevonden. Het maakt het ook mogelijk een infectie te onderscheiden van een steriele ontsteking die oppervlakkig gelijkaardig kan lijken aangezien beide zich kunnen presenteren als rode, gezwollen en ongewoon warme gebieden. Dit is te wijten aan de verhoogde bloedstroom, de verhoogde vasculaire permeabiliteit, en de instroom van witte bloedcellen die in beide situaties voorkomen. Deze laatste benadering zou de nadruk leggen op een dubbele tracer beeldvormingsregime in toekomstige klinische studies of zelfs dubbele toediening van tracers (indien de respectieve radio-isotoop eigenschappen en farmacokinetische eigenschappen de benadering aanvullen). Samenvattend, de ideale tracer voor klinische PET beeldvorming van infecties moet aan verschillende criteria voldoen. (1) hij moet bestand zijn tegen aanzienlijke afbraak in het bloed en een redelijke mate van lipofiliteit bezitten; (2) hij moet accumuleren en worden vastgehouden op de plaats van de infectie (idealiter door internalisatie en daaropvolgende amplificatie), met minimale accumulatie op niet-geïnfecteerde plaatsen; (3) hij moet een snelle klaring van niet-specifieke activiteitsopname uit de omringende regio’s hebben voor hoge signaal-ruisverhoudingen; en (4) hij moet minimale bijwerkingen hebben en gemakkelijk te bereiden zijn, tegen lage kosten. UBI29-41 heeft zijn nut bewezen voor generieke beeldvorming van infecties, en andere geschikte radiofarmaceutica op basis van AMPs zullen ongetwijfeld volgen.

Afkortingen

AMP:	Antimicrobiële peptiden
B. subtilis:	Bacillus subtilis
C. albicans:	Candida albicans
CL:	Cardiolipin
CT:	Computed tomography
DNA:	Deoxyribonucleic acid
E. coli:	Escherichia coli
FDG:	Fluorodeoxyglucose
LPS:	Lipopolysaccharide
MRI:	Magnetic resonance imaging
PC:	Phosphatidylcholine
PE:	Phosphatidyl-ethanolamine
PET:	Positron emissie tomografie
PG:	Phosphatidyl-glycerol
PS:	Phosphatidyl-serine
S. aureus:	Staphylococcus aureus
SM:	Sphingomyelin
SPECT:	Single photon emission computed tomography
ST:	Sterolen
T/NT:	Verhouding doel-niet-doel
TATE:	(Tyrosine3)octreotate
TOC:	(Fenylalanine1-Tyrosine3)octreotide
UBI:	Ubiquicidin (fragment).

Conflict of Interests

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflict hebben.

Acountledgments

Het werk met betrekking tot deze review werd gefinancierd en vriendelijk ondersteund door de National Research Foundation (NRF), het Institute of Cellular and Molecular Medicine en het Nuclear Technologies in Medicine and the Biosciences Initiative (NTeMBI), een nationaal technologieplatform dat is ontwikkeld en wordt beheerd door de South African Nuclear Energy Corporation (Necsa) en wordt gefinancierd door het Department of Science and Technology (DST).