AP endonuclease EXO-3 deficiëntie veroorzaakt ontwikkelingsvertraging en abnormale vulval organogenese, Pvl, via DNA glycosylase-geïnitieerde checkpoint activering in Caenorhabditis elegans

Het expressieniveau van AP endonucleasen neemt toe na het L4 stadium

Na het uitkomen van het ei, ontwikkelen C. elegans zich in vier larvale stadia (L1-L4) tot volwassenen, die telkens onderbroken worden door vervelling van de cuticula. Volwassen stadia worden nog steeds onderverdeeld in twee stadia: het jongvolwassen stadium en het gravide volwassen stadium. Om inzicht te krijgen in de rol van AP endonucleasen na de embryogenese, maten we de temporele verandering in het mRNA expressieniveau van exo-3 of apn-1. Bij 0, 24 en 48 uur, wanneer de meeste N2 wormen zich respectievelijk in het eistadium, L1 stadium en L4 stadium bevinden, werd geen verschil in mRNA expressieniveau gevonden voor zowel exo-3 als apn-1 (Fig. 1a,b). Na 60 uur, wanneer de meeste N2 wormen zich in het jongvolwassen stadium bevinden, waren de expressieniveaus voor exo-3 en apn-1 respectievelijk ongeveer 13- en 2,3-maal hoger dan na 0 uur (Fig. 1a,b). Het expressieniveau op 72 uur, wanneer de meeste N2 wormen zich in het gravide volwassen stadium bevinden, was hetzelfde als op 60 uur (Fig. 1a,b). Deze resultaten suggereren dat AP endonucleasen nodig zijn na de embryogenese, vooral na het L4 stadium.

De exo-3-mutanten vertonen een ontwikkelingsachterstand

Om de bijdrage van AP-endonucleasen aan de ontwikkeling van wormen van het L4- tot het volwassen stadium te verduidelijken, werden wormen met een tekort aan een van beide of beide AP-endonucleasen (EXO-3 en APN-1) onder normale kweekomstandigheden gedurende 3 dagen vanaf het bevruchte eistadium geïncubeerd (Fig. 1c). Ontwikkelingsstadia onder de L4, jongvolwassen en gravide volwassen stadia werden onderscheiden door de staat van de vulval morfologie en het broeden van eieren (Fig. 1d,f). Hoewel alle N2 wormen zich ontwikkelden tot gravide volwassenen, bevond slechts 14% van de exo-3 mutanten zich in het gravide volwassen stadium, 85% bevond zich in het jongvolwassen stadium en 1% bevond zich in het larvale stadium (Fig. 1g), wat suggereert dat EXO-3 deficiëntie de stopzetting van de ontwikkeling of ontwikkelingsvertraging veroorzaakt. Daarentegen werden alle apn-1 mutanten gravide volwassenen, en de apn-1;exo-3 mutanten bevonden zich in bijna dezelfde ontwikkelingsstadia als de exo-3 mutanten (Fig. 1g). Twaalf uur later bereikten alle exo-3 en apn-1;exo-3 mutanten het gravide volwassen stadium (gegevens niet weergegeven), wat erop wijst dat EXO-3 deficiëntie geen stopzetting van de ontwikkeling in het jongvolwassen stadium veroorzaakt, maar enkel een vertraging van de ontwikkeling. Om precies te onderzoeken hoe lang de vertraging van de exo-3 mutanten was, maten we elke twee uur de tijd tot gravide volwassenheid van elke worm en berekenden het verschil van de gemiddelde tijd tussen N2 (N = 8) en de exo-3 mutanten (N = 16). Het verschil bedroeg 6 uur.

De ontwikkelingsachterstand bij de exo-3 mutanten is afhankelijk van het DNA-glycosylase NTH-1

Het is redelijk om af te leiden dat het ontwikkelingsvertragingsfenotype van exo-3 mutanten wordt veroorzaakt door de accumulatie van AP sites of 3′-geblokkeerde SSB in DNA omdat dit substraten zijn voor EXO-315. Deze structuren in DNA kunnen door DNA-glycosylasen gegenereerd worden. Van de twee DNA glycosylases geconserveerd in C. elegans, genereert UNG-1 AP sites door monofunctionele DNA glycosylase activiteit op uracil in DNA, en NTH-1 produceert 3′ geblokkeerde SSB door bifunctionele DNA glycosylase activiteit op oxidatieve pyrimidine laesies in DNA. Daarom onderzochten we de afhankelijkheid van de vertraging in de exo-3 mutanten van UNG-1 en NTH-1. Drie dagen na de ontwikkeling uit eieren bevond 9% van de ung-1;exo-3 mutanten zich in het gravide volwassen stadium, 86% in het jongvolwassen stadium en 5% in het larvale stadium, en deze verhoudingen waren bijna gelijk aan die van de exo-3 mutanten (11% in het gravide volwassen stadium, 85% in het jongvolwassen stadium en 4% in het larvale stadium) (Fig. 2), wat suggereert dat de vertraging onafhankelijk is van UNG-1. Daarentegen bevond 94% van de nth-1;exo-3 mutanten zich in het gravide volwassen stadium en 6% in het jongvolwassen stadium. De nth-1;ung-1;exo-3 mutanten vertoonden gelijkaardige resultaten (Fig. 2), wat suggereert dat de vertraging afhankelijk is van NTH-1.

De ontwikkelingsvertraging van de exo-3 mutanten wordt versterkt door MMS en NaHSO3

Om te verduidelijken of AP site-genererende middelen ontwikkelingsvertraging kunnen veroorzaken, voerden we een ontwikkelingstest uit met MMS en natriumbisulfiet (NaHSO3) (Fig. 3a). MMS is bekend dat indirect creëren AP sites20,21 en aangetoond dat DNA-laesies induceren in het genoom van C. elegans22. Op 3,5 dagen nadat de eieren werden gelegd op platen met 0,94 mM MMS, 97% van N2 waren in de gravid volwassen stadium en 3% waren in het larvale stadium, terwijl 61% van de exo-3 mutanten waren in de gravid volwassen stadium, 34% waren in de jonge volwassen stadium en 5% waren in het larvale stadium (Fig. 3b), wat suggereert dat MMS-geïnduceerde AP sites verdere vertraging van de ontwikkeling in de exo-3 mutanten dan in N2 veroorzaken. Anderzijds bevond 93% van de apn-1 mutanten zich in het gravide volwassen stadium, 6% in het jongvolwassen stadium en 1% in het larvale stadium, wat vergelijkbaar is met de resultaten voor N2 (Fig. 3b). NaHSO3 beschadigt DNA voornamelijk door deaminatie van cytosine tot uracil23. Vier dagen na de ontwikkeling vanuit het eistadium ontwikkelden alle exo-3 mutanten die niet met NaHSO3 waren behandeld zich tot gravide volwassenen, maar 33% van de exo-3 mutanten die met 10 mM NaHSO3 waren behandeld bevonden zich in het gravide volwassen stadium, 12% in het jongvolwassen stadium en 55% in het larvale stadium (Fig. 3c), wat erop wijst dat NaHSO3 bij de exo-3 mutanten een ontwikkelingsvertraging induceerde. Deze vertraging werd verlicht bij de ung-1;exo-3 mutanten, aangezien 79% van de mutanten behandeld met 10 mM NaHSO3 zich in het gravide volwassen stadium bevonden, 14% in het jongvolwassen stadium en 7% in het larvale stadium (Fig. 3c), wat suggereert dat de door NaHSO3 geïnduceerde ontwikkelingsvertraging te wijten was aan UNG-1 activiteit. Alles bij elkaar kunnen AP-locaties ontwikkelingsvertraging veroorzaken, evenals 3′-geblokkeerde SSB gegenereerd door NTH-1.

De ontwikkelingsvertraging van de exo-3 mutanten wordt geïnduceerd door CHK-2

Wij stelden vervolgens de hypothese dat de door DNA-glycosylase geïnitieerde ontwikkelingsvertraging van de exo-3 mutanten te wijten was aan activering van het DNA-schade-checkpoint door splijtingsproducten die door DNA-glycosylasen worden geproduceerd. DNA schade controlepunt genen, zoals chk-2 en clk-2, zijn beschreven in C. elegans24. Om onze hypothese te testen, werd de ontwikkeling assay uitgevoerd onder chk-2 (RNAi) of clk-2 (RNAi) voorwaarden (Fig. 4a). Hoewel 14% van de exo-3;controle (RNAi) wormen zich in het gravide volwassen stadium bevonden en 84% in het jongvolwassen stadium, en exo-3;clk-2 (RNAi) wormen vergelijkbare proporties vertoonden (18% in het gravide volwassen stadium en 82% in het jongvolwassen stadium), bevond 93% van de exo-3;chk-2 (RNAi) wormen zich in het gravide volwassen stadium (Fig. 4b). Dus, de knockdown van chk-2 gered de ontwikkelingsvertraging in de exo-3 mutanten, wat suggereert dat CHK-2 induceert de ontwikkelingsvertraging in de exo-3 mutanten.

EXO-3 voorkomt dut-1 (RNAi)-geïnduceerde Pvl-vorming

DUT-1 is een deoxyuridine trifosfaat nucleotidohydrolase (dUTPase), dat dUTP hydrolyseert in dUMP. Daarom leidt dut-1 (RNAi) tot een toename van dUTP in de nucleotidenpool, dat in plaats van dTTP door DNA-replicatie in DNA wordt opgenomen, waardoor de accumulatie van uracil in DNA optreedt25,26. Het is gemeld dat dut-1 (RNAi) induceert abnormale vulval organogenese, Pvl, in wild-type N2 wormen, en dat de dut-1 (RNAi)-geïnduceerde Pvl is afhankelijk van UNG-127. Wij speculeerden dat EXO-3 deficiëntie een toename veroorzaakt van dut-1 (RNAi)-geïnduceerde Pvl omdat EXO-3 nodig is om AP sites te repareren na de splitsing van uracil in DNA door UNG-1. Om dit te bevestigen, werd dut-1 (RNAi)-geïnduceerde Pvl-vorming waargenomen in AP endonuclease-deficiënte mutanten (Fig. 5a-c). Van de overlevende volwassenen 4 dagen na de ontwikkeling uit eieren, 52% waren exo-3 mutanten met dut-1 (RNAi)-geïnduceerde Pvl en 13% waren N2 wormen met Pvl (Fig. 5d), wat suggereert dat EXO-3 deficiëntie veroorzaakt een toename van dut-1 (RNAi)-geïnduceerde Pvl. Anderzijds had 15% van de apn-1 mutanten Pvl, wat vergelijkbaar is met het aandeel van N2 wormen met Pvl (Fig. 5d). De apn-1;exo-3 mutanten en exo-3 mutanten waren vergelijkbaar in proportie, met 52% met Pvl (Fig. 5d).

De toename van dut-1 (RNAi)-geïnduceerde Pvl in de exo-3 mutanten is afhankelijk van UNG-1, ongeacht NTH-1

Om te onderzoeken of de toename van dut-1 (RNAi)-geïnduceerde Pvl in de exo-3 mutanten optrad door UNG-1 activiteit, onderzochten we de afhankelijkheid van het fenotype van UNG-1. Het percentage ung-1;exo-3 mutanten met Pvl was 2%, wat hetzelfde was als dat van de ung-1 mutanten met Pvl (1%) (Fig. 6a), wat suggereert dat de toename van Pvl in de exo-3 mutanten alleen te wijten is aan UNG-1 expressie.

Naast hebben we onderzocht of de door UNG-1 geproduceerde splitsingsproducten nodig zijn om Pvl te induceren, d.w.z. of AP-locaties worden omgezet in 3′-geblokkeerde SSB via de AP lyase activiteit van NTH-1. Het percentage exo-3 mutanten met Pvl was vergelijkbaar met dat van nth-1;exo-3 mutanten (Fig. 7b), wat suggereert dat NTH-1 niet noodzakelijk is voor dut-1 (RNAi)-geïnduceerde Pvl.

De toename van dut-1 (RNAi)-geïnduceerd Pvl in de exo-3 mutanten wordt aangestuurd door CHK-2

Wij stelden de hypothese dat de UNG-1-afhankelijke toename van dut-1 (RNAi)-geïnduceerd Pvl in de exo-3 mutanten kan optreden via activering van het DNA-checkpoint, aangestuurd door splitsingsproducten geproduceerd door UNG-1, naast de ontwikkelingsvertraging. Er is ook gerapporteerd dat dut-1 (RNAi)-geïnduceerde Pvl wordt veroorzaakt door het checkpoint kinase CLK-227. Daarom hebben we onderzocht of de toename van dut-1 (RNAi)-geïnduceerd Pvl in de exo-3 mutanten afhankelijk was van CHK-2 en CLK-2. Hoewel 49% van de exo-3;controle (RNAi) wormen hadden dut-1 (RNAi)-geïnduceerde Pvl, slechts 10% van de exo-3;chk-2 (RNAi) wormen had het (Fig. 6b). Aan de andere kant was het aandeel van exo-3;clk-2 (RNAi) wormen met Pvl bijna hetzelfde (44%) als dat van de exo-3;controle (RNAi) wormen. Daarom redde de knockdown van chk-2 de toename van dut-1 (RNAi)-geïnduceerde Pvl in de exo-3 mutanten, zoals waargenomen voor ontwikkelingsvertraging. Deze resultaten suggereren dat de toename van dut-1 (RNAi)-geïnduceerd Pvl in de exo-3 mutanten optreedt via CHK-2 expressie.

Oxidatieve DNA-beschadigende agentia verhoogden het aandeel Pvl in de exo-3 mutanten alleen wanneer gecombineerd met dut-1 (RNAi)

Om andere DNA-beschadigende agentia te onderzoeken die een toename van Pvl in de exo-3 mutanten veroorzaken, evalueerden we of Pvl-vorming wordt versterkt door oxidatieve DNA-beschadigende agentia zoals ndx-1 (RNAi), ndx-2 (RNAi) en methyl viologeen (MV). NDX-1 en NDX-2 hydrolyseren 8-oxo-dGDP in 8-oxo-dGMP24,28. Dienovereenkomstig leiden ndx-1 (RNAi) en ndx-2 (RNAi) tot een toename van 8-oxo-dGDP in de nucleotidenpool. De aanwezigheid van 8-oxo-dGDP vermindert de 8-oxo-dGTPase activiteit van NDX-4, waardoor 8-oxo-dGTP zich ophoopt in de pool24. 8-oxo-dGTP wordt tijdens de DNA-replicatie in het DNA opgenomen, waardoor 8-oxoG in het DNA wordt geaccumuleerd24,28. MV genereert superoxide-radicalen, die vervolgens oxidatieve laesies in het DNA veroorzaken29. Eenmalige behandeling met ndx-1 (RNAi), ndx-2 (RNAi) of MV had echter geen effect op de incidentie van Pvl in de exo-3 mutanten. (gegevens niet weergegeven). Vervolgens hebben we onderzocht of, indien gecombineerd met de dut-1 (RNAi) behandeling, elke oxidatieve DNA-beschadigende agent verder versterkt de toename van Pvl in de exo-3 mutanten (Fig. 7a). Elke geteste behandeling versterkte de toename van dut-1 (RNAi) geïnduceerde Pvl in de exo-3 mutanten met ongeveer 10% (Fig. 7b), wat suggereert dat oxidatieve laesies in het DNA ook een toename van Pvl kunnen veroorzaken.

In in vitro experimenten bleek NTH-1 een zwakke DNA-glycosylase activiteit te bezitten ten opzichte van 8-oxoG in DNA, naast zijn veel hogere activiteit ten opzichte van oxidatieve pyrimidine laesies30. We vermoeden dus dat de hogere toename van dut-1 (RNAi)-geïnduceerd Pvl door de bijkomende oxidatieve middelen afhankelijk is van de activiteit van NTH-1. Hoewel we de afhankelijkheid van het fenotype van NTH-1 bevestigden, veranderde NTH-1 deficiëntie het aandeel van wormen die Pvl vertoonden niet (Fig. 7b).