Apc-gerelateerde modellen van intestinale neoplasie: een kort overzicht voor pathologen

Colorectaal carcinoom is een veel voorkomende oorzaak van kankersterfte in de Westerse wereld. In veel pathologiepraktijken vormen colorectale adenomen die worden verwijderd tijdens screening colonoscopieën een hoog percentage van de dagelijkse werklast, en dus is de morfologie van humaan colorectaal carcinoom en adenomen, de voorloper laesies, bekend bij chirurgische pathologen. In academische centra kan chirurgische pathologen gevraagd worden om muismodellen van neoplasie te interpreteren voor onderzoekers, en een basiskennis van overeenkomsten en verschillen tussen de morfologie van menselijke darmneoplasie en muismodellen is noodzakelijk voor een accurate interpretatie.

Genetisch veranderde muismodellen van tumorigenese, hoewel soms bekritiseerd voor hun onvolmaakte modellering van de menselijke ziekte, zijn nuttig om te beoordelen of specifieke mutaties kunnen leiden tot tumorvorming, voor chemopreventie studies en voor het ophelderen van de functionaliteit van veranderde genproducten. Hoewel er in de wetenschappelijke literatuur veel genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEM) van darmneoplasie zijn beschreven, kunnen zij grofweg in 5 groepen worden verdeeld: Apc-gerelateerde modellen met veranderingen in Wnt signalering, mismatch repair deficiënte modellen, met carcinogenen behandelde modellen, modellen met veranderingen in transformerende groeifactor β, en colitis-geassocieerde neoplasie die ontstaat in immuundeficiënte modellen zoals IL10-/- muizen. Dit overzicht zal zich richten op de pathologie van een van de eerste GEM modellen van intestinale neoplasie, de ApcMin+/- muis en verwante modellen, met als doel het beschrijven van de morfologische kenmerken van de intestinale laesies, met vergelijking met menselijke colorectale adenomen en carcinomen.

Een van de meest gebruikte modellen voor menselijke intestinale neoplasie is het ApcMin+/- model, ontwikkeld in 1990 in het laboratorium van William Dove (Moser et al., 1990). De ApcMin+/- muis, het eerste kiemlijnmutantmuismodel voor darmneoplasie, is drager van een autosomaal dominante verlies van functiemutatie bij Apc- codon 850, die is ontstaan door blootstelling aan N-ethyl-N-nitrosoureum (ENU), een zeer krachtig mutageen agens. Sindsdien is een aantal andere modellen met een Apc-mutatie gegenereerd, waarvan vele met truncerende mutaties (tabel 1).

Deze Apc-gerelateerde modellen zijn bijzonder nuttig omdat de meest voorkomende driver-mutatie voor colorectaalcarcinoom bij de mens een mutatie is in het tumorsuppressorgen APC, die leidt tot inactivering van APC en activering van de Wnt signaleringsroute, met stabilisatie van β-catenine en translocatie daarvan naar de kern. Het APC-gen bij de mens codeert voor een eiwit van 213 kilodalton dat betrokken is bij celadhesie en -motiliteit, celcyclusregulering, apoptose en signaaltransductie (Boman & Fields, 2013), en de kiembaanmutatie ervan leidt tot familiaire adenomatose polyposis coli (FAP). Dit kanker predispositie syndroom wordt gekenmerkt door de ontwikkeling van honderden colorectale adenomen, leidend tot adenocarcinoom op jonge leeftijd. De meeste mutaties die FAP veroorzaken bevinden zich binnen de 5′ helft van het gen en resulteren in afgeknotte polypeptiden.

Genetica van APC-gerelateerde diermodellen

Vele van de Apc-gerelateerde muismodellen zijn gemanipuleerd om kiembaanmutaties in Apc te bevatten die leiden tot expressie van een afgeknot Apc-eiwit; in de meeste van deze modellen zijn alleen heterozygoten levensvatbaar, aangezien homozygositeit embryonaal dodelijk is. Verlies van controle over de groei bij verlies van de overblijvende wild-type kopie van Apc leidt tot meervoudige darmadenomen. De specifieke plaats van de Apc-mutatie beïnvloedt de multipliciteit van de poliepen, de plaats en de levensduur van de muizen (McCart et al., 2008). Bijvoorbeeld, de Apc1638N/+ muis heeft een verminderde polieplast en een langere levensduur vergeleken met de ApcMin/+ muis (Smits et al, 1998), In de Apc1322T muis behoudt het mutante eiwit een 20-amino zure β-catenine bindende/degradatie herhaling (in de ApcMin/+ zijn er geen); adenomen in deze muizen zijn eerder aantoonbaar, hebben ernstiger dysplasie, en zijn groter (Pollard et al., 2009) in vergelijking met ApcMin/+ muizen. De timing van het Apc functieverlies kan ook belangrijk zijn; zo resulteert een stapsgewijs Apc verlies door Apc(Min/CKO) of Apc(1638N/CKO) in duidelijk zichtbare neoplasie in de darm, terwijl gelijktijdig verlies leidt tot occulte klonale expansie door cryptische splijting zonder morfologische transformatie (Fischer et al., 2012). Deletie van het volledige Apc-gen in de ApcΔel-15 muis levert een snellere tumorontwikkeling op in vergelijking met Apc-truncatie, met een verminderde overleving, ernstigere polyposis, en een verder gevorderde progressie van de dikke darmtumoren in vergelijking met ApcMin/+ muizen (Cheung et al,

Genetisch veranderde rattenmodellen met Apc-mutatie zijn ook beschikbaar en zijn aantrekkelijk vanwege de lange levensduur van de modellen en het relatieve gemak van het uitvoeren van colonoscopie, waardoor longitudinale experimenten mogelijk zijn (tabel 2). De meest voorkomende zijn de Kyoto Apc Delta (KAD)-rat en de Pirc-rat. De KAD-rat is verkregen via ENU-mutagenese en heeft een nonsense-mutatie in codon 2523 in exon 15 van Apc, waardoor een afgekapt eiwit ontstaat. Deze ratten zijn levensvatbaar in homozygote toestand en ontwikkelen niet spontaan darmtumoren. Behandeling met azoxymethaan en dextran sulfaat natrium (AOM/DSS) is nodig om intestinale neoplasie te induceren. De Pirc-rat, ook geproduceerd via ENU-geïnduceerde mutagenese, heeft een Apc-mutatie bij nucleotide 3409, waardoor een afgekapt eiwit ontstaat. Deze mutatie is embyronautisch dodelijk in de homozygote toestand. De mutatie heeft 100% penetrantie, waarbij alle ratten darmpoliepen ontwikkelen na de leeftijd van 4 maanden.

Er is een genetisch gemodificeerd varkensmodel ontwikkeld met een APC 1311-mutatie, die ortholoog is aan het menselijke APC 1309. Deze dieren ontwikkelen afwijkende cryptale foci, enkele cryptale adenomen en multipele colorectale adenomen, vergelijkbaar met menselijke FAP. De grotere adenomen vertonen progressie in de vorm van dysplasie met een hoge graad. Kenmerkend is de betrokkenheid van het oppervlak, vergelijkbaar met menselijke adenomen (Flisikowska et al., 2012).

Modifiers of Cancer Phenotypes

Strainverschillen worden al lang erkend als een significant effect op de tumorlast in het ApcMin+/- model, dat gewoonlijk wordt gehandhaafd op een C57Bl/6J achtergrond. Kruisen van B6 Min/+ muizen met AKR en andere inteeltstammen resulteerde in een afname van het gemiddelde aantal tumoren in de F1 muizen (Shoemaker et al., 1997). Terugkruisingsexperimenten en andere genetische analyses om modificator loci in kaart te brengen hebben een aantal Modifier of Min (Mom) kandidaatgenen opgeleverd (McCart et al., 2008). Daarnaast hebben het dieet en het darmmicrobioom van de muizenkolonie belangrijke effecten op de multipliciteit, progressie en grootte van poliepen. Zo is bijvoorbeeld aangetoond dat een vezelrijk dieet in westerse stijl het aantal poliepen en de tumorprogressie bij ApcΔ716/+ muizen doet toenemen (Hioki et al., 1997).

Pathologie

De morfologie van de darmlaesies bij ApcMin+/-en verwante modellen is vergelijkbaar bij alle modellen, hoewel de aanvangsleeftijd, de mate van dysplasie en de distributie in het maagdarmkanaal varieert (tabel 1). De vroegst herkenbare letsels bestaan uit een enkele vergrote crypte of een kleine cluster van crypten, omgeven door volgroeide cellen met een verhoogde kern-tot-cytoplasma ratio en nucleaire hyperchromasie (Fig. 1). Deze vroege laesies zijn laaggradige dysplastische laesies die lijken op kleine tubulaire colonale adenomen die bij patiënten met FAP worden gezien. In de dunne darm ontwikkelt zich een kleine invaginatie in de lamina propria in de proliferatieve zone op de overgang van de crypte en de villus (Fig. 2). De adenomateuze cellen dringen door in de lamina propria en tot in de villus, en vormen een dubbele laag van adenomateus epitheel onder een normaal oppervlaktemucosa (Fig. 3). In het colon invagineren de vroege adenomen in de lamina propria tussen de crypten, hoewel adenomen van afzonderlijke crypten ook kunnen worden geïdentificeerd (Oshima et al., 1997). Immunohistochemie voor beta catenine kan gebruikt worden om vroege adenomen te identificeren, omdat zelfs enkelvoudige crypt adenomen in ApcMin+/- en verwante modellen accumulatie van nucleair beta catenine vertonen (Fig. 4).

Naarmate de adenomen groeien, vormen ze polypoïde, gesteelde of soms komvormige laesies met een depressief centrum (Fig. 5a en b). In vele modellen evolueren de adenomen niet verder dan laaggradige dysplasie. In langer levende modellen met minder tumoren ontwikkelen sommige adenomen echter dysplasie van hoge graad, gekenmerkt door een cribriformale architectuur, waarbij niet alle cellen in contact zijn met een keldermembraan (Fig. 6). Talrijke mitotische figuren en apoptotische lichaampjes zijn gebruikelijk in adenomen in alle stadia van ontwikkeling.

De darmneoplasma’s die ontstaan in ApcMin+/- en verwante modellen bevatten meerdere celtypes maar zijn hoofdzakelijk samengesteld uit absorptieve type cellen en gobletcellen (Tabel 3). Adenomen die ontstaan in de dunne darm van de ApcMin+/- en verwante modellen bevatten Paneth cellen die gemakkelijk te identificeren zijn op hematoxyline en eosine kleuring (Fig. 7) en gemarkeerd met immunohistochemie voor lysozyme. Het is aangetoond dat deze cellen 10% of minder uitmaken van de cellen in adenomen van de dunne darm (Moser et al., 1992). Het colon van de muis bevat geen Paneth-cellen, maar er zijn lysozym-expresserende cellen zonder PAS-positiviteit geïdentificeerd in colonale adenomen in deze modellen, wat zelfs in colonlaesies een differentiatie naar Paneth-cellen suggereert (Moser et al., 1992; Husoy et al., 2006). Neuro-endocriene cellen vormen een klein deel van de cellen in ApcMin+/- type adenomen, maar het specifieke celtype weerspiegelt de neuro-endocriene cellen die gevonden worden in normaal darmslijmvlies op de plaats van het adenoom (Moser et al., 1992). Zo zijn serotonine-expressieve cellen de meest voorkomende neuro-endocriene cellen in de darm van muizen en worden overal aangetroffen; dergelijke cellen omvatten tot 5% van de ApcMin+/- adenoomcellen, in laesies van dunne darm en colon (Moser et al., 1992). PYY-positieve cellen daarentegen worden alleen aangetroffen in adenomen van het distale colon, hetgeen de normale distributie van deze cellen weerspiegelt. Neuro-endocriene cellen zijn diffuus verspreid over de adenomen, en vormen geen kleine clusters zoals de lysozym-positieve cellen (Moser et al., 1992).

Dysplasie in intestinale adenomen in muismodellen moet worden gegradeerd met behulp van dezelfde terminologie (laaggradige dysplasie, hooggradige dysplasie, intramucosaal carcinoom) en criteria als voor humane colorectale adenomen (Washington et al., 2013). De meeste adenomen in de ApcMin+/- muis en verwante modellen vertonen een laaggradige dysplasie, maar vele worden progressief groter naarmate de muis ouder wordt, en enkele ontwikkelen zich in de volgorde adenoom-carcinoom. Invasief carcinoom is zeldzaam, aangezien de meeste muizen sterven aan bloedarmoede of darminvaginatie vóór de progressie. Enkele van de langer levende modellen met minder adenomen ontwikkelen echter een adenocarcinoom dat invasief is in de submucosa (Colnot et al., 2004; Fodde et al., 1994; Robanus-Maandag et al., 2010). Metastase komt niet voor in ApcMin+/- muizen en is uiterst zeldzaam in verwante modellen (Fodde et al., 1994).

Chirurgisch pathologen die darmmonsters moeten analyseren, moeten zich bewust zijn van een valkuil bij de beoordeling van tumorinvasie in muismodellen. Omdat de lagen van de muis darm zijn dun en delicaat, herniation van goedaardige epitheel in submucosa is een gemeenschappelijk optreden (Boivin et al., 2003), vooral in de setting van rectale prolaps en in inflammatoire omstandigheden (Fig. 8a en b). Een gelijkaardige verplaatsing van adenomateus slijmvlies (pseudo-invasie) komt voor bij gestapelde colorectale adenomen bij de mens en bij colitis cystica profunda. Consensus richtlijnen voor het onderscheid tussen herniatie en invasief adenocarcinoom werden ontwikkeld op een Muismodellen van Intestinale Neoplasie Workshop in Jackson Laboratories in 2000 door een panel van wetenschappers en pathologen (Boivin et al., 2003) en zijn samengevat in Tabel 4. Het is misschien niet mogelijk om de diagnose invasief carcinoom met zekerheid te stellen, vooral in inflammatoire modellen of gebieden met prolaps, en evaluatie van oudere muizen met beter ontwikkelde laesies kan nodig zijn voor een sluitende vaststelling van invasie.

Invasie in de lamina propria wordt gekenmerkt door de ontwikkeling van hoekige cryptprofielen met individuele infiltrerende cellen en kan gepaard gaan met stromale veranderingen zoals desmoplasie en verhoogde ontstekingsceldichtheid (Fig. 9a en b).