Apocynin, a Low Molecular Oral Treatment for Neurodegenerative Disease

Abstract

Er zijn steeds meer aanwijzingen dat inflammatoire mediatoren, afgescheiden door geactiveerde of geïnfiltreerde aangeboren immuuncellen, een belangrijke invloed hebben op de pathogenese van neurodegeneratieve ziekten. Dit kan betekenen dat patiënten die lijden aan een neurodegeneratieve ziekte baat kunnen hebben bij behandeling met selectieve remmers van aangeboren immuunactiviteit. Hier bespreken we het therapeutisch potentieel van apocynine, een in wezen niet-toxische fenolische verbinding geïsoleerd uit de medicinale plant Jatropha multifida. Apocynine is een selectieve remmer van het fagocytaire NADPH-oxidase Nox2 die oraal kan worden toegepast en opmerkelijk effectief is bij lage dosis.

1. Inleiding

De ouder wordende samenlevingen worden geconfronteerd met een toenemende prevalentie van neurodegeneratieve ziekten. Enkele relatief prevalente voorbeelden zijn de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson en minder prevalent zijn de ziekte van Huntington en de ziekte van Lou Gehrig (amyotrofische laterale sclerose; ALS). Alle neurodegeneratieve ziekten hebben gemeen dat er geen effectieve behandeling bestaat die de geleidelijke achteruitgang van neurologische functies kan stoppen. Geen van de neuroprotectieve middelen die in de kliniek zijn getest, hebben een werkzaamheid die verder gaat dan symptoombestrijding.

De laatste jaren groeit het inzicht dat ontstekingsreacties van residente of geïnfiltreerde aangeboren immuuncellen een belangrijke invloed kunnen hebben op de pathogenese van neurodegeneratieve aandoeningen. Een erkende centrale speler is de microglia, een gliale cel die behoort tot de myeloïde lijn en vaak wordt aangeduid als de macrofaag van het CZS. Dit intrigerende nieuwe inzicht kan impliceren dat geneesmiddelen met bewezen werkzaamheid bij de bescherming van perifere organen tegen de cytotoxische functie van aangeboren immuuncellen, zoals mononucleaire of polymorfonucleaire fagocyten (resp. MNC’s en PMN’s), ook nuttig zouden kunnen zijn voor de behandeling van de neuroinflammatoire component van neurodegeneratieve ziekten. Een belangrijke hindernis die geneesmiddelen moeten nemen is het passeren van de bloed-hersenbarrière en het doordringen in het parenchym van het CZS waar het neurodegeneratieve proces plaatsvindt. In dit overzicht bespreken we preklinische studies die het potentieel aantonen van apocynine, een kleine fenolische antioxidant, als behandeling van neurodegeneratieve ziekten.

2. Apocynin, a Pharmacologically Active Plant Phenol

Apocyin (4′-hydroxy-3′-methoxyacetophenone or acetovanillone) was identified as the biologically active substance in the roots of Picrorhiza kurroa Royle ex Benth, a perennial plant growing in the alpine Himalaya. Extracten van de wortels worden in de Ayurvedische medische traditie van India en Sri Lanka gebruikt voor de bereiding van etnische geneesmiddelen voor de behandeling van kwalen van lever, hart, gewrichten en longen. Wij hebben een 95% ethanolisch wortelextract bereid onder gecontroleerde omstandigheden in het laboratorium en het preparaat onderworpen aan een activiteitsgestuurde zuivering met behulp van de oxidatieve uitbarsting van menselijke polymorfonucleaire/neutrofiele granulocyten (PMN) als een experimentele test voor acute ontsteking.

De uitleestest die we gebruikten was gebaseerd op de generatie van luminol-versterkte chemiluminescentie door menselijke PMN gestimuleerd met zymosan geopsoniseerd in menselijk serum. De essentie van de assay is dat de met serum geopsoneerde gistdeeltjes de PMN stimuleren via aan het oppervlak blootgestelde receptoren van immunoglobulinen of complementfactoren. De activeringssignalen die via deze receptoren worden doorgegeven, leiden tot het legen van de cytoplasmakorrels (degranulatie) en de assemblage van het fagocytaire NADPH-oxidase Nox2. Het Nox2 enzymcomplex wordt geassembleerd uit membraangebonden (, ) en cytoplasmatische (, , , en Rac2) subeenheden. Het assemblageproces omvat fosforylering van subeenheden door specifieke kinasen en de vorming van thiolbruggen. Het geassembleerde complex neemt elektronen op van NADPH en draagt deze over aan vrije moleculaire zuurstof wat leidt tot de vorming van superoxide anion (; één elektron reductie) en waterstofperoxide (H2O2; twee elektron reductie). Beide oxidanten hebben cytotoxische activiteit zoals kon worden aangetoond met rode bloedcellen van verschillende soorten. De oxidatieve uitbarsting van PMN omvat een cascade van sterk reactieve zuurstofspecies, collectief aangeduid als ROS (figuur 1). Door reactie van met stikstofmonoxide wordt het sterk cytotoxische peroxynitriet gevormd. In aanwezigheid van Fe2+-ionen wordt H2O2 omgezet in zeer reactieve hydroxylradicalen (OH-), die via peroxidatie van membraanlipiden de vloeibaarheid van de celmembranen aantasten. Myeloperoxidase dat vrijkomt bij degranulatie van de PMN katalyseert de reactie van H2O2 met halogenidemoleculen (Cl2, Br2, en J2) waarbij zeer toxische hypohaliden (OCl-, OBr-, en OJ-) worden gevormd. ROS zijn essentiële componenten van het intracellulaire doden van gefagocytiseerde microben, maar wanneer ze vrijkomen in het extracellulaire milieu zijn ze belangrijke mediatoren van de weefselvernietigende activiteit van geactiveerde PMN’s.

Figuur 1

Reactieve zuurstofspecies geproduceerd in de oxidatieve burst van de fagocyten. MPO: myeloperoxidase; NOS: stikstofoxide (NO) synthase.

Het is denkbaar dat componenten van chemisch complexe plantenextracten op meerdere niveaus kunnen interfereren met de uitleestest en ook niet-specifieke effecten kunnen uitoefenen, zoals het doden van PMN of het wegvangen van de oxyradicalen. Dit impliceert dat een succesvolle activiteitsgestuurde zuivering goed gericht moet zijn en zorgvuldig gecontroleerd moet worden op niet-specifieke effecten om vals-positieve resultaten te voorkomen. Ondanks deze hindernissen waren wij in staat een zeer specifieke activiteit van apocynine in de test aan te tonen. Apocynine bleek metabolisch geactiveerd te worden in een MPO-gekatalyseerde reactie met H2O2 waarbij een symmetrisch dimeer, diapocynine, werd gevormd (figuur 2). De waarneming dat het reactie-intermediair kon worden gevangen met GSH leidde ons tot de hypothese dat metabolisch geactiveerde apocynine de vorming van thiolbruggen tussen de membraangebonden en cytosolische componenten die functionele Nox2 assembleren zou kunnen blokkeren. Later werd echter ontdekt dat apocynine de superoxideproductie van Nox2 direct remt en dat deze activiteit onafhankelijk is van MPO. Een belangrijke bevinding met apocynine was dat het de oxidatieve uitbarsting van PMNs remt, zonder het intracellulair doden van bacteriën te belemmeren. Dit impliceert dat behandeling met apocynine collaterale schade aan weefsels geïnfiltreerd door geactiveerde PMN kan voorkomen zonder hun bacteriedodende functie te belemmeren.

Figuur 2

Remming van microglia Nox2 door metabolisch geactiveerd apocynine. Receptorgemedieerde activering van microgliacellen induceert de productie van reactieve zuurstofspecies en het vrijkomen van myeloperoxidase (MPO). De MPO-gekatalyseerde reactie van apocynine met H2O2 leidt tot de productie van een reactief tussenproduct dat stabiliseert door binding aan vrije thiolgroepen, bijvoorbeeld GSH, of door dimerisatie. Dimere apocynine (diapocynine) remt de activiteit van Nox2.

3. Werkzaamheid van apocynine in AIMID diermodellen

De eerste doelziekte waarin we het klinische effect van apocynine hebben getest was het WAG/Rij (RT-) rattenmodel van collageengeïnduceerde artritis (CIA), dat een aanvaard preklinisch model is van de auto-immuun ontstekingsziekte (AIMID) reumatoïde artritis (RA). In dit model hebben PMN’s een duidelijke pathogene rol, die de situatie bij RA patiënten weerspiegelt. In de studie met ratten kozen we ervoor apocynine toe te dienen in een dosisbereik van 0,3 tot 200 μg/mL drinkwater, dat ad libitum werd verstrekt. Er werd vastgesteld dat reeds bij de laagste dosis van 0,3 μg/mL, wat overeenkomt met een dagelijkse orale dosis van 6 μg, de artritis bijna volledig werd onderdrukt . Er werd geen effect van apocynine op de serumniveaus van anti-collageen autoantilichaam of van IL-6, een belangrijk pathogeen cytokine in CIA en RA, waargenomen, wat een hoge selectiviteit voor de inflammatoire component van de ziekte suggereert. Onafhankelijk van ons, toonden Hougee et al. in een muismodel voor CIA aan dat oraal toegediende apocynine de geblokkeerde productie van kraakbeenproteoglycaan in het artritische gewricht herstelt. Een intrigerend neveneffect van de behandeling, ter illustratie van het krachtige ontstekingsremmende effect van apocynine, was de dramatische onderdrukking van de necrotiserende huidlaesies op de plaatsen waar het immuniserende antigeen/CFA formulering was ingespoten .

Nadat apocynine in 1990 voor het eerst werd geïdentificeerd als een krachtig ontstekingswerend middel, is het een gevestigde remmer geworden van de oxidatieve uitbarsting in neutrofielen, zoals aangetoond in een breed scala van in vivo modellen voor immuungemedieerde ontstekingsaandoeningen die perifere en centrale organen aantasten. Van bijzonder belang voor dit overzicht zijn de veelbelovende klinische effecten die zijn waargenomen in modellen van neurodegeneratieve ziekten, waaronder ALS, Alzheimer en de ziekte van Parkinson. In deze modellen is de antioxidantwerking van apocynine niet gericht op de neutrofielen, maar op de “macrofagen van de hersenen”, dat wil zeggen de microglia.

4. Microglia

De hersenen bevatten verschillende celtypen met het vermogen om immuunfuncties uit te oefenen, waaronder astrocyten, microgliacellen en macrofagen die zich in de hersenvliezen en de perivasculaire ruimten van hersenslagaders en -haarvaten bevinden. Voor hun immuuntaken zijn deze cellen uitgerust met geconserveerde receptoren voor pathogeen-geassocieerde of schade-geassocieerde moleculaire patronen, die activeringssignalen doorgeven aan de cellen voor het induceren van ontstekingseffectiemechanismen.

Microglia zijn aangeboren immuuncellen die alomtegenwoordig zijn in het centrale zenuwstelsel, waar zij betrokken zijn bij nauwe interacties met neuronen, oligodendrocyten, en astrocyten. Echter, alleen microglia geven MPO af na stimulatie, een vereiste voor de metabole activering van apocynine.

Microglia in het gezonde CZS hebben een wijdvertakt rustfenotype. In tegenstelling tot eerdere concepten zijn microglia in de gezonde hersenen niet in rust, maar zijn het zeer dynamische cellen die homeostatische bewaking van de extracellulaire omgeving uitvoeren door de uitbreiding en terugtrekking van hun uitsteeksels en fagocytose van weefselresten, die anders een ontsteking zouden kunnen veroorzaken. Geactiveerde microglia worden aangetroffen in ziek weefsel van het CZS, zoals binnen gedemyeliniseerde corticale grijze stof laesies in de MS hersenen, rond amyloïde plaques in Alzheimer hersenen en in de degenererende substantia nigra bij de ziekte van Parkinson . Hoewel de diverse expressieprofielen van microglia een breed, ononderbroken spectrum van activeringstoestanden lijken te weerspiegelen, kunnen twee activeringstoestanden aan beide uiteinden van het spectrum worden herkend, die overeenkomen met de M1- en M2-toestand die voor macrofagen wordt aangewezen. “Klassiek geactiveerde” M1 microglia, bijvoorbeeld geïnduceerd door LPS of IFNγ, hebben pro-inflammatoire functies die worden uitgeoefend door de secretie van pro-inflammatoire cytokines zoals TNF-α, IL-1β, en IL-12 en toxische stoffen zoals reactieve zuurstof- en stikstofspecies. “Alternatief geactiveerde” M2 microglia, zoals geïnduceerd in een milieu met hoge IL-4 of IL-13 niveaus, hebben anti-inflammatoire en weefselregeneratieve activiteiten, die gemedieerd worden door cytokines zoals IL-4, IL-10, of TGF-β en herstelfactoren zoals insuline-achtige groeifactor, arginase-1, of chitinase-like-1. Niet alleen het cytokinenmilieu, maar ook de redox-toestand van de micro-omgeving, die rechtstreeks verband houdt met de NADPH oxidase activiteit, bepaalt de functionele differentiatie van microglia naar een M1 of M2 fenotype .

5. Apocynin as a Potential Treatment of Neurodegenerative Disease

M1 microglia cells are the main resource of Nox2 in the brain. De expressie door M1 microglia van geactiveerd Nox2 dat ROS produceert is een essentieel onderdeel van microglia-gemedieerde neurotoxiciteit. De algemeen aanvaarde notie dat microglia-afgeleide ROS belangrijke mediatoren zijn van neurodegeneratieve hersenschade doet de vraag rijzen of het gunstige farmacologische profiel en de lage toxiciteit van apocynine kunnen gebruikt worden voor neuroprotectieve behandeling. Microgliacellen brengen niet alleen Nox2 tot expressie maar scheiden ook MPO af na activatie en zouden dus mogelijk de metabole activatie van apocynine kunnen bewerkstelligen. Verschillende auteurs hebben melding gemaakt van het gunstige effect van apocynine op (modellen van) acute neurologische aandoeningen, zoals ischemie, intracerebrale bloeding, en beroerte (besproken in ). Wat zijn de vooruitzichten voor apocynine bij chronische neurodegeneratieve aandoeningen?

In vitro studies met gekweekte microglia hebben Nox2-afgeleide ROS betrokken bij de proliferatie en functionele polarisatie van microglia. Een cruciale bevinding is dat remming van Nox2 alternatieve en anti-inflammatoire microglia activatie bevordert tijdens neuro-inflammatie. Dit impliceert dat onderdrukking van Nox2 met apocynine een gezond evenwicht zou kunnen herstellen tussen een pro-inflammatoir M1 en een anti-inflammatoir/regeneratief M2 fenotype van microglia. Anderen hebben aangetoond dat apocynine de productie van IL-1β, TNF-α en stikstofmonoxide door microglia verlaagt, waardoor een zichzelf in stand houdende cyclus van schadelijke activiteit wordt onderbroken. Hoewel het precieze neurotoxische mechanisme van geactiveerde microglia bij neurodegeneratieve ziekten nog onzeker is, is het ook van groot belang dat het vrijkomen van het excitotoxine glutamaat Nox2 activiteit vereist en dat dit kan worden geremd door apocynine. Alles bij elkaar wijzen deze gegevens op een mogelijk gunstige rol van apocynine bij neurodegeneratieve ziekten. Inderdaad, veelbelovende effecten van apocynine zijn waargenomen in muismodellen van een aantal belangrijke neurodegeneratieve ziekten.

Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS, Lou Gehrig Disease). Amyotrofische laterale sclerose is een veel voorkomende neurodegeneratieve ziekte die bij volwassenen ontstaat en motorische neuronen aantast. De ziekte leidt tot een snel voortschrijdende motorische stoornis en de dood, gewoonlijk binnen 5 jaar. Terwijl bij de meerderheid van de patiënten de oorzaak van de ziekte onbekend is, heeft de ziekte in een deel van de gevallen een genetische oorzaak, namelijk mutaties in het superoxide dismutase-1 (SOD1)-gen. De mutatie versterkt de oxidatieve stress door een ontregelde productie van superoxide anion als gevolg van een verminderde desmutatie tot H2O2. Mutante SOD1 expresserende astrocyten worden in verband gebracht met de ALS pathologie door hun verminderde capaciteit om glutamaat te absorberen en/of door hun afgifte van neurotoxische factoren. Selectieve silencing van mutant SOD1 of vervanging van mutant door wild-type microglia in het mutant SOD1 muismodel wijzen sterk op een centrale pathogene rol van microglia. Harraz et al. hebben orale apocynine gebruikt om de progressie van neurodegeneratie in een SOD1 mutant muismodel te controleren en veelbelovende effecten waargenomen; er werd waargenomen dat toediening van apocynine in het drinkwater de overleving aanzienlijk verlengde en het begin van motorische defecten vertraagde. Deze studie toont aan dat oraal toegediend apocynine een voldoende hoge concentratie kan opbouwen binnen het parenchym van het CZS om de neurotoxische niveaus van ROS-productie te matigen. Deze veelbelovende gegevens konden echter niet worden gereproduceerd in een andere studie met dezelfde mutante muizenstam.

De ziekte van Alzheimer (AD). De ziekte van Alzheimer is een ouderdomsgeassocieerde progressieve neurologische aandoening die leidt tot onomkeerbare dementie. Neuropathologische kenmerken van de ziekte van Alzheimer zijn seniele plaques van verkeerd gevouwen en gefibrilleerde amyloïd-β-aggregaten en intraneuronale kluwens van tau-eiwit in de hersenschors. Geactiveerde microglia cellen werden aangetroffen rond seniele plaques en produceren neurotoxische stoffen zoals ROS, NO, en TNF-α. Activering van microglia Nox2 door oligomere en/of fibrillaire amyloid-β en expressie van geactiveerde Nox2 in Alzheimer hersenen zijn gerapporteerd.

Lull et al. hebben apocynine getest in een dagelijkse orale dosis van 10 mg/kg via het drinkwater in een hAPP transgeen muismodel van AD . Zij zagen bij met apocynine behandelde muizen een significante vermindering van de grootte van de plaque in de cortex en de hippocampus en een vermindering van het aantal microglia in de cortex, maar niet in de hippocampus. Een gedragskenmerk van AD dat in dit muizenmodel werd waargenomen, namelijk de prestatie in de Morris waterdoolhof zwemtest, waarbij het ruimtelijk geheugen in de hippocampus wordt getest, werd echter niet duidelijk verbeterd door de behandeling. Het beperkte klinische effect van apocynine in het model zou te wijten kunnen zijn aan de afwezigheid van duidelijke neuro-inflammatie, terwijl deze meer op de voorgrond treedt bij AD-patiënten, en aan het feit dat plaquevorming niet noodzakelijk cognitieve achteruitgang voorspelt.

Ziekte van Parkinson (PD). Het pathologische kenmerk van PD is een progressieve degeneratie van dopamineproducerende neuronen in de substantia nigra (SN), een gepigmenteerde structuur onder in de middenhersenen. Via de vrijgave van dopamine speelt de SN een centrale rol in de coördinatie van verschillende neurologische functies, waaronder beloning, verslaving en beweging. Deze laatste functie is bijzonder verstoord bij PD. Om het dopamineverlies te compenseren wordt een metabolisch stabiele precursor van dopamine (L-DOPA) toegediend, wat bij een aanzienlijk aantal patiënten typische onwillekeurige bewegingen veroorzaakt die bekend staan als het hyperkinetisch syndroom. Terwijl bij de overgrote meerderheid van de (sporadische) PD-patiënten de oorzaak van de ziekte niet bekend is, is bij een klein deel een genetische oorzaak gevonden, namelijk mutaties in verschillende genen, waaronder alfa-synucleïne, parkine, leucinerijke repeat kinase 2, PTEN-geïnduceerd putatief kinase 1, en ATP13A2 . De waarneming dat gebruikers van met MPTP besmette heroïne PD-symptomen ontwikkelden, maakte het mogelijk een klinisch relevant dierlijk PD-model te genereren. Na omzetting van MPTP in MPP+ door monoamine oxidase B in astrocyten, wordt MPP+ geconcentreerd in dopaminerge cellen via opname door de specifieke dopamine transporter, waar het complex I van de mitochondriale ademhalingsketen blokkeert. De resulterende redox stress veroorzaakt onder andere een ontregeling van cellulair Ca2+ wat leidt tot celdood. Net als bij ALS en AD wordt neurodegeneratie bij PD geassocieerd met microglia Nox2 activatie, waarvan wordt aangenomen dat het in belangrijke mate bijdraagt aan het pathogene proces.

Gao et al. toonden met een in vitro systeem aan dat ROS gegenereerd door microglia Nox2 de gevoeligheid van dopaminerge neuronen voor MPP+ verhoogt. Een gunstig effect van apocynine op neurotoxische effecten gemedieerd door microglia is aangetoond in een muismodel van PD.

6. Het effect van apocynine in een niet-menselijk primatenmodel voor de ziekte van Parkinson

Repetitieve injectie van een lage dosis MPTP bij gewone penseelaapjes, een neotropische primaat met een klein lichaam, wekt een neurologische ziekte op die op het niveau van klinische en neuropathologische presentatie PD sterk benadert. Wij hebben dit MPTP-model gebruikt bij 5 penseelaapjes tweelingen om te testen of orale toediening van apocynine ook effectief is bij een hogere soort. Voor orale toediening werd apocynine opgelost in Arabische gom; één broer of zus van elke tweeling kreeg apocynine met gom en de andere kreeg alleen de gom. De behandeling met apocynine (100 mg/kg, TID) begon een week voor de inductie van PD met MPTP (1 mg/kg, via onderhuidse injectie gedurende 8 dagen). Apocynine beperkte het typische lichaamsgewichtsverlies dat gepaard gaat met het parkinson-syndroom. Ook de motorische functie in de met apocynine behandelde apen was verbeterd, wat wijst op een anti-Parkinson werkzaamheid van apocynine. Bovendien werd het aantal overlevende dopamineneuronen verhoogd door apocynine, wat wijst op een neuroprotectieve werkzaamheid. Opmerkelijk is dat apocynine een vergelijkbare moleculaire structuur heeft als homovanillinezuur (HVA), een metaboliet van dopamine. Een verklaring voor de beschermende werking van apocynine bij PD zou ook verband kunnen houden met de compensatie van het verlaagde niveau van het natuurlijk beschikbare o-methoxycatechol HVA.

7. Perspectief voor de behandeling van menselijke patiënten

Apocynine is een potentieel aantrekkelijk oraal prodrug vanwege zijn lage algemene toxiciteit en het feit dat zijn specifieke antioxidantwerking wordt opgewekt na metabole activering door MPO vrijmakende fagocyterende cellen. Veiligheidsgegevens van apocynine zijn schaars, maar uit de beschikbare gegevens blijkt een lage toxiciteit en een hoge stabiliteit (gedeeltelijk besproken in ). De LD50 na orale toediening bij muizen is geschat op 9 g/kg. Bij ratten werd ongeveer 80% van de intraperitoneaal ingespoten apocynine van 120 mg/kg in onveranderde vorm teruggevonden in een urinemonster dat 20 uur later werd afgenomen. Een intraveneuze dosis van 420 mg/kg apocynine bij muizen veroorzaakte minimale tekenen van toxiciteit.

Voor zover ons bekend is apocynine niet getest bij patiënten met neurodegeneratieve ziekten bij de mens. Peters et al. hebben echter het therapeutisch potentieel van geïnhaleerde apocynine op ozon-geïnduceerde bronchiale hyperresponsiviteit aan methacholine bij astmatische patiënten als een model van inflammatoire longziekte geëvalueerd . De auteurs konden het wegvangen van ozon door apocynine uitsluiten en concludeerden dat het effect bestond uit het afzwakken van de ROS productie door PMNs en eosinofielen die bij blootstelling aan ozon in de long waren geïnfiltreerd.

De muisstudies die in dit overzicht worden besproken tonen aan dat lage doses apocynine, toegediend via de orale route, het parenchym van het CZS bereiken in een concentratie die voldoende is om de oxidatieve burst van de microglia te remmen en neurodegeneratie tegen te gaan. Rekening houdend met de zeer lage systemische toxiciteit en het zeer specifieke werkingsmechanisme van apocynine zou het een aantrekkelijk perspectief zijn om de therapeutische waarde bij menselijke neurodegeneratieve ziekten te testen.

Conflict of Interests

De auteurs verklaren dat er geen belangenverstrengeling is met betrekking tot de publicatie van dit artikel.

Acknowledgment

De auteurs willen graag de heer Henk van Westbroek (BPRC) bedanken voor het voorbereiden van het artwork.