Aporfine alkaloïden uit Ocotea macrophylla (Lauraceae)

ARTIGO

Aporfine alkaloïden uit Ocotea macrophylla (Lauraceae)

Ludy Cristina Pabon*; Luis Enrique Cuca

Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Bogotá, KR 30 45 03, Colombia. AA 14490

ABSTRACT

Vier aporfinealkaloïden uit het hout van Ocotea macrophylla (Lauraceae) werden geïsoleerd en gekarakteriseerd als (S)-3-methoxy-nordomesticine (1), (S)-N-ethoxycarbonyl-3-methoxy-nordomesticine (2), (S)-N-formyl-3-methoxy-nordomesticine (3) en (S)-N-methoxycarbonyl-3-methoxy-nordomesticine (4); alkaloïden 2-4 worden voor het eerst gerapporteerd. De structuur van de geïsoleerde verbindingen werd bepaald op basis van hun spectrale gegevens en door vergelijking van hun spectrale gegevens met in de literatuur beschreven waarden. De alkaloïdenfractie en verbinding 1 vertoonden antischimmelactiviteit tegen Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici en verbinding 1 vertoonde ook antimicrobiële activiteit tegen Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis.

Keywords: Ocotea macrophylla; aporfine alkaloïden; Lauraceae.

INLEIDING

Het geslacht Ocotea (Lauraceae) omvat meer dan 350 soorten die voorkomen op het Amerikaanse continent en in zuidelijk Afrika.1,2 In Colombia zijn er 35 Ocotea-soorten verspreid over het hele land, voornamelijk in de bossen van de Andes.3 In de traditionele geneeskunde hebben sommige Ocotea-soorten verschillende toepassingen laten zien. O. quixos wordt gebruikt als ontsmettingsmiddel, plaatselijk verdovingsmiddel en antidiarreemiddel.4 O. lancifolia wordt gebruikt als antiparasiticum, en O. caparrapi wordt gebruikt om insectenbeten, slangenbeten, bronchitis en kankertumoren te behandelen.5,6

Chemisch gezien is het Ocotea geslacht vooral bekend als bron van metabolieten van het type furofuran7 en tetrahydrofuran lignanen,8 bicyclooctane9 en benzofuran neolignanen,10 en benzylisoquinoline11 en aporphine alkaloïden.5 In eerdere studies werden vier aporfinealkaloïden uit het hout van Ocotea macrophylla geïsoleerd en geïdentificeerd als nantenine, glaucine, isocorydine en dehydronantenine.12,13 In dit artikel beschrijven we de isolatie en structuurbepaling van drie nieuwe aporfinealkaloïden 2-4 naast (S)- 3-methoxy-nordomesticine 1 en de rapporten antibacteriële en schimmelwerende activiteiten van de verbindingen.

RESULTAAT EN DISCUSSIE

Het ethanolische extract van de stam van O. macrophylla werd onderworpen aan een zuur-base-extractie om een alkaloïdale fractie te verkrijgen, die verder werd gefractioneerd en gezuiverd met chromatografische methoden, wat leidde tot de isolatie van vier alkaloïden: (S)-3-methoxy-nordomesticine (1), (S)-N-ethoxycarbonyl-3-methoxy-nordomesticine (2), (S)-N-formyl-3-methoxy-nordomesticine (3) en (S)-N-methoxycarbonyl-3-methoxy-nordomesticine (4). De structuren van de alkaloïden 1-4 worden getoond in figuur 1 en de spectroscopische gegevens in tabel 1.

Het signaal bij δH 6,30 (1H, s) vertoonde geen connectiviteit in het HMQC-experiment, wat duidt op de aanwezigheid van een fenolische OH-groep, ondersteund door IR. Analyse van de HMBC spectrum kan de locatie van de substituenten, volgens de correlaties waargenomen tussen de signalen op δH 5,94 en 5,95 (voor de methyleendioxy groep) met de signalen op δC 145,9 (C-9) en 146.2 (C-10), en deze laatste twee signalen met de protonen op respectievelijk δH 6,70 (H-8) en 7,90 (H-11), hetgeen de aanwezigheid suggereert van een methyleendioxygroep op de posities 9 en 10 en twee hydrogenen op de aromatische ring in een para-oriëntatie. De aanwezigheid van de hydroxylgroep op positie 1 is bepaald met behulp van correlaties tussen de signalen bij δH 6.30 en δC 116.5, toegewezen aan C-11b. De plaats van de methoxylgroepen op de posities C-2 en C-3, is bepaald volgens de correlatie van de hydrogenen bij δH 3,96 en 3,86 met de koolwaterstoffen bij δC 138,4 (C-2) respectievelijk δC 147,8 (C-3).

De absolute configuratie van C-6a is toegewezen als S, omdat deze een negatief Cottoneffect bij 280 nm en een positief Cottoneffect bij 240 nm in de CD-curve heeft.17 Bovendien werd dit bevestigd door de positieve waarde van de optische rotatie 25D = +51,7 (c 0,38, CHCl3).18 Daarom werd alkaloïde 1 gedetermineerd als (S)-3-methoxy-nordomesticine, een aporfine alkaloïde dat eerder werd gerapporteerd uit Nectandra sinuata19 , eveneens behorend tot de familie van de Lauraceae. Dit rapport corrigeert en completeert de spectroscopische gegevens voor deze verbinding.

Alkaloid 2 werd verkregen als een gele olie die een positieve reactie geeft op Dragendorff-reagens en de optische draaiingswaarde was 25D 25D = +33,3 (c 0,60, CHCl3). Het UV- en IR-spectrum van 2 waren vergelijkbaar met die van 1, behalve voor het verschijnen, in beide spectra, van absorpties te wijten aan een carbamaatgroep bij 282 nm en bij 1688 cm-1, respectievelijk.20 De 1H- en 13C NMR-spectra vertoonden een vergelijkbaar profiel als 1. In de 1H NMR verschenen twee nieuwe signalen bij δH 4,29 (2H, m) en 1,29 (3H, m), evenals de verplaatsing van het signaal H-5, als gevolg van de aanwezigheid van een deprotecterende groep in de nabijheid. Het COSY-experiment toonde de correlatie aan van de signalen δH 4.29 en 1.29, hetgeen wijst op de aanwezigheid van een ethylgroep die door zijn verplaatsing suggereerde aan een heteroatoom te zijn verbonden. De 13C NMR en DEPT spectra toonden het verschijnen van drie nieuwe signalen bij δC 158,8 (C), 61,0 (CH2), en 14,8 (CH3), typische signalen van een ethoxycarbonylgroep verbonden aan een stikstofatoom. De absolute configuratie van C-6a werd bepaald als S, omdat het dezelfde Cotton-effecten vertoonde als 1. Daarom werd de alkaloïde verbinding 2 geïdentificeerd als (S)-N-ethoxycarbonyl-3-methoxy-nordomesticine. Het ESIMS-spectrum ervan gaf een pseudomoleculaire ionenpiek bij m/z 414 + die overeenkomt met de molecuulformule C22H22NO7, en de fragmentaties waren te wijten aan het verlies van CH3OH en CH3CH2OH bij m/z 382 + en m/z 368 +, respectievelijk. Het ESI-spectrum in de negatieve ionenstand vertoonde pieken bij m/z 412 – en m/z 383 ., waarbij de laatste het verlies van een ethylgroep was. Dit type alkaloïden met substituenten N-ethoxycarbonyl zijn geïsoleerd uit Lindera angustifolia (Lauraceae).21

Alkaloïde 3, werd verkregen als een gele olie, met een optische draaiingswaarde van 25D 25D = +7,5 (c 0,53 CHCl3). Het IR-spectrum was vergelijkbaar met dat van alkaloïden 1 en 2. Bovendien werd de aanwezigheid van absorpties bij 2830, 2700 en 1739 cm-1 waargenomen, karakteristiek voor de formylgroep. In de negatieve modus van HRESIMS werd het pseudomoleculaire ion – bij m/z 369.1133, dat overeenkomt met de molecuulformule van C20H20NO6 – waargenomen. De negatieve ionmodus van ESI-MS spectra toonde het verlies van een formylgroep bij m/z 339 … Het NMR profiel was vergelijkbaar met die van de alkaloïden 1 en 2. In de 1H NMR verschenen verschillende signalen die behoren tot een mengsel van twee isomeren in een 3:1 verhouding. De vergelijking van de belangrijkste isomeer met alkaloïde 1 in NMR, toonde hetzelfde patroon van substitutie van de aromatische ring, naast het verschijnen van twee nieuwe signalen bij δH 8,25 (1H, s) in de 1H en bij δC 161,9 in de 13C van de formylgroep aan 3. Deze functionaliteit op de stikstof leidde tot de vorming van rotatie-isomeren, die eerder zijn beschreven voor alkaloïden met een N-formyl en N-acetyl groep.22 De absolute configuratie werd bepaald als S, op dezelfde manier als die voor 1 en 2. Daarom werd deze alkaloïde 3 geïdentificeerd als (S)-N-formyl-3-methoxy-nordomesticine.

Alkaloïde 4 werd verkregen als een witte vaste stof met een smeltpunt van 222-223 ºC (MeOH), en met een optische draaiing van 25D 25D = +47,0 (c 0,55 CHCl3). De analyse van NMR gegevens van 4 toonde aan dat het hetzelfde basisskelet heeft als 2, maar het heeft een methylester volgens de signalen bij δH 3,76 (3H, s) en δC 52,6 voor 4 in plaats van de signalen voor de ethylgroep in 2. HRESIMS toonde een pseudomoleculair ion – bij m/z 398,1233 overeenkomend met de molecuulformule C22H22NO7. Daarom werd de alkaloïde 4 geïdentificeerd als (S)-N-methoxycarbonyl-3-methoxy-nordomesticine.

De schimmelwerende activiteit werd geëvalueerd door middel van de schijfdiffusiemethode tegen Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,23 een fytopathogene schimmel die tomatengewassen aantast en grote verliezen veroorzaakt voor boeren. De alkaloïdenfractie was actief tegen F. oxysporum bij 250 μg/μL. De remmende activiteit tegen de groei van de schimmels was matig bij 5 μg/μL voor (S)-3-methoxy-nordomesticine 1, terwijl de andere alkaloïden niet effectief waren, wat suggereert dat de aanwezigheid van elektron-terugtrekkende substituenten op het stikstofatoom de antischimmelactiviteit verminderen.

Hoewel er weinig evaluatierapporten zijn van de antischimmelwerking van aporfines, is gebleken dat deze actief zijn tegen soorten als Candida albicans,24,25 maar inactief tegen schimmelpathogenen als Cladosporium herbarium.26 Deze resultaten zijn een nieuw evaluatierapport van de antischimmelactiviteit van deze alkaloïden, waarbij wordt benadrukt dat het type substituenten op de stikstof van aporfines een effect heeft op de antischimmelactiviteit die ze vertonen.

De antibacteriële activiteit werd geëvalueerd door radiale diffusiemethode gerapporteerd door Lerhrer27 tegen twee Gram (+) standaardstammen: Staphylococcus aureus 6538 en Enterococcus faecalis 29212 en drie Gram (-): Escherichia coli 25922 en Salmonella tiphymurium, stammen MS7953 en 14028s. Alkaloïde 1 (2,5 μg) vertoonde antimicrobiële activiteit tegen de beide beoordeelde Gram-positieve bacteriën met waarden van 30 AU, zoals weergegeven in tabel 2.

Voor het racemisch mengsel van de verbinding 3-methoxy-nordomesticine is de activiteit tegen E. coli (MIC= 256 μg/mL) en S. aureus (MIC= 512 μg/mL) gerapporteerd,28 maar in dit geval is de verbinding 1 niet actief tegen E. coli.

coli.

Zoals bij de schimmelwerende activiteit, tonen de resultaten aan dat de aard van de substituent op stikstof de antibacteriële activiteit beïnvloedt (tabel 2).

EXPERIMENTEEL

Algemene procedures

Het smeltpunt werd bepaald met behulp van Mel-temp Fisher Johns, Laboratory Device. UV-spectra werden opgenomen op een Perkin Elmer Lambda 2S en CD-spectra op een JASCO J-720 spectrometer. IR spectra werden verkregen op Perkin Elmer FT-IR Panagon 500 series 1000 als dunne film. Optische rotaties werden geregistreerd met een Schmidt-Haensch polarimeter. 1H- (400 MHz) en 13C- (100 MHz) NMR-spectra, alsmede 2D-spectra (COSY, HMQC en HMBC) werden uitgevoerd op een Bruker Avance 400 MHz spectrometer met CDCl3 als interne referentie. HRMS werden bepaald op een Shimadzu LCMS-IT-TOF massaspectrometersysteem met ESI in positieve ionenstand en negatieve ionenstand. Kolomchromatografie (CC) werd uitgevoerd met silicagel (70-230 en 230-400 mesh, Merck), en analytische chromatografie werd uitgevoerd met silicagel 60 PF254 (0,25 mm).

Plantenmateriaal

De stengels van O. macrophylla werden in juli 2006 verzameld in Nocaima, Colombia door W. Delgado. Het botanische specimen werd geïdentificeerd door A. Jara, en een voucher specimen (COL-517191), en werd gedeponeerd in het Colombiaanse Nationaal Herbarium van de Nationale Universiteit van Colombia, Bogotá, Colombia.

Extractie en isolatie

Gedroogde en aangedreven stengels (2,0 kg) van Ocotea macrophylla werden geëxtraheerd met EtOH door maceratie bij kamertemperatuur en geconcentreerd in vacuüm om een extract te verkrijgen (102,6 g). Een monster (48,9 g) van dit extract werd met ultrageluid in water opgelost en met 5% HCl aangezuurd tot pH 2,0. De zure suspensie werd vervolgens gefiltreerd en met 20% NaOH tot pH 8,0 gebaseeerd, en achtereenvolgens met chloroform geëxtraheerd. De chloroformfractie (3,01 g) werd onderworpen aan kolomchromatografie met silicagel en geëlueerd met een gradiënt van petroleumether:AcOiPr (4:6 tot 0:10) en AcOiPr:MeOH (10:0 tot 0:10), waardoor vier fracties (I-IV) werden verkregen. Fractie I (347 mg) werd herhaaldelijk in een kolom (CC) op silicagel gechromatografeerd en geëlueerd met n-hexaan:AcOiPr (9:1-8:2), CHCl3, en Tol:AcOiPr 7:3. Dit leverde alkaloïden 1 (7 mg) en 2 (4 mg) op. Fractie II (250 mg) werd onderworpen aan kolomchromatografie op silicagel en geëlueerd met CHCl3:AcOEt (85:15), en vervolgens onderworpen aan CC op Sephadex LH-20 (CH3OH) om alkaloïde 3 (8 mg) op te leveren. Fractie IV (1433 mg) werd gezuiverd door herhaalde kolomchromatografie op silicagel met CH2Cl2:MeOH 97:3 en CH2Cl2 als elutiesystemen. Tenslotte leverden opeenvolgende wasbeurten met MeOH alkaloïde 4 (98 mg) op.

Antischimmelonderzoek

F. oxysporum werd verkregen uit de cultuurcollectie van de Universiteit van Cundinamarca (Departement Landbouwkunde, Laboratorium voor Fytopathologie). PDA werd gebruikt als medium voor antifungale activiteitstesten. Het kweekmedium werd geënt met 100 μl van een oplossing van 105 sporen. De monsters werden bereid in oplossingen van verschillende concentraties, overeenkomend met 50, 25 en 10 μg/μL van de alkaloïdenfractie en 5, 2,5 1,0, 0,5, 0,2 en 0,1 μg/μL van de zuivere alkaloïden. Tien microliter van de monsters werden op de filtreerpapierschijfjes aangebracht en op het geïnoculeerde medium geplaatst. De platen werden verzegeld en gedurende 3 dagen bij 25 °C in een incubator geplaatst. Duidelijke zones die tegen een groeiende schimmel verschijnen, geven de minimale hoeveelheid fractie of alkaloïde aan die nodig is om de groei van de schimmel te remmen. Voor elke behandeling werden drie replicaten gemaakt. Benomyl (benzimidazol – 5 μg) werd gebruikt als positieve controle, en aceton diende als negatieve controle.23

Antibacteriële bepalingen

De antibacteriële activiteit werd geëvalueerd met radiale diffusiemethode, aangepast aan de methodologie die eerder door Lehrer werd gepubliceerd.27 De verbindingen werden geëvalueerd tegen twee Gram (+)-stammen: Staphylococcus aureus ATCC 6538 en Streptococcus fecalis ATCC 29212 en drie Gram (-) stammen: Escherichia coli ATCC 25922 en Salmonella tiphymurium, ATCC 14028s en Salmonella tiphymurium MS7953. Een kolonie geïsoleerd van elke stam, werd gedeponeerd in 3 mL soja trypticase (TSB) voor Gram (+) stammen en Luria bouillon (LB) voor Gram (-) stammen, en werden geïncubeerd bij 37 ° C onder roeren, totdat de micro-organismen waren in de logaritmische fase. Het supernatant werd verwijderd en het verkregen sediment werd geresuspendeerd in fosfaatbuffer (PBS), gevolgd door spoelen met PBS en centrifugeren. Ten slotte werd het sediment geresuspendeerd in PBS en werd de optische dichtheid bepaald bij 620 nm om het aantal CFU (kolonievormende eenheden) per milliliter te berekenen. In elk schaaltje wordt een bepaald volume gedispergeerd dat 4 x 107 CFU bevat. Het gemeten volume werd gemengd en gehomogeniseerd in 15 ml agarose gesmolten bij min of meer 45 °C. Deze bacteriële suspensie werd geserveerd in petrischalen en liet stollen bij kamertemperatuur, waarna werden gemaakt van 2 mm diameter gaten met een steriele punch.

De proefmonsters werden bereid oplossen van 1 mg van de zuivere verbinding in 500 pi DMSO, die 8 pi van het monster in tweevoud en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Na deze tijd werd de voedingsbodem toegevoegd, die gesmolten agar-agar en TSB bevat, gedurende 18 uur bij 37 ºC geïncubeerd en vervolgens werd de diameter van de remmingszones gemeten aan de hand van de activiteit van de verbinding. Als positieve controles werden verschillende antibiotica gebruikt, Ampicilline (50 mg/ml), Kanamycine (10 mg/ml) en Tetracycline (4,12 mg/ml) in een verdunning 1:100 in PBS en als negatieve controles werden DMSO en PBS gebruikt, waarbij elke controle 8 μL per putje opleverde. De diameters van de remmingszones werden gemeten in millimeters en de resultaten werden gerapporteerd als eenheden van activiteit volgens de verhouding die bepaalt dat 1 eenheid van actie (UA) gelijk is aan 0,1 mm van de remmingszone.

SUPPLEMENTARY MATERIAL

ACKNOWLEDGMENTS

De auteurs willen de Nationale Universiteit van Colombia bedanken voor de financiële steun voor dit project. Ook het Nucleaire Magnetische Resonantie Laboratorium en het massaspectrometrie laboratorium worden erkend voor hun steun bij het opnemen van de NMR spectra en de HR-ESI-MS, respectievelijk. Verder willen de auteurs de Javeriana Universiteit bedanken voor de optische rotaties, de FIDIC (Foundation Institute of Inmunology of Colombia) voor het opnemen van de CD spectra en in het bijzonder aan Prof. J. M. Lozano voor het assays antibacteriële activiteit.

1. Takaku, S.; Haber. W.; Setzer, W.; Biochem. Syst. Ecol. 2007, 35, 525.

2. Guerrini, A.; Sacchetti, G.; Muzzolli, M.; Moreno, G.; Medici, A.; Besco, E.; Bruni R.; J. Agric. Food Chem. 2006, 54 , 7778.

4. Ballabeni, V.; Tognoli, M.; Bertoni, S.; Bruni, R.; Guerrini, A.; Moreno, G.; Barocelli, E.; Pharmacol. Res. 2007, 55, 23.

5. Fournet, A.; Ferreira, M.; Rojas, A.; Guy, I.; Guinaudeau, H.; Heinzen, H.; Fitoterapia. 2007, 78, 382.

6. Palomino, E.; Maldonado, C.; J. Nat. Prod. 1996, 59, 77.

7. Marques, R.; Batistuzzo, S.; Silva, C.; Barbosa, J.; Fassarella, L.; Mutat. Res. 2003, 536, 117.

8. López, H.; Valera, A.; J. Nat. Prod. 1995, 58, 782.

9. Zschocke, S.; Staden, J.; Paulus, K.; Bauer, R.; Horn, M.; Munro. O.; Brown N.; Drewes, S.; Phytochemistry 2000, 54, 591.

10. Lordello, A.; Yoshida, M.; Phytochemistry 1997, 46, 741.

11. Silva, I.; Barbosa, J.; Silva, M.; Lacerda C. da-Cunha, E.; Biochem. Syst. Ecol. 2002, 30, 881.

12. Franca, N.; Giesbrecht, A.; Gottlieb, O.; Malgalhaes, A.; Malgalhaes, E.; Maia, J.; Phytochemistry 1975, 14, 1671.

13. Warrumby, S.; Lordello, A.; Quim. Nova 2007, 30, 92.

14. Wu, Y.; Chao, Y.; Chang, F.; Chen, Y.; Phytochemistry 1996, 46, 181.

15. Mathouet, H.; Elomri, A.; Lameiras, P.; Daich, A.; Vérité, P.; Phytochemistry 2007, 68, 1813.

16. Tantisewie, B.; Pharadai, T.; Pandhuganont, M.; Guinaudeau, H.; Freyer, A.; Shamma, M.; J. Nat. Prod. 1989, 52, 652.

17. Ringdahl, B.; Chan, R.; Craig, J.; J. Nat. Prod. 1981, 44, 80.

18. Nishiyama, Y.; Moriyasu, M.; Ichimaru, M.; Iwasa, K.; Kato, A.; Mathenge, S.; Chalo, P.; Juma, F.; Phytochemistry 2006, 67, 2671.

19. Castro, O.; Hasbun, C.; Calderon, M.; Fitoterapia 1991, 62, 72.

20. Chen, Y.; Chang, F.; Wu, Y.; J. Nat. Prod. 1996, 59, 904.

21. Zhao, O.; Zhao, Y.; Wang, K.; J. Ethnopharm. 2006, 106, 408.

22. Chang, F.; Wei, J.; Teng, C.; Wu. Y.; J. Nat. Prod. 1998, 61, 1457.

23. Gomez, Y.; Gil, K.; González, E.; Farías, L.; Rev. Biol. Biol. Trop. 2007, 55, 767.

24. Kuo, R.; Chang, F.; Chen, C.; Teng, C.; Yen, H.; Wu. Y.; Fytochemistry 2001, 57, 421.

25. Agnihotri, V.; ElSohly, H.; Khan, S.; Jacob, M.; Joshi, V.; Smillie, T.; Khan, I.; Walker, L.; Phytochem. Lett. 2008, 1, 89.

26. Ma, W.; Fukuski, Y.; Tahara, S.; Osawa, T.; Phytotherapy 2000, 71, 527.

27. Lerhrer R.; Rosenman, M.; Harwig. S.; Jackson, R.; Eisenhaver, P.; J. Inmunol. Methoden. 1991, 137, 167.

28. Nimgirawath, S.; Udomputtimekakul, P.; Taechowisan, T.; Wanbanjob, A.; Shen Y.; Chem. Pharm. Bull. 2009, 57,

Ontvangen 26/6/09; aanvaard 6/11/09; gepubliceerd op het web 10/3/10

* e-mail: [email protected]

AANVULLEND MATERIAAL