Associatie van HPV-genotypes met externe anogenitale wratten: een cross-sectionele studie
Studieopzet en deelnemers
Een cross-sectionele studie die gebruikmaakt van een niet-probabilistische steekproef werd uitgevoerd. Patiënten die dermatologische klinieken bezochten in Farwania Health District Area werden van november 2016 tot mei 2017 opeenvolgend gerekruteerd in de studie. Immunocompetente patiënten met een eerdere klinische diagnose van externe anogenitale wratten die gepland waren voor cryotherapie of laserbehandeling werden gevraagd om het toestemmingsformulier te ondertekenen na een mondelinge uitleg van de dermatoloog waarin hun deelname werd gevraagd. Op het moment van de staalafname werden de wrattenstalen verzameld in een universeel transportmedium (HealthLink Inc., Copan Italia S.p.A., Italië), en bewaard bij – 80°C. Ethische goedkeuring werd verkregen van het Ethisch Comité van het Centrum voor Gezondheidswetenschappen (Nummer: VDR/EC/2310) en het Ministerie van Volksgezondheid.
Demografische en klinische informatie werd genomen van elke patiënt, waaronder: leeftijd (jaren), geslacht (man, vrouw), nationaliteit (Koeweits, niet-Koeweits), aantal wratten (één, twee tot vier, en ten minste vijf), duur van de aanwezigheid van wratten (< één maand, één tot zes maanden, zeven tot 12 maanden, en meer dan 12 maanden), grootte van elke wrat (in centimeter) (< één, één, tussen één en twee, meer dan twee), partners heeft wratten (ja, nee), en of wratten onderworpen waren aan een voorafgaande behandeling (ja, nee). Geen van de deelnemers kreeg HPV-vaccinatie, omdat HPV-vaccinatie nog niet is geïmplementeerd in Koeweit, hoewel de implementatie ervan momenteel wordt besproken op het ministerie van Volksgezondheid.
DNA-extractie en controles
Ontvangen weefselmonsters werden bewaard bij – 80 °C. Vanwege het grote aantal ontvangen monsters werden alle wratten per patiënt samen fijngehakt en onderworpen aan één DNA-isolatie. Het weefsel werd met een steriele schaar en tang op een petrischaaltje fijngehakt en ongeveer 25 g weefsel werd afgewogen. Het weefsel werd gewassen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en overgebracht in Eppendorf-buisjes van 1,5 ml. Genomisch DNA werd uit weefselmonsters geëxtraheerd met een QIAmp DNA Mini kit (Qiagen, VS) volgens de instructies van de fabrikant.
HPV type 2, HPV type 1 en HPV type 16 vectoren (American Type Culture Collection, Manassas, VA, VS) werden gebruikt als controles in PCR experimenten.
Real time PCR
De real-time PCR assay werd uitgevoerd om te screenen op HPV DNA in de genitale wratten. Vijf microliter (5-μl) van het geëxtraheerde DNA werd gecombineerd met 12,5-μl van 2X Syber Green mastermix (Applied Biosystems, Foster City, CA, VS) met ROX als passieve referentie, en 10 pmol voorwaartse en achterwaartse primers (10-uM, hieronder beschreven). Alle sets van de primers werden op maat gesynthetiseerd door Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA. Het mengsel werd aangevuld tot een volume van 25 μl met nucleasevrij water (Ambion, Austin, TX, USA). Om het aantal vals-positieve of vals-negatieve resultaten te beperken, werden de monsters in duplo geanalyseerd op een reactieplaat met 96 optische putjes (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). In elke amplificatiebatch werden positieve en negatieve controles opgenomen. Om het HPV in de monsters te kwantificeren, werd naast de monsters een vijf- tot tienvoudige seriële verdunning van het bekende positieve controle-DNA uitgevoerd. De real-time PCR-amplificatie werd uitgevoerd in ABI 7500 real-time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
De real-time PCR-assay werd uitgevoerd op drie verschillende platen. De eerste plaat werd gebruikt om de integriteit van het doel-DNA te bepalen door β-globine PCR assay, amplificatie van een doelwit van 268 bp fragment, zoals eerder beschreven door Lum en Le Marchand in 1998 . De nucleotidevolgorde van de β-globine primers is als volgt: β-globine forward PCR primer: 5′-TGGGTTTCTGATAGGCACTGACT-3′. De PCR-amplificatie werd gestart bij 95 °C gedurende tien minuten en voltooid met 45 amplificatiecycli (denaturatie bij 95 °C gedurende 15 s, annealing bij 55 °C gedurende 45 s en extensie bij 65 °C gedurende één minuut).
De tweede plaat werd gebruikt om te screenen op de aanwezigheid van HPV-infectie met behulp van MY11/GP6-primers van de HPV L1 ORF . De nucleotidesequenties van de MY11/GP6-primers zijn als volgt: MY11 forward primer: 5′- GCM CAG GGW CAC AAY AAT GG -3′ en GP6 reverse primer: 5′- GAAAAATAAACTGTAAATCATATATTC-3′. De verwachte grootte van het geamplificeerde fragment is 185-bp. De PCR-amplificatie werd gestart bij 95 °C gedurende tien minuten en voltooid met 45 amplificatiecycli (denaturatie bij 95 °C gedurende 15 s, annealing bij 45 °C gedurende 45 s en extensie bij 65 °C gedurende één minuut).
De derde plaat werd gebruikt om te screenen op de aanwezigheid van HPV-infectie met behulp van HVP2/B5-primers van de HPV L1 ORF . De nucleotide sequenties van HVP2/B5 primers zijn als volgt: HVP2 forward primer: 5′- TCN MGN GGN CAN CCN YTN GG -3′; B5 reverse primer: 5′- AYN CCR TTR TTR TGN CCY TG -3′. De verwachte grootte van het geamplificeerde fragment is 650-bp. De PCR-amplificatie werd gestart bij 95 °C gedurende tien minuten en voltooid met 45 amplificatiecycli (denaturatie bij 95 °C gedurende 15 s, annealing bij 50 °C gedurende 45 s en extensie bij 65 °C gedurende één minuut).
Fluorescentiespectra werden geregistreerd tijdens de elongatiefase van elke PCR-cyclus. Sequence Detection Software (SDS v1.7) van ABI 7500 real-time PCR werd gebruikt om de amplificatiecurve voor elke reactie te genereren. Na elke reactie werd een dissociatiecurve gegenereerd om onderscheid te maken tussen specifieke en niet-specifieke amplicons. Op basis van de amplificatiecurve werden alle monsters met HPV-amplificatie vanaf elke cyclus tot en met cyclusnummer 40 (met een afkapgrens van 0,2) voor de analyse geselecteerd. Alleen monsters met een dissociatiecurve tussen 70 °C en 80 °C en met een afgeleide waarde tussen 0,100-0,500 werden als HPV-DNA-positief beschouwd.
Sanger-sequencing
HPV-DNA in wratten werd geamplificeerd door middel van geneste PCR voorafgaand aan sequencing, met gebruikmaking van de AmpliTaq Gold Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) HVP2/B5 primers werden gebruikt in de eerste PCR, en CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R en C4F/C4R primers in de tweede PCR. De eerste PCR-amplificatie werd gestart bij 95 °C gedurende tien minuten en voltooid met 35 amplificatiecycli (denaturatie bij 95 °C gedurende 15 seconden, annealing bij 50 °C gedurende 45 seconden en extensie bij 68 °C gedurende één minuut). De tweede PCR-amplificatie werd uitgevoerd met 3 μl van het eerste PCR-product en onder dezelfde cyclische omstandigheden. 3, 7, 10, 27, 28, 29, 40, 43, 57, 77, 91 en 94), gamma (HPV 4, 65, 95, 48, 50, 60 en 88), mu (HPV 1 en 63), en nu (HPV 41) .
De PCR-producten werden gezuiverd met behulp van een PCR-zuiveringskit (NucleoSpin Extract II PCR Purification Kit, Macherey-Nagel GmbH & Co.KG, Düren, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. Vervolgens werden ze onderworpen aan een Sanger-sequencingreactie met BigDye terminator v3.1 cycle sequencing-mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) en de hierboven beschreven geneste PCR-primers. Na sequencing werden PCR-zuiveringen uitgevoerd om ongebonden fluorescerende kleurstofdeoxy-terminators te verwijderen met BigDye XTerminator™ Purification kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). De monsters werden gedurende 2 min. bij 95 °C gedenatureerd, onmiddellijk op ijs gekoeld en in een ABI 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) geladen. De monsters werden geëlektroforeerd op een 50-cm capillaire array met POP 6 polymeer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) als scheidingsmedium.
De monsters werden geanalyseerd met Sequencing Analysis software v 3.7 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). De HPV-sequentie alignment werd uitgevoerd met sequenties gepresenteerd in de GenBank database met behulp van BLASTn software (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) en de Los Alamos Data National Laboratory Theoretical Biology and Biophysics HPV database (https://pave.niaid.nih.gov/).
Wanneer de verkregen sequenties van slechte kwaliteit waren als gevolg van een lage opbrengst van PCR-product, werden de PCR-producten gekloond in de pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI) na zuivering met de Wizard SV Gel en PCR Clean-Up System kit (Promega), en de sequencing van inserts werd uitgevoerd met behulp van M13 voorwaartse en achterwaartse primers.
Statistische analyse
Data van de klinische diagnose, demografische gegevens en virologische analyse werden getabelleerd en geanalyseerd met SPSS statistische software ‘Statistical Package for Social Sciences, SPSS version 25.0′ (IBM Corp, Armonk, NY, USA). Beschrijvende statistieken: frequenties/percentages, centrum- en spreidingsmaten werden berekend. Voor het testen van gelijkheid van gemiddelden werd de tweesample t-toets gebruikt voor alle continue variabelen wanneer normaliteit werd aangehouden, anders werd de Mann Whitney U-toets gebruikt. Voor de vergelijking van de gemiddelden van drie groepen werd gebruik gemaakt van de variantie-analyse of van de Kruskal-Wallis-test, afhankelijk van de vraag of aan de veronderstellingen was voldaan. Pearson chi kwadraattoets voor onafhankelijkheid of Fisher exact toets werden gebruikt om verbanden tussen twee categorische variabelen te testen wanneer aan de veronderstellingen was voldaan. Om een binair resultaat met een reeks covariaten te modelleren, werd logistische regressie toegepast, en werden ruwe en aangepaste odds ratio’s en hun 95%-betrouwbaarheidsintervallen geschat. Alle tests waren tweestaartgetoetst en een P-waarde van minder dan 5% werd als statistisch significant beschouwd.