Auxotrofie
GeneticaEdit
In de genetica, wordt een stam auxotroof genoemd als deze een mutatie draagt waardoor deze niet in staat is een essentiële verbinding te synthetiseren. Een gistmutant met een geïnactiveerd gen voor de uracilsynthese is bijvoorbeeld een uracil-uxotrofe stam (als bijvoorbeeld het gen voor orotidine-5′-fosfaatdecarboxylase in de gist is geïnactiveerd, is de resulterende stam een uracil-uxotrofe stam). Een dergelijke stam is niet in staat uracil te synthetiseren en zal alleen kunnen groeien als uracil uit de omgeving kan worden opgenomen. Dit is het tegenovergestelde van een uracil-prototroof, of in dit geval een wild-type stam, die bij afwezigheid van uracil nog wel kan groeien. Auxotrofe genetische markers worden vaak gebruikt in de moleculaire genetica; zij werden beroemd in het met de Nobelprijs bekroonde werk van Beadle en Tatum aan de “één gen, één enzym”-hypothese, waarbij mutaties van genen in verband worden gebracht met eiwitmutaties. Dit maakt het mogelijk biosynthese- of biochemische routes in kaart te brengen die kunnen helpen bepalen welk enzym of welke enzymen gemuteerd en disfunctioneel zijn in de auxotrofe bacteriestammen die worden bestudeerd.
Onderzoekers hebben stammen van E. coli gebruikt die auxotroof zijn voor specifieke aminozuren om niet-natuurlijke aminozuuranalogen in eiwitten in te brengen. Zo kunnen bijvoorbeeld cellen die auxotroof zijn voor het aminozuur fenylalanine worden gekweekt in media die zijn aangevuld met een analoog zoals para-azido fenylalanine.
Vele levende wezens, waaronder de mens, zijn auxotroof voor grote klassen van verbindingen die nodig zijn voor de groei en moeten deze verbindingen via de voeding verkrijgen (zie vitamine, essentiële voedingsstof, essentieel aminozuur, essentieel vetzuur).
Het complexe evolutiepatroon van vitamine auxotrofie in de eukaryotische levensboom is nauw verbonden met de onderlinge afhankelijkheid tussen organismen.
De mutageniciteitstest (of Ames-test)Edit
Bij de salmonella-mutagenese-proef (Ames-test) worden meerdere stammen Salmonella typhimurium gebruikt die auxotroof zijn voor histidine om te testen of een bepaalde chemische stof mutaties kan veroorzaken door de auxotrofe eigenschap ervan te observeren in reactie op een toegevoegde chemische verbinding. De mutatie die een chemische stof of verbinding veroorzaakt, wordt gemeten door deze toe te passen op de bacteriën op een plaat met histidine en de bacteriën vervolgens over te brengen naar een nieuwe plaat zonder voldoende histidine voor voortdurende groei. Als de stof het genoom van de bacterie niet van auxotroof naar histidine terug muteert naar prototroof naar histidine, dan zou de bacterie op de nieuwe plaat geen groei vertonen. Door de verhouding van de bacteriën op de nieuwe plaat ten opzichte van de oude plaat en dezelfde verhouding voor de controlegroep te vergelijken, kan men dus kwantificeren hoe mutageen een stof is, of beter gezegd, hoe groot de kans is dat deze mutaties in het DNA veroorzaakt. Een chemische stof wordt voor de Ames-test als positief beschouwd als zij mutaties veroorzaakt waarvan het omkeringspercentage hoger is dan het waargenomen percentage, en als zij negatief is als de mutaties vergelijkbaar zijn met die in de controlegroep. Wanneer een auxotrofe bacterie wordt uitgezet op een medium zonder de metaboliet die zij nodig heeft, wordt een normaal, maar klein aantal terugmutantkolonies verwacht, omdat zij zou kunnen terugmuteren naar prototrofie. De kans hierop is klein en er worden dan ook zeer kleine kolonies gevormd. Als echter een mutagene stof wordt toegevoegd, zou het aantal revertanten zichtbaar hoger zijn dan zonder de mutagene stof. De Ames-test wordt in principe als positief beschouwd als een stof de kans op mutatie in het DNA van de bacterie zodanig verhoogt dat er een kwantificeerbaar verschil optreedt tussen het aantal terugmutanten op de mutagene plaat en de plaat van de controlegroep. Een negatieve Ames-test betekent dat het mogelijke mutageen geen toename van het aantal terugmutanten veroorzaakt, terwijl een positieve Ames-test aangeeft dat het mogelijke mutageen de kans op mutatie WEL heeft vergroot. Deze mutagene effecten op bacteriën worden onderzocht als een mogelijke indicator voor dezelfde effecten op grotere organismen, zoals de mens. Er wordt gesuggereerd dat als er een mutatie kan ontstaan in bacterieel DNA in aanwezigheid van een mutageen, hetzelfde effect zou optreden bij grotere organismen die kanker veroorzaken. Een negatief resultaat van de Ames-test zou erop kunnen wijzen dat de stof geen mutageen agens is en geen tumorvorming in levende organismen veroorzaakt. Slechts enkele van de positieve Ames-testresultaten voor chemische stoffen werden echter als onbeduidend beschouwd wanneer zij bij grotere organismen werden getest, maar de positieve Ames-test voor bacteriën kon nog steeds niet onomstotelijk in verband worden gebracht met de expressie van kanker in grotere organismen. Hoewel het een mogelijke determinant van tumoren kan zijn voor levende organismen, mensen, dieren, enzovoort, moeten meer studies worden voltooid om tot een conclusie te komen.
Op auxotrofie gebaseerde methoden om onnatuurlijke aminozuren in eiwitten en proteomen op te nemenEdit
Een groot aantal onnatuurlijke aminozuren, die qua vorm, grootte en chemische eigenschappen lijken op hun canonieke tegenhangers, worden in de recombinante eiwitten ingebracht met behulp van auxotrofe expressiegastheren. Zo kunnen bijvoorbeeld methionine- (Met) of tryptofaan- (Trp) auxotrofe Escherichia coli-stammen worden gekweekt in een gedefinieerd minimaal medium. In deze experimentele opzet is het mogelijk om recombinante eiwitten tot expressie te brengen waarvan de canonieke Trp- en Met-residuen volledig zijn gesubstitueerd door verschillende medium-gerelateerde analogen. Deze methode leidt tot een nieuwe vorm van proteïne engineering, die niet wordt uitgevoerd door codon-manipulatie op DNA-niveau (b.v. oligonucleotide-gerichte mutagenese), maar door codon-herschikkingen op het niveau van de eiwitvertaling onder efficiënte selectieve druk. Daarom wordt de methode aangeduid als selective pressure incorporation (SPI).
Geen enkel tot nu toe bestudeerd organisme codeert andere aminozuren dan de canonieke twintig; twee extra canonieke aminozuren (selenocysteïne, pyrrolysine) worden in eiwitten ingevoegd door hercodering van translatiebeëindigingssignalen. Deze grens kan worden overschreden door adaptieve laboratoriumevolutie van metabolisch stabiele auxotrofe microbiële stammen. Bijvoorbeeld, de eerste duidelijk succesvolle poging om Escherichia coli te evolueren die uitsluitend kan overleven op het onnatuurlijke aminozuur thienopyrrolyl) alanine als enige substituut voor tryptofaan werd gedaan in 2015.