Beta-Galactosidase Assay (Een betere Miller)

terug naar protocollen

Achtergronden

β-Galactosidase wordt gecodeerd door het lacZ-gen van het lac-operon in E. coli. Het is een groot (120 kDa, 1024 aminozuren) eiwit dat een tetramer vormt. De functie van het enzym in de cel is het splitsen van lactose in glucose en galactose, zodat deze kunnen worden gebruikt als koolstof/energiebron. De synthetische verbinding o-nitrofenyl-β-D-galactoside (ONPG) wordt ook als substraat herkend en gesplitst tot galactose en o-nitrofenol, dat een gele kleur heeft. Wanneer ONPG in overmaat is ten opzichte van het enzym in een reactie, is de productie van o-nitrofenol per tijdseenheid evenredig met de concentratie van β-galactosidase; de productie van gele kleur kan dus worden gebruikt om de enzymconcentratie te bepalen.

Dus, wat kan ons dat schelen? Gewoonlijk worden experimenten zo opgezet dat de β-Galactosidase-concentratie in de cel een uitlezing is voor een of ander aspect van een systeem dat wordt bestudeerd. Een onderzoeker kan bijvoorbeeld een promoter aan het lacZ gen koppelen en de β-Gal niveaus gebruiken als een uitlezing voor de activiteit van de promoter onder verschillende omstandigheden. In 1972 publiceerde Jeffrey Miller “Experiments in Molecular Genetics”, dat een protocol bevatte voor de bepaling van de hoeveelheid β-Gal met ONPG. Daarom worden ONPG/β-Gal-tests “Miller”-tests genoemd, en een gestandaardiseerde hoeveelheid β-Gal-activiteit is een “Miller-eenheid”.

1 Miller-eenheid = \displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420} – (1,75*Abs_{550}))}{(t * v * Abs_{600})} }

waar:

• Abs420 is de extinctie van het gele o-nitrofenol,
• Abs550 is de verstrooiing door celresten, die, wanneer vermenigvuldigd met 1.75 bij benadering de bij 420nm waargenomen verstrooiing weergeeft,
• t = reactietijd in minuten,
• v = onderzocht kweekvolume in milliliters,
• Abs600† geeft de celdichtheid weer.

†Merk op dat deze waarde voor elke gebruikte spectrofotometer anders is en moet worden gekalibreerd door verdunningen van bekende Abs600-culturen uit te platen om de kolonievormende eenheden per Abs600 te bepalen.

In zijn boek legt dr. Miller uit dat deze formule ongeveer 1 Miller-eenheid oplevert voor niet-geïnduceerde E. coli (lage β-Gal productie) en ongeveer 1000 eenheden voor een volledig geïnduceerde cultuur (gekweekt op lactose of IPTG).

In mijn ervaring hebben culturen van MG1655 geïnduceerd met 1 mM IPTG in log-fase 1500-1800 Miller-eenheden. De reden voor het verschil is niet bekend, maar ik vermoed dat het voortkomt uit verschillen in de Abs600/celdichtheid tussen de spectrofotometer van Dr. Miller en degene die ik gebruik en het feit dat ik mijn Miller-tests bij 30 °C doe (voor het gemak) terwijl Dr. Miller zijn tests bij 28 °C uitvoerde. Ik heb promotor fusies die ~ 40.000 Miller eenheden genereren gemaakt; echter, zoals hieronder zal worden besproken, dit is te hoog voor de assay en dus het protocol werd gewijzigd om deze waarde te verlagen.

Protocol

Het protocol dat ik gebruik is afgeleid van een paper van Zhang en Bremer (JBC 270, 1995, Gratis volledige tekst!) waarin de oorspronkelijke Miller protocol werd sterk vereenvoudigd om meer monsters te meten met minder manipulatie mogelijk te maken.

In het kort, het protocol bestaat uit het meten van de celdichtheid van een cultuur van bacteriën (Abs600), dan het verwijderen van een aliquot van de cellen uit de cuvet en meng ze met een “permeabilisatie” oplossing die detergent bevat die de celmembranen verstoort (maar laat de β-Gal intact). Dit doodt de cellen en stopt de translatie. Na incubatie wordt een ONPG “substraat”-oplossing toegevoegd en laat men de gele kleur ontwikkelen. Een “stop”-oplossing wordt dan toegevoegd en de absorptie van o-nitrophenol wordt gemeten.

1. Groei culturen onder welke omstandigheden u wenst te testen.
2. Tijdens de groei, vooraf afgemeten 80 pi aliquots van permeabilisatie-oplossing in 1.5 mL microfugebuisjes en sluit ze.
3. Maat Abs600 en RECORD IT!
4. Verwijder een 20 pi aliquot van de cultuur en voeg het toe aan de 80 pi permeabilisatie-oplossing.

Het monster is nu stabiel voor meerdere uren. Dit stelt u in staat om uit te voeren time-course experiments.

1. Nadat het laatste monster is genomen, verplaats de monsters en de substraatoplossing naar de 30 ° C warme kamer voor 20-30 minuten.
2. Voeg 600 pi van substraatoplossing aan elke buis en noteer de tijd van ADDITION.
3. Nadat voldoende kleur is ontwikkeld, voeg 700 pi van de Stop-oplossing, meng goed, en noteer de STOP TIJD.
4. Na het stoppen van het laatste monster (sommige kunnen langer duren dan andere, maar over het algemeen zijn ze klaar in 30-90 minuten), breng de buizen over naar een microfuge en centrifugeer gedurende 5-10 minuten op volle snelheid.
5. Verwijder de buizen voorzichtig uit de centrifuge en breng de oplossing van de TOP van de buizen over naar uw cuvet (s). U probeert te voorkomen dat deeltjes materiaal in de cuvet, zodat verstrooiing niet van invloed op de reading.
6. Record Abs420. Deze moet kleiner zijn dan 1 en groter dan 0.05. Als het een beetje buiten dit bereik ligt, maak je dan niet druk.

Bereken Miller Units als:

1000 * \frac{(Abs_{420})}{((Abs_{600} \van cultuur bemonsterd})*(\volume } )*(\text{reactietijd}))}

Commentaren op de assay

• Reshma 11:28, 15 oktober 2007 (CDT): Miller beveelt een kweek aan met OD600 = 0,28 tot 0,70. Hij beweert echter dat ook nachtculturen kunnen worden gebruikt, maar dat exponentieel groeiende cellen nauwkeurigere assays opleveren.

• Wanneer wordt de reactie uitgevoerd? Ik heb hier in de literatuur nooit een goed antwoord op gevonden. Als ik een reactie tot voltooiing laat komen, meet ik een Abs420 van ~2-3. Dit is natuurlijk buiten het betrouwbare bereik van de spectrofotometer, maar het geeft een indicatie van hoever de reactie kan gaan. Ik kreeg reproduceerbare gegevens wanneer de gele kleur net detecteerbaar was vóór het toevoegen van de stopoplossing tot ongeveer de kleur van LB-bouillon vóór het stoppen. Vergeet niet dat je het substraat nodig hebt om het enzym in de loop van de reactie te verzadigen, dus laat ze niet te ver gaan. Ik doe routinematig drie afzonderlijke metingen voor elke kweek en maak daar het gemiddelde van.
  • Reshma 11:28, 15 oktober 2007 (CDT): Miller beveelt aan dat de OD420nm-aflezing idealiter 0,6-0,9 bedraagt.

• Vaak gebruiken mensen plastic wegwerpcuvetten om zowel de troebelheid van de kweek als het gele o-nitropenol te meten. Mijn ervaring is dat wegwerpcuvetten een HORRIBLE optiek hebben: ze zijn weliswaar helder, maar de lichtbaan is hopeloos vervormd (kijk maar eens door een cuvette naar een voorwerp in de verte). Dit is geen groot probleem als dezelfde cuvet wordt gebruikt voor de blanco en het monster en als deze op dezelfde manier in de spectrofotometer is georiënteerd. Het probleem ontstaat wanneer veel verschillende monsters worden gemeten in verschillende cuvetten. De waarden kunnen GROOT variëren, zelfs voor dezelfde kweek gemeten in verschillende cuvetten. Ik raad aan een glazen of kwarts cuvette van hoge kwaliteit te gebruiken, of de monsters te meten in een plate reader met 96 wells platen met vlakke bodem. Ik heb gemerkt dat mijn fout bij het pipetteren van 150 μL cultuur voor Abs600 metingen WAY minder was dan bij het gebruik van wegwerp cuvetten. Natuurlijk moet de gemeten troebelheid worden gekalibreerd naar cellen/mL, net als bij een cuvet van 1 cm.

• Door de monsters te draaien en het monster voorzichtig uit het supernatans te verwijderen, vermijd je dat je de verstrooiing bij 550nm moet meten en moet gokken wat het bij 420nm zou zijn.

• Als je reactie te veel β-Gal bevat, zal het buisje in een paar minuten (of zelfs seconden) geel kleuren. Dit is te snel. Een van de grootste bijdragen aan de fout zal uw schatting van de reactietijd zijn. Door de reactieomstandigheden zo in te stellen dat het ongeveer een uur duurt, worden de tijdfouten onbeduidend. Als je nodig hebt om de reactie te vertragen, kunt u gebruik maken van minder cellen en verhoging van de hoeveelheid permeabilisatiebuffer, zodat het volume is nog steeds 100 pi. Als alternatief kunt u re-engineer de ribosoom-bindende site van uw β-Gal construct om het te verzwakken. Ik vond dat als mijn cellen maakten 40.000 Miller eenheden van β-Gal, ze waren erg ziek van de vertaling stress. In dit geval was het beter om de translatie van het β-Gal-mRNA te verzwakken.
  • Ik doe deze reacties zoals ik enzymenkinetiek doe. Ik start de monsters met een tussenpoos van 10 seconden (waarbij de tijd wordt opgeteld), zodat het mogelijk is om nauwkeurige reactietijden te verkrijgen, zelfs als je de reacties slechts een paar minuten laat duren. Ik krijg zeer reproduceerbare resultaten met reactietijden van 1,5-30 min. Als je eenmaal een idee hebt van hoe lang je reacties zullen duren, is het gemakkelijk om monsters te groeperen die dezelfde reactietijd nodig hebben. Door elk monster in drievoud uit te voeren, krijgt u enig vertrouwen dat uw timing reproduceerbaar is.–Kathleen 16:43, 14 december 2005 (EST)

• Hier volgt een voorbeeld van enkele feitelijke gegevens die ik met deze assay heb verkregen. Het was een tijdsverloop-experiment. Op elk tijdstip verwijderde ik 1 ml van elk van mijn culturen, mat de OD600, nam drie aliquots van 20 µL rechtstreeks uit de cuvet en voegde ze elk toe aan 80 µL permeabilisatieoplossing. Ik voerde de bepaling precies zo uit als hierboven beschreven, en alle monsters werden bij kamertemperatuur bewaard totdat het tijdsverloop was voltooid. De OD600 voor deze culturen varieerde in de loop van dit experiment van 0,4 tot 4 (in mijn spec) en de reactietijden voor de β-Gal assays varieerden van 2-25 min. De drie individuele β-Gal-tests voor elk tijdstip voor elke cultuur (rode of zwarte symbolen) zijn in de grafiek uitgezet om de reproduceerbaarheid van de assay binnen elk experiment te illustreren.–Kathleen

Recipes

Permeabilisatieoplossing

U hebt 80 μL per monster nodig.

• 100 mM dibasisch natriumfosfaat (Na2HPO4)
  • (Het Zhang-protocol heeft 200 mM natriumfosfaat. Ik kon dit nooit in oplossing krijgen met de andere componenten, wat ik ook probeerde, dus heb ik het teruggebracht tot 100 mM. Ik heb zelfs 50 mM gebruikt zonder waarneembare verandering.)
• 20 mM KCl
• 2 mM MgSO4
• 0,8 mg/ml CTAB (hexadecyltrimethylammoniumbromide)
• 0.4 mg/mL natriumdeoxycholaat
• 5,4 μL/mL beta-mercaptoethanol

Substraatoplossing

U heeft 600 μL per monster nodig.

• 60 mM Na2HPO4
• 40 mM NaH2PO4
• 1 mg/mL o-nitrophenyl-β-D-Galactoside (ONPG)
• 2.7 μL/mL β-mercaptoethanol

(Het Zhang-protocol heeft ook 20 μg/mL CTAB en 10 μg/mL deoxycholate. Ik laat deze uit in de veronderstelling dat er nog genoeg van de permeabilisatie-oplossing en, als ze nog niet dood, ze is niet gonna be. )

Stop oplossing

U moet 700 ul per monster.

• 1 M natriumcarbonaat (Na2CO3)

De hoge pH van de stopoplossing denatureert het β-Gal en verdubbelt ongeveer de gele kleur van de reactie.