Biologische klokken

De afwisseling van dag en nacht van de cyclus van de aarde is zo betrouwbaar dat het niet verwonderlijk is dat dieren, planten en bacteriën hun gedrag en fysiologie aanpassen (voor een overzicht, zie ref. 1). Circadiane ritmen zijn een alomtegenwoordige aanpassing van alle organismen aan de meest voorspelbare uitdagingen van de omgeving. Een biologisch ritme dat aanhoudt onder constante omstandigheden en een periode van ≈1 dag heeft, wordt “circadiaan” genoemd (circa, “rond”; dian, “dag”).

Tot voor kort zijn de moleculen die aan de oscillatie ten grondslag liggen onbekend gebleven. Verstoring van dergelijke oscillaties door remmers van de RNA- of eiwitsynthese suggereert dat dergelijke moleculen hierbij betrokken zijn (2).

Een benadering die succesvol is geweest bij het ontrafelen van mechanismen is het gebruik van genetische veranderingen. De eerste en tweede klok mutanten ontdekt in de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, zijn periode en tijdloze genen (3-5).

In fruitvliegen, de overvloed van mRNA en eiwit producten van de periode en tijdloze genen cyclus voor ≈24 uur in specifieke plaatsen van de vlieg hersenen (6). Maki Kaneko et al. spraken over deze putatieve pacemaker cellen in de fruitvlieg hersenen door gebruik te maken van deze moleculaire oscillatie als een marker (7). In het volwassen hoofd toonden eiwitstudies aan dat per ritmisch tot expressie komt op specifieke plaatsen, de laterale neuronen gelegen tussen de centrale hersenen en de optische kwabben. Laterale neuronen worden beschouwd als de vermoedelijke pacemaker cellen voor de volwassen vlieg locomoter activiteit ritme.

Kaneko et al. (7) aangetoond dat de producten van per en tim zijn detecteerbaar in een beperkt aantal neuronen in de larvale hersenen. Het uitdrukkingspatroon in verscheidene van dergelijke cellen is cyclisch. Onder deze neuronen zijn er vijf lateraal gelegen cellen die expressie vertonen. PERIOD (PER) uit vanaf het vroege larvale stadium, wat suggereert dat zij verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor het bijhouden van de larvale tijd van eclosie en locomotie-activiteit. Een andere interessante bevinding is een cluster van neuronen met de cyclische expressie van per en tim in antiphase aan de laterale neuronen. De resultaten impliceren de aanwezigheid van meerdere oscillatoren die betrokken zijn bij ritmen van verschillende fysiologische of gedragsprocessen in één enkel organisme. Kaneko et al. (7) beschreven ook de anatomische karakterisering van de bedradingspatronen van de pacemaker neuronen door gebruik te maken van per promoter-afhankelijke reporter genexpressie. Een dergelijke moleculair-anatomische benadering moet een nieuw inzicht verschaffen in de functionele mapping van dit hersensysteem. Bovendien moet de vergelijking tussen zoogdieren en vliegen klok cellen te verduidelijken evolutionaire relatie tussen deze systemen.

De circadiane controle van transcriptie biedt een uitgangspunt voor het analyseren van de cis-werkende regulerende elementen en trans-werkende factoren waarmee de klok kan reguleren vele klok-gecontroleerde genexpressies (6). Deze veronderstelde cis-werkende regulerende elementen, de “time-box” genoemd (8), worden verondersteld zich te bevinden in de promotor en enhancer regio van klok-gecontroleerde genen. Bovendien kan het klok-gecontroleerde responsieve element (6) of de time-box de endogene circadiane fysiologische fenomenen onder constante omstandigheden reguleren. Onlangs werd een mogelijke kandidaat voor de time-box geïdentificeerd in de promotor regio van het Drosophila period gen (9). Hoewel per is voorgesteld om de mRNA-cyclus te mediëren door transcriptionele repressie, is directe interactie tussen per en DNA zeer onwaarschijnlijk vanwege het ontbreken van een DNA-bindend domein in PER. De groep van Hardin analyseerde uitvoerig de promotor regio van het PER gen in studies waarbij gebruik werd gemaakt van per-lacZ fusiegen transgene vliegen (9). Zij identificeerden een circadiane transcriptionele versterker binnen een 69-bp DNA fragment dat een E-box bevat stroomopwaarts van per gen, dat verantwoordelijk is voor de nachtelijke activering van per genexpressie. De E-box is een bekende bindingsplaats voor de basische helix-lus-helix klasse van transcriptiefactoren.

Nu is de sterkste kandidaat tot nu toe voor een trans-werkende factor in de oscillator Clock, gekloond met behulp van een forward-genetische strategie (10). Takahashi’s groep (10) isoleerde en analyseerde de locomoter activiteit van circadiane mutant muizenstammen. De Clock-mutant vertoonde een lange periode die aritmisch werd na enkele dagen in constante duisternis. Takahashi en collega’s (10) kloneerden met succes het verantwoordelijke gen en identificeerden de mutatie in de eiwit-coderende regio van het Klok-gen. Interessant genoeg bevat het Klok-eiwit een eiwit-eiwit bindend domein (PAS), dat zich in het Drosophila per-gen bevindt, en een basisch helix-lus-helix motief voor DNA-binding. Bovendien waren Takahashi en collega’s (10) in staat om de lange periode en het aritmische fenotype van klokmutante muizen volledig te redden door overdracht van het normale klokgen.

Ravi Allada et al. beschreven de gemeenschappelijke moleculaire componenten gericht op Klok, die verantwoordelijk is voor het genereren van het circadiane ritme in zowel vliegen als mensen (11). Allada en zijn collega’s (11) onderzochten chemisch gemuteerde vliegen op zoek naar mutanten die de circadiane ritmiciteit van locomoter activiteit veranderen of opheffen en vonden een nieuwe aritmische mutant, aanvankelijk Jrk genoemd. Jrk vliegen drukken lage niveaus van periode en tijdloze eiwitten uit als gevolg van verminderde niveaus van transcriptie. Het gen werd geïdentificeerd en vertoont opvallend veel sequentiebehoud met het circadiane ritmegen van zoogdieren, Clock; vandaar dat Allada et al. (11) dit vliegengen omdoopten tot dClock. Net als muis klok, Drosophila klok bevat basale helix-lus-helix en PAS domeinen, evenals een transcriptionele activering domein.

Recente werken van zowel zoogdieren en vliegen suggereren dat de eiwit-partners van CLOCK zijn ook evolutionair geconserveerd (genaamd BMAL) (12, 13). CLOCK-BMAL dimmers bleken zich te binden aan de promotor regio van periode en tijdloze genen en beide genen te transactiveren in vliegen. Bovendien onderdrukt PERIOD-TIMELESS (PER-TIM) expressie CLOCK-BMAL-gemedieerde reporter inductie. Aldus is een negatief terugkoppelingsmodel voorgesteld (Fig. 1).