Bisulfietsequencing

Bij bisulfietsequencing worden routinematige sequencingmethoden toegepast op met bisulfiet behandeld genomisch DNA om de methyleringsstatus op CpG-dinucleotiden te bepalen. Andere niet-sequencing strategieën worden ook gebruikt om de methylering op specifieke loci of op een genoombreed niveau te ondervragen. Bij alle strategieën wordt ervan uitgegaan dat de door bisulfiet geïnduceerde omzetting van ongemethyleerde cytosines in uracil volledig is, en dit dient als basis voor alle volgende technieken. Idealiter zou de gebruikte methode de methyleringsstatus voor elk allel afzonderlijk bepalen. Alternatieve methoden voor bisulfietsequencing zijn onder meer gecombineerde bisulfietrestrictieanalyse en gemethyleerd DNA-immunoprecipitatie (MeDIP).

Methodologieën om met bisulfiet behandeld DNA te analyseren worden voortdurend ontwikkeld. Om deze snel evoluerende methodologieën samen te vatten, zijn talrijke overzichtsartikelen geschreven.

De methodologieën kunnen in het algemeen worden onderverdeeld in strategieën op basis van methyleringsspecifieke PCR (MSP) (figuur 4), en strategieën die gebruikmaken van polymerasekettingreactie (PCR) die onder niet-methyleringsspecifieke omstandigheden wordt uitgevoerd (figuur 3). Bij op microarrays gebaseerde methoden wordt ook gebruik gemaakt van PCR onder niet-methyleringsspecifieke omstandigheden.

Niet-methyleringsspecifieke PCR gebaseerde methodenEdit

Figuur 3: DNA-methyleringsanalysemethoden die niet op methyleringsspecifieke PCR zijn gebaseerd. Na bisulfietconversie wordt het genomisch DNA geamplificeerd met PCR die geen onderscheid maakt tussen gemethyleerde en niet-gemethyleerde sequenties. De talrijke beschikbare methoden worden dan gebruikt om het onderscheid te maken op basis van de veranderingen binnen het amplicon als gevolg van bisulfietconversie.

Directe sequencingEdit

De eerste gerapporteerde methode voor methyleringsanalyse met behulp van bisulfietbehandeld DNA maakte gebruik van PCR en standaard dideoxynucleotide DNA-sequencing om direct de nucleotiden te bepalen die resistent zijn tegen bisulfietconversie. De primers zijn zo ontworpen dat zij zowel strengspecifiek als bisulfiet-specifiek zijn (d.w.z. primers die niet-CpG-cytosines bevatten zodat zij niet complementair zijn aan niet met bisulfiet behandeld DNA), flankerend aan (maar niet betrokken bij) de methyleringsplaats van belang. Derhalve worden zowel gemethyleerde als ongemethyleerde sequenties geamplificeerd, dit in tegenstelling tot methyleringspecifieke PCR. Alle locaties van niet-gemethyleerde cytosines worden als thymines weergegeven in de resulterende geamplificeerde sequentie van de sense-streng, en als adenines in de geamplificeerde antisense-streng. Door sequencingadapters met hoge verwerkingscapaciteit in de PCR-primers op te nemen, kunnen PCR-producten met massaal parallelle sequencing worden gesequeneerd. Als alternatief, en arbeidsintensief, kan het PCR-product worden gekloond en gesequeneerd. Geneste PCR methoden kunnen worden gebruikt om het product voor sequencing.

Alle latere DNA methylatie analyse technieken met behulp van bisulfiet behandeld DNA is gebaseerd op dit rapport van Frommer et al. (figuur 2). Hoewel de meeste andere modaliteiten zijn niet echt sequencing-gebaseerde technieken, wordt de term “bisulfiet sequencing” vaak gebruikt om bisulfiet-conversie DNA methylering analysetechnieken in het algemeen te beschrijven.

PyrosequencingEdit

Pyrosequencing is ook gebruikt om bisulfiet-behandeld DNA te analyseren zonder gebruik van methylering-specifieke PCR. Na PCR amplificatie van het gebied van belang, wordt pyrosequencing gebruikt om de bisulfiet-geconverteerde sequentie van specifieke CpG sites in de regio te bepalen. De verhouding van C-to-T op afzonderlijke plaatsen kan kwantitatief worden bepaald op basis van de hoeveelheid C- en T-integratie tijdens de sequentie-extensie. De voornaamste beperking van deze methode is de kostprijs van de technologie. Pyrosequencing maakt echter een uitbreiding tot high-throughput screeningmethoden mogelijk.

Een verdere verbetering van deze techniek werd onlangs beschreven door Wong e.a., die gebruik maken van allelspecifieke primers die single-nucleotide polymorfismen in de sequentie van de sequencingprimer opnemen, waardoor afzonderlijke analyse van maternale en paternale allelen mogelijk wordt. Deze techniek is bijzonder nuttig voor genomische imprinting-analyse.

Methylatiegevoelige enkelstrengsconformatieanalyse (MS-SSCA)

Deze methode is gebaseerd op de enkelstrengsconformatiepolymorfismeanalyse (SSCA)-methode die is ontwikkeld voor de analyse van enkel-nucleotidepolymorfisme (SNP). SSCA maakt een onderscheid tussen enkelstrengs DNA-fragmenten van identieke grootte maar met verschillende sequentie op basis van differentiële migratie in niet-denaturerende elektroforese. In MS-SCA wordt dit gebruikt om onderscheid te maken tussen met bisulfiet behandelde, door PCR geamplificeerde regio’s die de CpG-locaties van belang bevatten. Hoewel SSCA niet gevoelig is wanneer er slechts één nucleotide verschil is, maakt bisulfietbehandeling vaak een aantal C-to-T-omzettingen in de meeste regio’s van belang, en de resulterende gevoeligheid benadert 100%. MS-SSCA biedt ook een semi-kwantitatieve analyse van de mate van DNA-methylering op basis van de verhouding tussen de bandintensiteiten. Deze methode is echter ontworpen om alle CpG-locaties als geheel in de betrokken regio te beoordelen, in plaats van afzonderlijke methyleringslocaties.

Hoge-resolutie smeltanalyse (HRM)

Een andere methode om geconverteerd van niet-geconverteerd met bisulfiet behandeld DNA te onderscheiden, is het gebruik van hoge-resolutie smeltanalyse (HRM), een kwantitatieve PCR-gebaseerde techniek die oorspronkelijk was ontworpen om SNP’s te onderscheiden. De PCR-amplicons worden rechtstreeks geanalyseerd door temperatuurstijging en het vrijkomen van een intercalerende fluorescerende kleurstof tijdens het smelten. De mate van methylering, zoals weergegeven door het C-to-T-gehalte in het amplicon, bepaalt de snelheid van smelten en de daaruit voortvloeiende afgifte van de kleurstof. Deze methode maakt directe kwantificering in een single-tube assay mogelijk, maar beoordeelt de methylering in de geamplificeerde regio als geheel in plaats van op specifieke CpG-locaties.

Methyleringsgevoelige single-nucleotide primerextensie (MS-SnuPE)Edit

MS-SnuPE maakt gebruik van de primerextensiemethode die oorspronkelijk is ontworpen voor het analyseren van single-nucleotide polymorfismen. DNA wordt bisulfiet-geconverteerd en bisulfiet-specifieke primers worden aan de sequentie geanneeeerd tot het basenpaar onmiddellijk vóór het CpG van belang. De primer wordt in staat gesteld één basenpaar in de C (of T) uit te breiden met behulp van DNA-polymerase-afsluitende dideoxynucleotiden, en de verhouding tussen C en T wordt kwantitatief bepaald.

Er kan een aantal methoden worden gebruikt om deze C:T-verhouding te bepalen. In het begin steunde MS-SnuPE op radioactieve ddNTPs als de reporter van de primerextensie. Ook op fluorescentie gebaseerde methoden of pyrosequencing kunnen worden gebruikt. Voor de differentiatie tussen de twee polymorfe primerextensieproducten kan echter gebruik worden gemaakt van massaspectrometrieanalyse met behulp van matrix-assisted laser desorption ionization/time-of-flight (MALDI-TOF), in wezen op basis van de GOOD-test die is ontworpen voor SNP-genotypering. Ion pair reverse-phase high-performance liquid chromatography (IP-RP-HPLC) is ook gebruikt om primer extension producten te onderscheiden.

Base-specifieke splitsing/MALDI-TOFEdit

Een recent beschreven methode door Ehrich et al. maakt verder gebruik van bisulfiet-conversies door toevoeging van een base-specifieke splitsing stap om de informatie verkregen uit de nucleotide veranderingen te verbeteren. Door eerst gebruik te maken van in vitro transcriptie van de regio van belang in RNA (door toevoeging van een RNA polymerase promotor site aan de PCR primer in de eerste amplificatie), kan RNase A worden gebruikt om het RNA transcript splitsen op base-specifieke plaatsen. Aangezien RNase A RNA specifiek op cytosine- en uracilribonucleotiden splitst, wordt basisspecificiteit bereikt door splitsingsresistent dTTP toe te voegen wanneer cytosinespecifieke (C-specifieke) splitsing gewenst is, en dCTP toe te voegen wanneer uracil-specifieke (U-specifieke) splitsing gewenst is. De gesplitste fragmenten kunnen vervolgens worden geanalyseerd met MALDI-TOF. Bisulfietbehandeling resulteert in introductie/verwijdering van splitsingsplaatsen door C-to-U-omzettingen of verschuiving van de fragmentmassa door G-to-A-omzettingen in de geamplificeerde averechtse streng. C-specifieke splitsing zal specifiek alle gemethyleerde CpG-locaties doorsnijden. Door de grootte van de resulterende fragmenten te analyseren, is het mogelijk het specifieke patroon van DNA-methylering van CpG-locaties binnen de regio te bepalen, in plaats van de mate van methylering van de regio als geheel te bepalen. Deze methode is doeltreffend gebleken voor high-throughput screening, waarbij op kostenefficiënte wijze talrijke CpG-locaties in meerdere weefsels kunnen worden ondervraagd.

Methyleringsspecifieke PCR (MSP)

Figuur 4: Methyleringsspecifieke PCR is een gevoelige methode om een gemethyleerd gebied van belang discriminerend te amplificeren en op te sporen met behulp van gemethyleerde specifieke primers op bisulfiet-omgezet genomisch DNA. Dergelijke primers annealiseren alleen op sequenties die gemethyleerd zijn, en dus 5-methylcytosines bevatten die resistent zijn tegen omzetting door bisulfiet. Als alternatief kunnen niet-gemethyleerde specifieke primers worden gebruikt.

Deze alternatieve methode voor methyleringsanalyse maakt ook gebruik van met bisulfiet behandeld DNA, maar vermijdt de noodzaak om het gebied van belang te sequencen. In plaats daarvan worden primerparen zelf ontworpen om “gemethyleerd-specifiek” te zijn door sequenties op te nemen die alleen niet-omgezette 5-methylcytosines complementeren, of omgekeerd “niet-gemethyleerd-specifiek”, waarbij thymines die uit niet-gemethyleerde cytosines zijn omgezet, worden gecomplementeerd. De methylering wordt bepaald door het vermogen van de specifieke primer om amplificatie te bereiken. Deze methode is bijzonder nuttig voor het ondervragen van CpG-eilanden met een mogelijk hoge methyleringsdichtheid, aangezien een groter aantal CpG-paren in de primer de specificiteit van de assay verhoogt. Door het CpG-paar aan het 3′-uiteinde van de primer te plaatsen wordt ook de gevoeligheid verbeterd. In het eerste verslag over MSP werd beschreven dat de gevoeligheid voldoende was om methylering van 0,1% van de allelen te detecteren. In het algemeen worden MSP en verwante protocollen als het meest gevoelig beschouwd bij het ondervragen van de methyleringsstatus op een specifieke locus.

De MethyLight-methode is gebaseerd op MSP, maar biedt een kwantitatieve analyse met behulp van kwantitatieve PCR. Er worden gemethyleerd-specifieke primers gebruikt, en er wordt ook een gemethyleerd-specifieke fluorescentie-reporterprobe gebruikt die aan het geamplificeerde gebied anneëert. Als alternatief kunnen de primers of de probe ook zonder methyleringsspecificiteit worden ontworpen als onderscheid moet worden gemaakt tussen de CpG-paren binnen de betrokken sequenties. De kwantificering geschiedt ten opzichte van gemethyleerd referentie-DNA. Een wijziging van dit protocol om de specificiteit van de PCR voor succesvol bisulfiet-geconverteerd DNA te verhogen (ConLight-MSP) maakt gebruik van een extra probe om bisulfiet-ongeconverteerd DNA te kwantificeren deze niet-specifieke amplificatie.

Verder methodologie met behulp van MSP-gemamplificeerd DNA analyseert de producten met behulp van smeltcurve-analyse (Mc-MSP). Deze methode amplificeert bisulfiet-geconverteerd DNA met zowel gemethyleerd-specifieke als niet-gemethyleerd-specifieke primers, en bepaalt de kwantitatieve verhouding van de twee producten door de differentiële pieken te vergelijken die in een smeltcurve-analyse worden gegenereerd. Een hoge-resolutie smeltingsanalysemethode die zowel kwantitatieve PCR als smeltingsanalyse gebruikt, is met name geïntroduceerd voor gevoelige detectie van methylering op laag niveau

Microarray-gebaseerde methodenEdit

Microarray-gebaseerde methoden zijn een logische uitbreiding van de technologieën die beschikbaar zijn om bisulfiet-behandeld DNA te analyseren om genoombrede analyse van methylering mogelijk te maken. Oligonucleotide microarrays worden ontworpen met behulp van paren van oligonucleotide hybridisatie probes gericht op CpG sites van belang. De ene is complementair aan de ongewijzigde gemethyleerde sequentie, en de andere is complementair aan de C-naar-U-omgezette ongemethyleerde sequentie. De probes zijn ook bisulfiet-specifiek om binding aan DNA dat onvolledig door bisulfiet is omgezet, te voorkomen. De Illumina Methylation Assay is zo’n assay waarbij de bisulfietsequencingtechnologie op microarray-niveau wordt toegepast om genoombrede methyleringsgegevens te genereren.