Brainbow

Drie kopieën van het genetische construct maken de expressie mogelijk van meerdere fluorofoorkleurencombinaties. Lawson Kurtz e.a. / Duke University

Het genetische basisconstruct Brainbow1. Lawson Kurtz et al. / Duke University

Brainbow-technieken berusten op de Cre-Lox recombinatie, waarbij het eiwit Cre recombinase zorgt voor inversie of excisie van DNA tussen loxP-locaties. De oorspronkelijke Brainbow-methode omvat zowel Brainbow-1 als Brainbow-2, die verschillende vormen van cre/lox-recombinatie gebruiken. Brainbow-3, een aangepaste versie van Brainbow-1, werd in 2013 ontwikkeld. Voor alle Brainbow-subtypes is de expressie van een bepaald XFP een stochastische, of willekeurige, gebeurtenis.

Brainbow-1 gebruikt DNA-constructen met verschillende fluorescente eiwitgenen (XFP’s) gescheiden door mutante en canonieke vormen van loxP. Dit creëert een set van wederzijds uitsluitende excisie mogelijkheden, aangezien cre-gemedieerde recombinatie alleen optreedt tussen identieke loxP sites. Na recombinatie optreedt, is het fluorescerende eiwit dat wordt achtergelaten direct na de promotor op unieke wijze tot expressie. Zo kan een constructie met vier XFP’s, gescheiden door drie verschillende loxP-locaties, drie excisiegebeurtenissen en de oorspronkelijke constructie vier verschillende fluorescerende eiwitten produceren.

Brainbow-2 gebruikt Cre-excisie en inversie om meerdere expressiemogelijkheden in een gegeven constructie mogelijk te maken. In een DNA-segment met twee tegengesteld georiënteerde XFP’s induceert Cre een willekeurige inversie die één fluorescerend eiwit in de juiste richting voor expressie achterlaat. Als twee van deze inverteerbare sequenties op één lijn liggen, zijn drie verschillende inversiegebeurtenissen mogelijk. Wanneer ook rekening wordt gehouden met excisiegebeurtenissen, zal een van de vier fluorescerende eiwitten tot expressie komen voor een gegeven combinatie van Cre-excisies en inversies.

Brainbow-3 behoudt het Brainbow-1 loxP-formaat, maar vervangt de RFP-, YFP- en CFP-genen door mOrange2, EGFP, en mKate2. mO2, EGFP, en mK2 werden gekozen zowel omdat hun fluorescerende excitatie en emissie spectra minimaal overlappen, en omdat ze delen minimale sequentie homologie, waardoor voor het ontwerp van selectieve antilichamen die kunnen worden gebruikt om ze te detecteren in immunohistochemische protocollen. Brainbow-3 pakt ook het probleem van ongelijkmatige vulling van neuronen met XFP’s aan door gefarnesyleerde derivaten van de XFP’s te gebruiken, die gelijkmatiger naar neuronale membranen worden getransporteerd.

Brainbow wordt in vivo geïmplementeerd door twee transgene organismestammen te kruisen: een die het Cre-eiwit tot expressie brengt en een andere die is getransfecteerd met verschillende versies van een loxP/XFP-construct. Met behulp van meerdere kopieën van het transgen kan de XFP’s te combineren op een manier die kan geven een van ongeveer 100 verschillende kleuren. Aldus wordt elk neuron gelabeld met een andere tint op basis van de gegeven combinatorische en stochastische expressie van fluorescerende proteïnen.

Om differentiële XFP expressiepatronen in een zichtbare vorm te verhelderen, worden hersenplakjes afgebeeld met confocale microscopie. Bij blootstelling aan een foton met zijn specifieke excitatiegolflengte, zendt elke fluorofoor een signaal uit dat wordt verzameld in een rood, groen of blauw kanaal, en de resulterende lichtcombinatie wordt geanalyseerd met data-analyse software. Superimposition van differentieel gekleurde neuronen maakt visuele ontwarring van ingewikkelde neurale circuits.

Brainbow is voornamelijk getest in muizen tot op heden, maar de hierboven beschreven basistechniek is ook gewijzigd voor gebruik in meer recente studies sinds de komst van de oorspronkelijke methode geïntroduceerd in 2007.

MiceEdit

Een brainbow van neuronen in een muis embryo (b), evenals een aantal tractografische beelden van soortgelijke neuronen (Chédotal en Richards, 2010)

De hersenen van de muis hebben 75.000.000 neuronen en lijken meer op een menselijk brein dan drosophila en andere veelgebruikte organismen om deze techniek te modelleren, zoals C. elegans. Muizen waren de eerste organismen waarin de Brainbow methode van neuroimaging met succes werd toegepast. Livet et al. (2007) ontwikkelden twee versies van Brainbow muizen met Brainbow-1 en Brainbow-2, die hierboven zijn beschreven. Bij het gebruik van deze methoden om een volledige kaart te maken en de axonen van een muis spier te volgen, is het noodzakelijk om tienduizenden beelden te verzamelen en ze te compileren in stacks om een compleet schema te maken. Het is dan mogelijk om elke motor axon en zijn synaptische contacten traceren tot een volledige connectome van de spier te construeren.

Meer voorbeelden van neuronen onderzocht met behulp van de Brainbow techniek in transgene muizen bevinden zich in de motor zenuw innervatie oor spieren, axon traktaten in de hersenstam, en de hippocampale dentate gyrus.

DrosophilaEdit

De complexiteit van de Drosophila hersenen, bestaande uit ongeveer 100.000 neuronen, maakt het een uitstekende kandidaat voor de uitvoering van neurofysiologie en neurowetenschappen technieken zoals Brainbow. In feite, Stefanie Hampel et al. (2011) gecombineerd Brainbow in combinatie met genetische targeting tools om individuele neuronen te identificeren binnen de Drosophila hersenen en verschillende neuronale lineages. Een van de genetische targeting tools was een GAL4 / UAS binaire expressie systeem dat de expressie van UAS-Brainbow controleert en richt de expressie aan kleine groepen van neuronen. Het gebruik van ‘Flip Out’ methoden verhoogde de cellulaire resolutie van het reporter construct. De expressie van fluorescerende eiwitten, zoals met de oorspronkelijke Brainbow, hing af van Cre recombinatie die overeenkomt met gematchte lox sites. Hampel et al. (2011) ontwikkelden ook hun eigen variatie van Brainbow (dBrainbow), gebaseerd op antilichaam labeling van epitopen in plaats van endogene fluorescentie. Twee kopieën van hun construct leveren zes heldere, scheidbare kleuren op. Dit, samen met vereenvoudigingen in kleurtoewijzing, stelde hen in staat om de trajecten van elk neuron over lange afstanden te observeren. Specifiek traceerden zij motorneuronen van de antennaalkwab tot neuromusculaire knooppunten, waardoor zij de specifieke spierdoelen van individuele neuronen konden identificeren.

Uiteindelijk biedt deze techniek de mogelijkheid om het neuronale circuit in Drosophila efficiënt in kaart te brengen, zodat onderzoekers in staat zijn om meer informatie te ontdekken over de hersenstructuur van deze ongewervelde en hoe deze verband houdt met het daaruit voortvloeiende gedrag.