Current applications of antibody microarrays

Gevolge de unieke mogelijkheden van de antilichaam microarray en zijn toepasbaarheid in een reeks van biomedische projecten, zijn er een reeks van verschillende antilichaam microarrays ontwikkeld, waarvan sommige commercieel beschikbaar zijn gekomen. Hier hebben we enkele van de representatieve studies van de laatste 7 jaar verzameld (Tabel 1), en ons overzicht in twee delen opgesplitst, afhankelijk van de focus van de projecten: basisbiologie-gedreven studies en klinisch onderzoek. Aangezien het praktisch onmogelijk blijft om alle recente toepassingen van antilichaam microarray te behandelen, concentreren wij ons op die toepassingen die wij van groot belang achten en bevindingen van belangrijke klinische betekenis.

Basisonderzoek

Signaleringsroute gerelateerde

Verschuivingen in signaleringsroutes is een kenmerk van veel ziektebeelden, waaronder kanker , diabetes en neurodegeneratieve aandoeningen . Het bouwen van antilichaam arrays met behulp van capture reagentia gericht op eiwitten in de signalering cascade van belang heeft onderzoekers in staat gesteld om veranderingen in eiwitprofielen en modificaties in signalering routes te onderzoeken in normale biologische processen en ziekte toestanden. Onderzoekers hebben dit concept toegepast op een reeks biologische monstermaterialen en preparaten, met inbegrip van cellysaten , weefselextracten , en plasma .

Calbindin-D28 k (CB), een belangrijk calciumbindend eiwit dat fungeert als een calciumbuffer en blijkt tot expressie te komen op lagere niveaus in de hersenen van muizen en mensen met de ziekte van Alzheimer, maar het is niet bekend of deze veranderingen bijdragen tot AD-gerelateerde disfunctie (AD). Kook et al. genereerden een CB-deficiënte Alzheimer transgene muis (CBKOTg) om de bijdrage van CB aan signaalwegen in AD te onderzoeken. Gebruikmakend van antilichaam microarrays om hersenweefsel van muizen te onderzoeken, identificeerden zij significante veranderingen in celdood pathways, synaptische transmissie en MAPK signaalwegen na CB deletie. Deze bevindingen werden geverifieerd door immunohistochemie die verhoogde apoptotische markers en verhoogde neuronale sterfte aantoonde, wat aantoont dat antilichaam microarrays nieuwe informatie kunnen verschaffen, waardoor ons begrip van de rol van CB en zijn implicatie in AD pathofysiologie wordt vergroot.

Antilichaam microarrays zijn gebruikt om de fysiologische rol in sterk geconserveerde eiwitten, waaronder elongatiefactor 4, bloot te leggen. Gao et al. ontleedden het mechanisme van de kwaliteitscontrole factor mitochondriale Elongation factor 4 (mtEF4) in de translatie met behulp van een fosfo-explorer antilichaam microarray . Door het vergelijken van cel lysaten tussen mtEF4 knock-out en WT muizen testis weefsels, vonden ze dat de vouw verrijking van mTOR was de hoogste onder de verschillende signaalwegen. De auteurs toonden aan dat met mtEF4 deletie, het belangrijkste feedback signaal vanuit het somatische cytoplasma mTOR upregulatie is. Dit ging gepaard met een verhoogde cytoplasmatische translatie, wat erop wijst dat mTOR een cruciale rol speelt als een stroomafwaartse effector die het tekort aan mitochondriale translatie compenseert. Bovendien verbond de studie voorheen onbeschreven cross-talk tussen mtEF4-afhankelijke kwaliteitscontrole in de mitochondriën en de mTOR-route in het cytoplasma.

Drug mechanisme

Met behulp van antilichaam microarray assays, kunnen onderzoekers drug mechanismen onderzoeken op een systematische en efficiënte manier. Onder de vele mogelijke toepassingen is tumor-geïnduceerde angiogenese bestudeerd, aangezien het een centrale rol speelt in de progressie van kanker. P11, een nieuw peptide ligand met een PDZ-bindend motief (Ser-Asp-Val) met hoge affiniteit voor integrine αvβ3, werd geïdentificeerd uit een hexapeptide bibliotheek (PS-SPCL) met behulp van een antilichaam microarray. Het farmacologische mechanisme van P11 werd opgehelderd met behulp van een speciaal ontworpen farmacoproteomische microarray benadering die 48 kankergerelateerde antilichamen bevat. De studie toonde aan dat P11 bFGF-geïnduceerde menselijke navelstreng endotheelcelproliferatie remt via mitogeen-geactiveerde proteïnekinase en extracellulair-signaal gereguleerde kinase inhibitie. Bovendien toonde de microarray aan dat P11 de upregulatie van apoptotische merker p53 veroorzaakte, wat resulteerde in apoptose-inductie via activering van het caspasesysteem, wat erop wijst dat P11 een sleutelrol kan spelen in het voorkomen van tumorprogressie. Het verband tussen P11 en p53 stelt klinische en fundamentele kankeronderzoekers voor om verdere aanwijzingen over de rol van P11 en zijn remmende doelwit op te helderen.

Lovastatine, een natuurlijk product afgeleid van Aspergillus terreus of Monascus ruber, is op grote schaal gebruikt als een cholesterolverlagend geneesmiddel in de kliniek. Yang e.a. hebben gebruik gemaakt van een antilichaam-microarray met 656 antilichamen met een focus op verschillende functionele celwegen, die suggereerden dat lovastatine ook kankerbestrijdende eigenschappen heeft, via slecht gedefinieerde mechanismen. Er bestaat een grote behoefte om doeltreffende kankerbehandelingen te vinden en hun werkingsmechanismen te begrijpen. Met behulp van een microarray werden borstkankercellen bestudeerd onder hypoxische condities om de moleculaire mechanismen te onderzoeken via welke Lovastin zijn effect uitoefent. Ze toonden 17 verhoogd-gereguleerde eiwitten en 20 verlaagd-gereguleerde eiwitten aan voor met lovastatine behandelde borstkankercellen, vergeleken met de controle, en de resultaten werden vervolgens gevalideerd door real-time PCR . De eiwitsignatuur omvatte eiwitten die betrokken zijn bij apoptose, celproliferatie en tumormetastase, waardoor modulatie van deze routes in verband wordt gebracht met de farmacologische werking van lovastin.

Het type 2 diabetes geneesmiddel metformine, is ook voorgesteld om anti-kanker eigenschappen te hebben. Lee et al. onderzochten de potentie van nieuwe metforminederivaten met behulp van een antilichaammicroarray gebouwd om celcyclus-gerelateerde moleculen te bestuderen. De auteurs toonden aan dat metformine-butyraat (MFB) een betere anti-tumorwerking had dan metformine-HCl, door een grotere neoplastische activiteit en een betere efficiëntie bij het belemmeren van de voortgang van de celcyclus tijdens de S- en G2/M-fasen, en bovendien een preferentieel cytotoxisch effect leek te hebben op stamcelpopulaties van borstkanker. Deze bevindingen benadrukken hoe antilichaam arrays proteomisch bewijs kunnen leveren ter ondersteuning van de ontwikkeling van geneesmiddelen met een betere werkzaamheid.

Voor fundamenteel biologisch onderzoek kunnen antilichaam microarrays dienen bij het detecteren van signaleringseiwitten en eiwitten die geassocieerd zijn met een bepaald fenotype. Arrays met parallelle detectie van eiwitten creëren een mogelijkheid om meerdere signaleringsroutes in een enkel experiment te onderzoeken, waardoor inzicht wordt verkregen in nieuwe mechanismen, zoals de studie van ziekteprogressie, geneesmiddelinteractie en de reactie op infecties.

Klinisch onderzoek

Analyse van klinische monsters op eiwitniveau zal verbetering van diagnostische markers mogelijk maken, en het sturen van behandelingsopties. Aangezien eiwitten betrokken zijn bij het merendeel van de cellulaire processen, kan eiwitanalyse een biologische ziektesignatuur opleveren, die gedetailleerde inzichten verschaft over de huidige toestand van een cel, orgaan of systeem. Antilichaam microarrays kunnen een real-time gids bieden van de huidige veranderingen in biologische processen tijdens gezondheid en ziekte. In dit deel zullen we voorbeelden geven van hoe antilichaam microarrays zijn gebruikt om klinische cohorten te onderzoeken, waarbij voornamelijk serum en plasma monsters zijn geanalyseerd. Het is niet mogelijk om alle aspecten van antilichaam microarrays voor klinisch onderzoek te behandelen, hierin richten we ons alleen op een aantal van de belangrijkste ziekten, namelijk auto-immuunziekten, infectieziekten, kanker en neurodegeneratieve ziekten.

Autoimmuunziekten

De diagnose van systemische lupus erythematosus (SLE) is een uitdaging vanwege de heterogene klinische presentatie en het ontbreken van robuuste biomarkers om het te onderscheiden van actieve en inactieve ziekte, evenals van andere auto-immuunziekten. Lin et al. voerden een DotScan™ antilichaam microarray screening uit van perifere bloed mononucleaire cellen van 60 SLE patiënten met verschillende ziekte activiteit, 25 reumatoïde artritis patiënten, 28 andere auto-immuun ziekte monsters, en 24 gezonde controles. De antilichaam microarray profielen konden actieve SLE patiënten onderscheiden van gezonde controles. Door gebruik te maken van een leukocyten capture array werd het discriminerend vermogen van de conventionele SLE-diagnostiek verbeterd; door het verifiëren van serum anti-dsDNA, complement C3 en C4, vergrootten de microarrays het vermogen om semi-actieve en actieve SLE te onderscheiden, informatie die zal bijdragen tot een beter ziektebeheer.

In een andere studie construeerden Carlsson et al. 135 humane recombinante enkel-keten fragmentvariabelen (scFv) gericht tegen immuunproteïnen om een in-house antilichaam microarray te construeren. In deze studie onderzochten zij patiënten met systemische sclerose (SSc), SLE en 15 gezonde vrijwilligers. SSc is een auto-immuunaandoening die het bindweefsel aantast, wat een uitdaging kan zijn om een differentiële diagnose van SLE te stellen. De array identificeerde 40 differentieel tot expressie komende eiwitten die een kandidaat proteoom handtekening creëren om SLE en de ernst daarvan af te bakenen van SSc. Deze proteoom signatuur was een betere ziekte classificatie dan enkelvoudige of zelfs combinaties van conventionele klinische parameters, waaronder ANA, anti-DNA, SLEDAI-2 k, C1q, C3, C4 en CRP, hetgeen het potentiële gebruik illustreert van antilichaam microarrays om nieuwe ziekte-signaturen te creëren die klinische waarde zullen toevoegen aan het ziekte management.

Infectieziekten

Infecties activeren het immuunsysteem op verschillende manieren en deze mechanismen kunnen worden onderzocht met behulp van antilichaam arrays op een proteoom-breed niveau. Helicobacter pylori is een ziekteverwekker die ongeveer de helft van de wereldbevolking koloniseert en chronische gastritis veroorzaakt. Sukri et al. gebruikten de DotScan™ antilichaam microarray om de tolerantie van het immuunsysteem ten opzichte van tumorcellen in maagkanker te bepalen met 144 CD-antilichamen om de distributie van CD-merkers tussen Helicobacter pylori geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde maagadenocarcinoma cellen te profileren. Interessant was dat zij ontdekten dat gastrische adenocarcinoom cellijn AGS geïnfecteerd met cagA + H. pylori verhoogde CD27 expressie vertoonde, die essentieel is voor het behoud van T-cel populatie, en verhoogde CD markers werden ook gedetecteerd in H. pylori-geïnfecteerde maagkankerpatiënten. Deze studie suggereert niet alleen de tolerantie van het immuunsysteem ten opzichte van maagkanker, maar ook de variaties in de immuunrespons die door verschillende H. pylori-stammen worden uitgebuit.

Daarnaast kunnen antilichaamarrays nuttig zijn bij het volgen van een voortdurende verandering in de fysiologische omgeving, waaronder de ziektestatus en de respons op therapieën en interventies. Na levertransplantatie werd bij 94% van de patiënten door het hepatitis C-virus (HCV) veroorzaakte histologische schade vastgesteld, waarbij bij sommige patiënten de ziekte ernstig terugkwam. Er is een dringende nood aan voorspellende biomerkers om de ernst van de recidiverende ziekte te identificeren. Met behulp van een CD antilichaam microarray, werd perifeer bloed van patiënten gedefinieerd als pre-transplantatie, vroege, midden, en late-transplantatie groepen onderzocht om de ernst van HCV recidief na transplantatie te voorspellen. Seriële bloedstalen genomen bij patiënten voor en na levertransplantatie maakten het mogelijk het ziektemilieu te volgen, met zijn eigen interne controles. Vijf CD-markers (CD27, CD182, CD260, CD41, en CD34) waren significant verhoogd bij ernstig recidief vergeleken met licht recidief. Dit resultaat toont aan dat antilichaam-arrays kunnen helpen bij het beoordelen van de ernst van recidiverende HCV-ziekte na levertransplantatie.

Ellmark et al. ontwierpen een één-kader recombinant antilichaam (SinFabs) microarray met 127 verschillende antilichamen tegen immuunregulerende antigenen geselecteerd uit de n-CoDeR-bibliotheek op maag-adenocarcinoom. Zij ontdekten dat verschillende tumor- en infectie-geassocieerde eiwitexpressie handtekeningen, zoals IL-9, IL-11, en MCP-4, geïdentificeerd konden worden uit de plasma proteomen en dienen als potentiële biomarkers. Deze bevindingen kunnen helpen om het begrip van H-pylori geïnduceerde kanker te verbeteren en kunnen de weg vrijmaken voor verfijnde diagnostiek in de toekomst.

Blad-gebaseerde antilichaam arrays zijn uitgevoerd om differentiële eiwitprofielen in plasma te onderzoeken bij kinderen die lijden aan malaria en malaria-gerelateerde complicaties. Van de 1000 gescreende eiwitten vertoonden 41 eiwitten een verschillende expressie tussen met malaria besmette kinderen en kinderen uit de controlegroep. Dertien andere eiwitten werden in verband gebracht met de ernst van de malaria-ziekte. Deze bevindingen wijzen op de betrokkenheid van ontsteking en een onevenwichtig glucosemetabolisme bij ernstige vormen van de ziekte en de grootste veranderingen werden gezien in twee spiereiwitten (koolzuuranhydrase 3 en creatinekinase) die wezen op spierschade en -letsels bij kinderen met cerebrale malaria. Deze bevindingen kunnen helpen bij de ontwikkeling van eenvoudige tests om malaria-geïnfecteerde kinderen te classificeren in een groep met een hoger risico voor de ernstige vorm van de ziekte.

Kanker

Antilichaam microarrays zijn toegepast voor kankeronderzoek voornamelijk om kankerprogressie te bestuderen en kandidaat-eiwitten die kunnen dienen als diagnostische biomarkers . Pancreaskanker is een agressieve ziekte met een slechte prognose, en er is dringend nood aan ziektespecifieke biomarkers die een vroege en accurate diagnose mogelijk maken. Met behulp van een intern ontwikkeld recombinant antilichaam microarray platform, screenden Wingren et al. sera van 148 patiënten met pancreaskanker, chronische pancreatitis, auto-immune pancreatitis (AIP), en gezonde controles. Zij identificeerden een panel van 25 eiwit targets, waaronder IL-2, IL-11, IL-12, TNF-, die bijdroegen aan het onderscheiden van pancreaskanker van gezonde controles. Deze 25-eiwit signatuur vertoont een hoog diagnostisch potentieel (AUC van 0,88). Bovendien heeft de groep onlangs de analyse van hun panel uitgebreid tot andere monstersets, waaronder lymfomen, prostaatkanker en borstkanker in cellysaten en plasma. Deze bevindingen zijn nuttig om te helpen bij de ontwikkeling van nieuwe en multivariate diagnostische methoden.

Een van de belangrijkste vragen in de kankerbiologie, is het bepalen van de invasiviteit van een tumor. Een studie ontwikkelde een op maat gemaakt antilichaam microarray platform met 4096 kenmerken om plasma monsters te ondervragen van pre-invasieve en invasieve ziekten van een muismodel van pancreas ductaal adenocarcinoom (PDA) . Ze vonden een eiwit handtekening, bestaande uit de differentiële expressie van drie eiwitten, ERBB2, TNC en ESR1, die kon worden gebruikt om de AUC te verbeteren van 0,86 (95% betrouwbaarheidsinterval 0,76-0,96) tot 0,97 (95% CI 0,92-1,0) wanneer de PDA-marker CA19-9 opgenomen.

De meerderheid van de nieuw gediagnosticeerde gevallen van blaaskanker zijn laag-stadium, laag-gradig, niet-musculaire-invasieve . Na standaard transurethrale resectie komt 50-70% van de tumoren terug, maar 10-30% van de tumoren zal zich ontwikkelen tot spier-invasieve ziekte. Inzicht in het mechanisme van tumorprogressie zou meer bruikbare informatie kunnen opleveren voor klinische toepassingen. Srinivasan et al. bestudeerden cellysaten met een antilichaam-microarray die 810 kankergerelateerde antilichamen bevatte, geconstrueerd door het Hoheisel-laboratorium. De auteurs bouwden een multivariate classifier met 20 proteïnen, die de voorspelling van recidief vergemakkelijkte met een gevoeligheid van 80% en een specificiteit van 100%. Interessant is dat zij repressie van de TGF-β signaalweg vonden bij terugkerende kanker. De signaalfactoren IFNG, TNF-α, en THBS1 kwamen minder tot expressie en de abundantie van de inhibitor MAPK3 (ook bekend als ERK1) was hoger, terwijl SMAD2, SMAD3, en SMAD4 weer significant ondervertegenwoordigd waren . De gegevens duidden erop dat TGF-β signaalweg remmers de terugkeer van blaaskanker kunnen verminderen.

Puig-Costa et al. gebruikten antilichaam microarrays om biomarkers voor maagkanker (GC) te ontdekken. De antilichaam microarray bevatte antilichamen gericht tegen verschillende bekende functionele eiwitten die een cruciale rol spelen bij de progressie van kanker, waaronder 120 cytokines, 43 angiogene factoren, 41 groeifactoren, 40 ontstekingsfactoren en 10 metalloproteïnasen. Ingenuity pathway analyse bevestigde dat sommige biomarkers, zoals ICAM-1 en angiogenine, wezen op een hoge ontstekingsreactie bij GC-patiënten. Doelwitten voor celbeweging en immuunceltransport, zoals monocyte chemoattractant protein (MCP)-1, bleken oververtegenwoordigd te zijn bij GC-patiënten. De positief voorspellende en negatief voorspellende waarden in dit validatiecohort bedroegen respectievelijk 75% (95% CI 53-90) en 80% (95% CI 56-94). Tenslotte identificeerden antilichaam microarray analyses van het GC-geassocieerde inflammatoire proteoom een 21-eiwit inflammatoire eiwit-gedreven maagkankersignatuur (INPROGAS) die GC nauwkeurig onderscheidde van niet-kankerachtig maagslijmvlies, en nieuwe aanknopingspunten kan bieden voor de analyse van kankerprogressie.

In prostaatkanker gebruikten Schwenk et al. antilichaam arrays op suspensie bead arrays om plasma niveaus van eiwitten tussen verschillende groepen te vergelijken om zo aanvullende biomarkers te vinden naast prostaat-specifiek antigeen (PSA). Naast het classificeren van de patiënten op basis van PSA, identificeerden zij verlaagde plasma CNDP1 niveaus en in een latere grotere studie werd aangetoond dat dit associeerde met meer agressieve vormen van de ziekte. Een sandwich immunoassay werd ontwikkeld om deze bevindingen bij meer dan 1200 patiënten te valideren, en de associatie van het verlaagde CNDP1 met lymfekliermetastase werd verder opgehelderd. Dit is een van de zeer weinige studies die met succes een eerste indicatie hebben gevalideerd via de antilichaam microarray pijplijn en de ontwikkeling van een gerichte assay. In een later onderzoek naar kanker cachexie werd vastgesteld dat de plasmaniveaus van CNDP1 verlaagd waren bij cachexische patiënten, wat wijst op een metabolische rol van veranderingen in CNDP1 niveaus.

In een studie van dunne darm neuroendocriene tumoren, onderzochten Darmanis et al. de plasmaniveaus van twee onafhankelijke studiesets (77 en 132 stalen) en een gerichte bead array voor 124 unieke proteïnen. Zij konden een classificatienauwkeurigheid tot 85% bereiken met gebruikmaking van een panel van eiwitten en besloten met het voorstellen van nieuwe kandidaten voor de classificatie van de tumoren. Van de kandidaten op de shortlist, zoals voor IGFBP2 en IGF1, voerde de groep ELISA-tests uit om de aanwijzingen te bevestigen. Deze bevindingen wijzen op een metabolische associatie van plasma-eiwitten met kanker en ondersteunen de overweging van deze doelwitten in toekomstige kankerstudies.

Neurodegeneratieve ziekten

Analyse van eiwitexpressie biedt een mogelijkheid om de huidige kennis over neurodegeneratieve pathofysiologie uit te breiden. Recente vooruitgang op het gebied van proteomics hebben de mogelijkheid geboden om te zoeken naar nieuwe biomarkers met behulp van antilichaam microarrays . Vooruitgang in de ontwikkeling van protocollen hebben onderzoekers in staat gesteld om niet alleen bloed, maar ook cerebrospinale vloeistof (CSF) te bestuderen.

Binnen de neuroproteomics heeft het Nilsson lab verschillende studies uitgevoerd door gebruik te maken van antilichamen uit de Human Protein Atlas samen met de suspensie bead array assays. Bij het profileren van CSF van patiënten met Multiple Sclerose (MS) vonden zij GAP43, een cytoplasmatisch eiwit dat betrokken is bij de vorming en regeneratie van neuronen, vandaar een veelbelovende biomarker voor hersenziekten. Meer recentelijk vergeleken Remnestål et al. eiwitniveaus in 441 CSF-monsters, verzameld uit verschillende neurodegeneratieve ziektemonsters, alsmede CSF die post mortem was verzameld. Onder 376 antilichamen bleken de synaptische eiwitten GAP43 en NRGN geassocieerd te zijn met AD-patiënten in vergelijking met controles.

Gebruik makend van plasmamonsters, CSF en hersenweefsel van MS-patiënten, werd een grootschalige screening uitgevoerd die begon met het gebruik van 4500 antilichamen op bead arrays . Er werd een reeks eiwitten gevonden die geassocieerd waren met MS subtypes in CSF en plasma. Het gebruik van sommige kandidaat-antilichamen tegen IRF8, IL7 en METTL14 voor immunofluorescentieanalyse van hersenweefsel toonde aan dat neuronen in de nabijheid van MS-laesies gekleurd waren. Dit geeft aan dat antilichamen geselecteerd uit array-gebaseerde assays voor analyse van lichaamsvloeistoffen ook verder bewijs kunnen leveren bij het aangetaste weefsel.

Ten slotte werden de bead arrays gebruikt om plasma te profileren van patiënten die lijden aan amyotrofische laterale sclerose (ALS) , waarbij 367 ALS-patiënten en 101 controles werden geanalyseerd op 278 eiwitten. De studie besluit met het voorstellen van neurofilament medium polypeptide (NEFM), solute carrier family 25 (SLC25A20), en regulator of G-protein signalling 18 (RGS18) als waardevolle eiwitten omdat ze betrokken zijn bij processen die verband houden met ziekte pathofysiologie, die verdere validatie rechtvaardigen in onafhankelijke sample sets.