Cytotoxische en genotoxische effecten van Acephate op menselijk sperma

Abstract

Extensief gebruik van organofosforpesticiden (OP’s) kan de kwaliteit van sperma en het DNA van sperma in verschillende stadia van de spermatogenese veranderen. Acefaat is een zeer toxisch, extensief gebruikt OP en daarom wilden we de effecten van acefaat op de spermakwaliteit en de integriteit van het DNA van sperma evalueren. Sperma van gezonde mannen werd blootgesteld aan 0, 50, 100 en 200 μg/mL acefaat en geïncubeerd gedurende 1, 2 en 3 uur. Vervolgens werden de beweeglijkheid, de vitaliteit, de functionele integriteit van het plasmamembraan, de capacitatie van het sperma en de DNA-beschadiging van het sperma onderzocht. De resultaten toonden een significante afname van de beweeglijkheid bij 100 μg/mL na 3 uur en bij 200 μg/mL na 1 uur, 2 uur en 3 uur. De levensvatbaarheid was significant verminderd bij 200 μg/mL na 2 uur en 3 uur. De functionele integriteit was significant aangetast bij 100 μg/mL na 3 uur en bij 200 μg/mL dosis na 2 uur en 3 uur. Evenzo werd de capacitatie van sperma significant beïnvloed bij 200 μg/mL na 1 uur, 2 uur en 3 uur en bij 100 μg/mL na 3 uur. DNA-beschadiging was alleen significant toegenomen bij 200 μg/mL dosis na 3 uur. De studie suggereert dat blootstelling aan acefaat kan resulteren in veranderingen van de spermastructuur en de spermafunctie en zo kan bijdragen tot een verslechtering van de spermakwaliteit bij de mens, hetgeen onvruchtbaarheid kan veroorzaken.

1. Introduction

Over the past few decades several studies have shown destructive reproductive function in animals and in humans owing to man-made chemicals and other toxicants . Helaas hebben betrekkelijk weinig studies systematisch aandacht besteed aan de gevolgen van milieublootstelling voor de reproductieve gezondheid van de mens. Volgens recente studies zijn er wereldwijd jaarlijks zo’n 60-80 miljoen paren onvruchtbaar (zij slagen er niet in zwanger te worden na 12 maanden regelmatig onbeschermd geslachtsverkeer). Achtennegentig procent van de gevallen van subfertiliteit bij mannen kan hoofdzakelijk worden toegeschreven aan een gebrekkige kwaliteit van de spermatozoa. Subfertiliteit kan echter ook als idiopathisch worden beschouwd en kan het gevolg zijn van risicofactoren zoals hormoonontregelaars in het milieu, waaronder pesticiden.

Organofosfaatpesticiden zijn esters van fosfor- en thiofosforzuren en hun toxiciteit is in verband gebracht met hun vermogen om de werking van acetylcholinesterase te remmen, wat leidt tot accumulatie van acetylcholine bij zenuwknooppunten. Vele epidemiologische studies hebben het verband erkend tussen blootstelling aan organo-fosfaat pesticiden (OP’s) en voortplantingsstoornissen zoals onvruchtbaarheid, geboorteafwijkingen, ongunstige zwangerschapsuitkomsten en perinatale sterfte . Organofosfaatpesticiden worden ervan verdacht de voortplantingsfunctie te veranderen door de acetylcholinesterase-activiteit in de hersenen te verminderen en de hypofyse gonadotrofine te beïnvloeden, hetgeen onvruchtbaarheid veroorzaakt. De effecten op de kwaliteit van het sperma kunnen worden beoordeeld aan de hand van parameters zoals de spermaconcentratie, het percentage beweeglijk sperma en het percentage sperma met een normale morfologie, alsmede de bewegingsparameters van het sperma. Uit verschillende studies is gebleken dat mannen die aan OP werden blootgesteld, een groot risico liepen abnormale spermaparameters te ontwikkelen, waaronder een verlaagde spermaconcentratie, een verlaagde beweeglijkheid van de spermacellen, een verlaagd aantal spermacellen en een hogere aneuploïdie van geslachtschromosomen in het sperma. Een in China uitgevoerde studie met verschillende OP toonde een duidelijk verband aan tussen de aanwezigheid van metabolieten van insecticiden in de urine en de spermaconcentratie en de beweeglijkheid van sperma bij pas gehuwde mannen. In-vitro-onderzoeken met OP hebben aangetoond dat deze pesticiden het DNA in menselijk sperma kunnen beschadigen en zo genotoxische effecten kunnen veroorzaken.

Tot de veelgebruikte en giftige OP’s in Sri Lanka behoort acefaat (O,S-dimethylacetylfosforamidothioaat), een insecticide dat in de landbouw en voor huishoudelijke doeleinden wordt gebruikt vanwege zijn breed spectrum aan insecticide-eigenschappen. Acefaat is een systemisch insecticide met contact- en maagwerking. Het toxische mechanisme van acefaat wordt niet alleen toegeschreven aan remming van acetylcholinesterase (AchE), maar ook aan het optreden als vertraagd neurotoxisch agens. Sing en Jiang meldden dat acefaat een krachtige neurotoxische, mutagene, carcinogene en cytotoxische verbinding is. Evenzo toonden Farag et al. aan dat doses van 14 en 28 mg/kg/dag acefaat de beweeglijkheid van zaadcellen en het aantal zaadcellen bij volwassen mannelijke muizen verminderde. Twee andere studies hebben bevestigd dat acefaat de vruchtbaarheid, de dynamiek van het sperma, het gewicht van de geslachtsorganen en de geslachtshormonen bij mannelijke albino-ratten aanzienlijk vermindert. Daarom bestaat er, net als bij andere OP’s, een potentieel risico van deze verbinding voor de reproductieve gezondheid van de mens.

Acefaat wordt op grote schaal gebruikt door landbouwers in Sri Lanka, die zich in hun beste reproductieve leeftijd bevinden. In de laatste twee tot drie decennia is duidelijk geworden dat beroepsmatige blootstelling aan pesticiden de vruchtbaarheid van mannen kan aantasten, hetgeen wijst op een hoog blootstellingsrisico van deze jonge telers. De regulering van pesticiden is hoofdzakelijk gebaseerd op diermodellen en gegevens over menselijke blootstelling en spermakwaliteit zijn nog steeds schaars en beperkt. Daarom werd de huidige studie uitgevoerd om de effecten van acefaat op de menselijke mannelijke vruchtbaarheid en de DNA-integriteit van spermacellen in vitro te onderzoeken.

2. Materialen en methoden

2.1. Testmateriaal

Ongeformuleerd acefaat (handelsnaam: Surrender; molecuulformule: C4H10NO3PS; molecuulgewicht: 183,16 g/mol; zuiverheid: 99,0%; door de fabrikant aanbevolen velddosering: 1 g acefaat in 1 L water) werd verkregen van Hayleys Agriculture Ltd., Colombo, Sri Lanka. Aangezien acefaat goed oplosbaar is in Biggers Whitten Whittingham (BWW), werd het als controle gebruikt.

2.2. Spermaverzameling en -bereiding

Spermamonsters werden verzameld bij gezonde mannelijke donoren (leeftijd 20-30 jaar) van de Universiteit van Sri Jayewardenepura, Sri Lanka, in een steriel specimenflesje. Voorafgaand aan de spermacollectie kregen de donoren een informatieblad en een toestemmingsformulier waarin hun bereidheid om deel te nemen aan het onderzoek werd gevraagd. Alle deelnemende personen werd gevraagd zich 3 tot 5 dagen voor de spermawinning te onthouden van seksuele activiteit. Mannen (gemiddelde leeftijd van ) met normale spermaconcentratie, beweeglijkheid, morfologie, viscositeit, liquefactietijd en pH en afwezigheid van onrijpe vormen en leukocyten werden voor de studie geselecteerd. De spermaparameters (beweeglijkheid, vitaliteit, hypoosmotische zwellingstest en morfologie) werden geëvalueerd volgens de richtlijnen van de Wereldgezondheidsorganisatie. Aangezien de effecten van acefaat kunnen worden versterkt met abnormaal sperma, is het belangrijk om donoren te selecteren met een aanvaardbare spermakwaliteit voor de studie.

Ethische goedkeuring (Ethical clearance ref. nnumber: 712/13) werd verkregen door de Ethics Review Committee, Faculty of Medical Sciences, University of Sri Jayewardenepura, Nugegoda, Sri Lanka.

2.3. Om de dosisniveaus te bepalen, werd de LD50-waarde van acefaat voor de beweeglijkheid van sperma bepaald. Daartoe werd een monster met 1 mg acefaat in 1 mL BWW bereid, wat overeenkomt met de aanbevolen velddosering (1 g acefaat in 1 L water) van acefaat. De bereide monsters werden vervolgens verdund met BWW om verschillende concentraties van acefaat te verkrijgen. Spermasuspensies (vastgesteld op 50 × 106 spermatozoa/mL) werden in Eppendorf-buisjes gedaan en het gewenste volume BWW of testoplossing werd toegevoegd (het uiteindelijke volume van het buisje is gelijk aan 1 mL). De monsters werden grondig gemengd en vervolgens gedurende 1 uur geïncubeerd in een bevochtigde incubator (Sanyo Electric Co. Ltd., Tokyo, Japan) bij 37°C in 5% CO2. Na incubatie werd de procentuele beweeglijkheid van spermatozoa bij elke concentratie bepaald door twee onafhankelijke waarnemers onder een Olympus microscoop met fasecontrastoptiek (X 400; Olympus Corporation, Japan). Op basis van dit proefonderzoek om aanwijzingen voor toxische doses voor spermamonsters te bepalen, is gebleken dat de LD50-waarde voor acefaat 200 μg/mL bedraagt. Daarom werden in de huidige studie subletale concentraties gebruikt die lager waren dan LD50, inclusief de LD50-waarde.

Hieronder worden de geselecteerde dosisniveaus voor de huidige studie gegeven: Hoge dosis: 200 μg/mL (gelijk aan LD50-waarde). Middelste dosis: 100 μg/mL. Lage dosis: 50 μg/mL.Verder hebben we besloten om de tijdstippen uit te breiden van 1 uur tot 2 uur en 3 uur om de langdurige effecten van blootstelling aan acefaat te bepalen.

2.4. Incubatie met bestrijdingsmiddel

Verse spermamonsters () werden verdund met BWW om een uiteindelijke spermaconcentratie van 40 × 106 spermatozoa/mL te verkrijgen. Vervolgens werden de monsters geïncubeerd met bestrijdingsmiddel in concentraties van 50, 100 en 200 μg/mL of met BWW. Incubaties werden uitgevoerd in 1 ml eindvolume gedurende 1, 2 en 3 uur bij 37°C in een incubator (Sanyo Electric Co. Ltd., Tokyo, Japan) in een atmosfeer van 5% CO2 en 95% O2.

2.5. Bepaling van de beweeglijkheid van het sperma

Totaal beweeglijke spermatozoa werd geschat (ongeveer 100 cellen) door twee onafhankelijke waarnemers onder fasecontrast-optiek (X 400; Olympus Corporation, Japan). Het percentage voorwaartse motiliteit werd berekend.

2.6. Cytotoxicity Assay

De levensvatbaarheid van spermatozoa werd beoordeeld met behulp van Eosine Y-kleuringstechniek en dode en levende spermatozoa werden berekend. Percentage levensvatbaarheid = (totaal aantal cellen – aantal gekleurd/totaal aantal cellen) × 100. Totaal aantal cellen = 100.

2.7. Bepaling van de functionele integriteit van het plasmamembraan van sperma

De functionele integriteit van het plasmamembraan van sperma werd beoordeeld met behulp van de door Jeyendran et al. beschreven Hypoosmotic Swelling (HOS)-test. Per preparaat werden ten minste 100 spermatozoa geteld.

2.8. Bepaling van Capacitation

Een aliquot van 150 pi BWW medium werd geplaatst in een voorverwarmde cultuur schotel (35 × 10 mm, Corning, New York, USA) en bedekt met een voorverwarmde 22 × 22 mm dekglaasje. Een aliquot van 20 pi sperma monster werd toegevoegd aan een hoek van het dekglaasje. De cultuur schotel werd geplaatst in een omgekeerde microscoop (Diaphot, Nikon, Londen, UK) uitgerust met een thermostatisch geregelde lucht verwarmde kast (Nikon, Londen, UK) equilibrated bij 37 ° C. De toestand van de spermacapacitatie werd beoordeeld op basis van hyperactivering door de objectieve fotografische methode met een Olympus IX71 fasecontrastmicroscoop. Aangezien hyperactivering een flagellaverschijnsel is, is het mogelijk hyperactivering visueel te beoordelen aan de hand van de beweeglijkheid van de spermacellen; de bewegingspatronen van de flagellen werden geëvalueerd voor de opsomming van niet-gehyperactiveerde en hypergeactiveerde spermacellen. De experimenten werden in duplo uitgevoerd en onafhankelijk van elkaar viermaal herhaald.

2.9.

Sperma-uitstrijkjes werden geprepareerd op gereinigde microscoopglaasjes en het percentage sperma met normaal DNA werd bepaald door 500 spermacellen te tellen onder fluorescentiemicroscopie (BH-2, Olympus Ltd., Japan) met excitatie van 490 nm. De observatietijd voor een enkel veld bedroeg minder dan 40-50 sec. De spermacellen die een gele tot rode kleur vertoonden, werden gescoord als gedenatureerd DNA en spermacellen die een groene kleur vertoonden, werden gescoord als normaal DNA. Statistische analyse

Het aantal zaadcellen van volwassen mannen was normaal verdeeld en werd vergeleken tussen groepen met een tweewegs variantieanalyse (ANOVA) met behulp van het Minitab-softwarepakket (Minitab Co., USA) voor het hoofdeffect van de bestrijdingsmiddelen. Wanneer een significant behandelingseffect werd gevonden, werden de verschillen tussen de individuele groepsgemiddelden getoetst met “Tukey 95%”. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± Standard Error Mean (SEM). waarde werd vastgesteld op .

3. Resultaten

3.1. In vergelijking met de controle was de beweeglijkheid bij de middelste dosis (100 μg/mL) na 3 uur incubatie met 16% aanzienlijk () verminderd (tabel 1). Daarentegen werd een zeer significante () vermindering geregistreerd bij 200 μg/mL na 1 uur, 2 uur en 3 uur incubatie in vergelijking met de controles. Verder is de vermindering van motiliteit duidelijk in elke dosering met toenemende incubatietijd.

Parameters Tijd van blootstelling (h) Behandeling (µg/mL) 0 50 100 200 Motiliteit (%) 1 86.5 ± 2.4 82.9 ± 1.5 75.7 ± 2.7 62.0 ± 0.9 2 79.3 ± 2.1 76.3 ± 1.9 74.1 ± 3.1 58.9 ± 2.8 3 72.3 ± 1.9 67.3 ± 2.5 60.2 ± 2.6 37.2 ± 4.8 Betrouwbaarheid (%) 1 88,4 ± 1.6 84.4 ± 1.2 80.4 ± 1.3 74.4 ± 1.8 2 78.8 ± 1.0 76.5 ± 1.2 74.9 ± 1.3 62.9 ± 1.6 3 70.8 ± 0.5 68.4 ± 1.6 66,8 ± 1,1 47,8 ± 1,4 Spermazwelling (%) 1 81,2 ± 5.3 78.9 ± 3.9 72.7 ± 2.6 65.4 ± 3.7 2 76.6 ± 3.8 73.8 ± 2,9 68.8 ± 2.7 56.6 ± 2.9 3 69.7 ± 2.9 69.2 ± 3.2 60.2 ± 3.1 45.2 ± 2,9 Gecapaciteerde spermatozoa (%) 1 38,5 ± 1,6 38,5 ± 1,4 36.1 ± 2.6 25.7 ± 2.7 2 35.7 ± 2.1 33.0 ± 3.8 34.5 ± 2.6 22.5 ± 2.6 3 33.3 ± 1.9 32.3 ± 2.6 27.3 ± 3.1 20.7 ± 2.9 DNA-beschadiging (%) 1 28,7 ± 3.1 28.3 ± 3.4 28.1 ± 2.6 30.7 ± 3.5 2 27.3 ± 3.2 28.0 ± 2.8 28.3 ± 2.6 30.4 ± 2.7 3 30.1 ± 3.9 33.1 ± 2.8 34,1 ± 1,9 40,0 ± 3,4

Waarden staan voor gemiddelde ± SEM (). . .

Tabel 1

3.2. Cytotoxicity

Percentage levensvatbaarheid was verminderd (tabel 1) in alle behandelingsgroepen met de tijd, maar significante vermindering (met 20%; ) werd geregistreerd bij 200 μg/mL (hoge dosis) na 2 uur na incubatie in vergelijking met controles. Zeer significante () vermindering werd geregistreerd in hoge dosis na 3 uur incubatie en het was verminderd met 31% in vergelijking met de controle.

3.3. Functional Integrity of Sperm Plasma Membrane

Tabel 1 toont de resultaten van de functionele integriteit van spermacellen na 1 uur, 2 uur, en 3 uur incubatie. Significante verminderingen () van de functionele integriteit werden geregistreerd in de middelste dosis met 13.5% na 3 uur en ook in hoge dosering met 26% na 2 uur incubatie in vergelijking met hun controles. Zeer significante () vermindering werd geregistreerd bij hoge dosering (met 35%) na 3 uur incubatie.

3.4. 3.4. Spermacapacitatie

In alle behandelingsgroepen werd een afname van het aantal gepaciteerde spermatozoa waargenomen (tabel 1). Het percentage gecapaciteerde spermatozoa was significant verlaagd bij een dosis van 100 μg/mL met 18% na 3 uur incubatie en bij een hoge dosis met 32%, 36% en 38%, respectievelijk na 1 uur, 2 uur en 3 uur incubatie.

3.5. DNA Damage in Spermatozoa

Percentage van DNA beschadigde spermatozoa aantal werd verhoogd met het verhogen van de dosering en incubatietijd. Maar significante () toename van DNA-beschadiging werd alleen geregistreerd bij hoge dosering (met 33%) na 3 uur incubatie. De resultaten zijn samengevat in tabel 1.

4. Discussie

OP insecticiden worden op grote schaal gebruikt in Sri Lanka met weinig of geen bescherming door de gebruikers en individuen lopen dus een hoog blootstellingsrisico. Bovendien worden deze landbouwers in hun vruchtbare jaren onvermijdelijk gedurende een lange periode blootgesteld. De huidige studie was opgezet om het verband aan te tonen tussen acefaat, een OP met spermakwaliteit, en DNA-beschadiging in sperma gedurende verschillende incubatietijdstippen. Uit de resultaten van de huidige studie bleek dat acefaat de beweeglijkheid, de levensvatbaarheid en de integriteit van het membraan en de capacitatie van sperma aantast en in vitro DNA-beschadiging induceerde. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met gechloreerde koolwaterstoffen, organofosfaten en benzeenmetabolieten. De aanzienlijke vermindering van de beweeglijkheid van sperma die werd waargenomen bij zowel een gemiddelde (100 μg/mL) als een hoge (200 μg/mL) dosis van acefaat zou kunnen leiden tot een aantasting van het bevruchtend vermogen van sperma. Na 3 uur blootstelling aan de hoogste dosis was het percentage beweeglijkheid van de spermatozoa gedaald tot onder de door de WHO aanbevolen waarden. De beweeglijkheid van sperma wordt beschouwd als een van de gevoeligste detectoren voor cytotoxische effecten op sperma en vermindering van het bevruchtend vermogen van sperma. Veranderingen in het mitochondriaal membraanpotentiaal door verschillende bestrijdingsmiddelen kunnen leiden tot een vermindering van de beweeglijkheid van spermacellen. De beweeglijkheid van sperma hangt ook af van de intense transformatie en de energiekosten die via de oxidatieve routes in de mitochondriën worden geproduceerd, en bestrijdingsmiddelen kunnen de oxidatieve routes verstoren, waardoor de beweeglijkheid van sperma vertraagd wordt en uiteindelijk tot celdood leidt. Bovendien kunnen metabolieten van bestrijdingsmiddelen de mitochondriale oxidatieve reacties verstoren, wat kan leiden tot de productie van overtollige reactieve zuurstofspecies (ROS), waardoor de productie van ATP afneemt en de beweeglijkheid wordt aangetast. Oxidatieve stress is naar verluidt het belangrijkste mechanisme van organofosfaat-, inclusief acefaat-toxiciteit. Verlies van integriteit kan leiden tot een toename van de membraanpermeabiliteit en verlies van het vermogen om de intracellulaire concentraties van ionen te reguleren die betrokken zijn bij de controle van de spermabeweging. Het totale effect van membraanschade kan verantwoordelijk zijn voor de voortdurende afname van de beweeglijkheid en levensvatbaarheid van sperma na ejaculatie.

De levensvatbaarheid is het percentage levende spermatozoa dat wordt bepaald door de evaluatie van cellulaire en/of membraanintegriteit. De eosinekleuringstest heeft informatie opgeleverd over de structurele integriteit van het spermamembraan, terwijl de HOS-test informatie heeft opgeleverd over de functionele integriteit van het spermamembraan. Levensvatbaarheid van spermatozoa wordt geassocieerd met intacte, functionele en semipermeabele plasmamembranen. Pesticiden kunnen een stijging van calciumionen veroorzaken waardoor schade wordt toegebracht aan de membranen van spermacellen, waardoor de levensvatbaarheid van spermacellen wordt aangetast lang voordat zij de oöcyt bereiken. Veranderingen in het plasmamembraan die in de huidige studie werden waargenomen, zouden kunnen leiden tot een vermindering van de beweeglijkheid, de levensvatbaarheid en de integriteit van het membraan van spermacellen. In de huidige studie werd aangetoond dat hypergeactiveerde spermatozoa afnamen in hoge concentratie en afnamen met toenemende incubatietijd, wat wijst op een verminderde capacitatie van de zaadcellen. Het membraan en de mitochondriën van het sperma zijn essentieel voor de hyperactivering en beschadiging van het membraan en de mitochondriën van het sperma kan leiden tot een vermindering van de capaciteit van het sperma. Van OP is bekend dat het de capacitatie nadelig beïnvloedt door remming van AchE wanneer het met sperma in vitro wordt geïncubeerd. Niettemin, na toevoeging van voldoende hoeveelheden AchE of AchE nabootsenzymen aan het medium, werd het effect omgekeerd , wat wijst op het belang van de activiteit van AchE van het spermamembraan om capacitatie te initiëren.

De huidige studie onthult een aanzienlijke schade aan dubbelstrengs DNA bij de hoogste dosering (200 ug / ml) na 3 uur incubatie. De integriteit van sperma-DNA is van vitaal belang voor de overdracht van genetische informatie tijdens de voortplanting en elke beschadiging van het DNA kan leiden tot onvruchtbaarheid. DNA-basen en fosfodiëster-backbones zijn bijzonder gevoelig voor door oxidatieve stress veroorzaakte schade omdat hun plasmamembranen grote hoeveelheden meervoudig onverzadigde vetzuren bevatten en hun cytoplasma lage concentraties enzymen bevat die ROS opvangen. Daarom kunnen hoge niveaus van ROS leiden tot dubbelstrengs DNA-breuken die vaak worden waargenomen in de spermatozoa van onvruchtbare mannen. Er is vastgesteld dat acefaat de cellulaire reactieve zuurstofspecies (ROS) aanzienlijk verhoogt, hetgeen resulteert in modificaties van DNA door de vorming van basenpaarfouten en strengbreuken . DNA-fragmenten in spermatozoa zijn minder beweeglijk en minder gevoelig voor hypoosmotische zwelling, wat wijst op een lagere functionele integriteit van het spermamembraan, wat leidt tot een vermindering van de spermafunctie bij toenemende DNA-beschadiging. Pesticiden die DNA-beschadiging induceren in leukocyten kunnen ook leiden tot DNA-beschadiging in spermatozoa. Conclusies

De huidige studie is suggestief voor een mogelijke verslechtering van de spermafunctie bij blootstelling aan acefaat. De hoge concentratie van acefaat (200 μg/mL, wat overeenkomt met LD50) die in deze studie werd getest, veranderde de beweeglijkheid, de levensvatbaarheid, de functionele integriteit van het plasmamembraan en de capacitatie van spermacellen en induceerde DNA-beschadiging in vitro. Na beschouwing van de resultaten en de natuurlijke menselijke biologische reacties zoals de afbraak en klaring van chemische stoffen, kan worden aanbevolen dat de geteste hogere dosering (200 μg/mL) en hoger een risico voor de menselijke gezondheid kan veroorzaken.

Afkortingen

BWW:	Biggers Whitten Whittingham
HOS:	Hypoosmotische oplossing
NaCl:	Natriumchloride
OP:	Organofosfaat bestrijdingsmiddel
ROS:	Reactieve zuurstofspecies.

Ethische goedkeuring

Ethische goedkeuring werd verkregen van de ethische toetsingscommissie, Faculteit der Medische Wetenschappen, Universiteit van Sri Jayewardenepura, Nugegoda, Sri Lanka. Ethische goedkeuring nummer is 712/13.

Conflicts of Interest

De auteurs verklaren geen belangenconflicten met betrekking tot de publicatie van dit artikel.

Aankondigingen

Waardevolle hulp verleend door Professor Neelika Malavige, Departement Microbiologie, Faculteit Geneeskunde, Universiteit van Sri Jayewardenepura, voor het verstrekken van kooldioxide incubator en Departement Zoölogie, Faculteit Wetenschappen, Universiteit van Colombo, voor het verstrekken van chemicaliën voor het project wordt zeer op prijs gesteld.