Discovery, activity and characterisation of an AA10 lytic polysaccharide oxygenase from the shipworm symbiont Teredinibacter turnerae

Expression and enzymatic characterization of the AA10 LPMO from T. turnerae

De gamma-proteobacterie T. turnerae is de enige endosymbiont in de kieuwen van scheepswormen die met succes is geïsoleerd, gekweekt en waarvan het genoom in kaart is gebracht. Via geautomatiseerde annotatie en manuele BLAST-zoekopdrachten van het voorspelde proteoom van T. turnerae, identificeerden we één gen (NCBI Reference Sequence: WP_019602454.1) dat codeert voor een AA10 LPMO (hierna TtAA10A). De voorspelde eiwitsequentie bevat een N-terminaal signaalpeptide, het LPMO-domein en een serinerijke linkerregio gevolgd door een koolhydraatbindend module (CBM) 10-domein (Fig. 1a). AA10’s zijn aangetroffen met aangehechte CBM2, CBM3, CBM5, CBM10, CBM12, CBM18 en CBM73 domeinen (Bernard Henrissat persoonlijke mededeling) en staan erom bekend actief te zijn op cellulose of chitine. Van CBM10-domeinen wordt gedacht dat ze cellulose binden en dus cellulose kunnen herkennen zonder dat dit gepaard gaat met een katalytische werking. De aanwezigheid van CBM’s in de domeinstructuur van het TtAA10A-gen verschilt weliswaar van de CBM’s die gewoonlijk aan AA10-eiwitten zijn gehecht, maar geeft aan dat dit eiwit wellicht voornamelijk actief is op polysacchariden op basis van glucose.

Na meerdere pogingen om het gen tot expressie te brengen met verschillende affiniteits- en oplosbaarheidstags en verschillende secretiesignalen, werd uiteindelijk voldoende eiwit voor analyse verkregen door de productie van een C-terminaal strep-tagged LPMO katalytisch domein (van His25 tot Gly228) in E. coli (Fig. 1b). Het gezuiverde gemerkte eiwit werd geladen met een overmaat koper, ontzout door middel van grootte-exclusie chromatografie, geanalyseerd op zuiverheid door middel van SDS-PAGE (Fig. 1c) en op massaspectrometrie gebaseerde eiwit-ID (niet getoond), en gebruikt voor latere experimenten.

Recombinant TtAA10A (katalytische domeinen, 25-228, alleen) vertoont de kenmerken van een correct gevouwen AA10. Thermische verschuivingsanalyse (Thermofluor) van gezuiverd, met koper beladen TtAA10A geeft een smelttemperatuur (Tm) van 50,4 °C aan. Strippen koper met 10 mM EDTA verlaagt de Tm tot 42,5 ° C, wat suggereert een eiwit stabiliserende werking door de metalen cofactor, zoals gerapporteerd in eerdere literatuur voor andere LPMOs (bijvoorbeeld , Fig. 1d). We merkten ook een variabiliteit in eiwitpreparaten op, waarbij sommige preparaten een enkel (actief-centrum) Cu bevatten, terwijl andere twee Cu-atomen bevatten, zoals hieronder beschreven.

Activiteit assays, op zowel enkele en dubbele Cu site monsters, werden uitgevoerd op een reeks van commerciële polysaccharide substraten (Avicel, β-chitine uit inktvis pen, α-chitine uit garnalen schelp, cellohexaose, maïszetmeel, pachyman, beukenhoutxylan, glucomannaan, xyloglucan, korstmosan, galactaan, galactomannaan en mannaan) in aanwezigheid van de reducerende co-factor galluszuur. De monsters werden na 24 uur geanalyseerd met MALDI-TOF MS en de piekmassa’s van de reactieproducten werden vergeleken met eerder gepubliceerde gegevens. Hieruit bleek een gemengd C1-C4-oxidatiepatroon, uitsluitend op cellulose, en afhankelijk van de aanwezigheid van de elektrondonor (fig. 2a, b). Producten werden niet gedetecteerd in een van de negatieve controles (Additional file 1: figuur S1). MALDI-TOF MS-analyse van ruw extract van activiteitstests uitgevoerd met Cu-geladen TtAA10A in aanwezigheid van 10 mM EDTA detecteerde geen vrijkomende producten (gegevens niet weergegeven), wat aangeeft dat, zoals verwacht, koper essentieel is voor de activiteit.

Synergie-experimenten werden uitgevoerd door TtAA10A en commerciële glycosidehydrolasen (GH6 en GH9) in de aanwezigheid van Avicel en galluszuur te laten co-incuberen, en de resulterende mono- en oligosacchariden werden gekwantificeerd met behulp van HPAEC (high-performance anion-exchange chromatography). Terwijl reacties met LPMO of GH alleen verwaarloosbare hoeveelheden vrije suikers vrijmaakten, vertoonden co-incubatiereacties een sterk synergetisch effect, verder versterkt door de aanwezigheid van de elektronendonor (Fig. 2c, d, Additional file 2: Figuur S2). Het is vermeldenswaard dat beide commerciële GHs (GH6 en GH9) getest tijdens deze experimenten behoren tot families die werden geïdentificeerd als een van de meest overvloedige in de spijsvertering proteoom van scheepswormen, versterking van de biologische relevantie van de bovengenoemde activiteit assays in de context van hout vertering in de scheepsworm milieu.

Electron paramagnetic resonance spectroscopy

Onze eerste bewijs dat sommige eiwitpreparaten twee Cu sites bevatte kwam van EPR-analyses. De bevroren oplossing (165 K) X-band CW-EPR spectrum van Cu-verzadigde TtAA10A (Fig. 3) vertoonde twee sets van hyperfijne pieken in het parallelle gebied van het spectrum, wat wijst op de aanwezigheid van twee verschillende koper coördinatie geometrieën, die hetzij uit verschillende coördinatie omgevingen binnen een enkele site (bijvoorbeeld verschillen in protonering staten van liganden) of een afzonderlijke tweede koper-bindende site. Een nauwkeurige simulatie van het parallelle gebied van het spectrum kon worden verkregen met twee verschillende soorten, die elk een andere set spin Hamiltoniaanse parameters opleverden, gz = 2.267 en |Az| = 425 MHz (soort 1), en gz = 2.314 en |Az| = 465 MHz (soort 2), Tabel 1, met een verhouding tussen soort 1 en 2 van ongeveer 3:2. De gz-waarde van species 2 is hoog vergeleken met wat men zou verwachten voor de typische AA10 LPMO kopercoördinatie in de actieve site (spectroscopie van LPMOs recent besproken in Ref. ), op basis waarvan we species 1 toewijzen aan een koper gebonden aan de canonieke histidine brace actieve site. De spin Hamiltonian waarden zijn typisch voor een axiale Cu coördinatie geometrie die een mengsel van N en O-donerende liganden bevat . (Merk op dat soort 2 kan niet van een vrije koper soorten in oplossing als alle kleine molecule soorten worden verwijderd tijdens het eiwit voorbereiding; vandaar dat alle koper signalen in de EPR afkomstig zijn van eiwit-gebonden koper.)

Om te bepalen of de twee signalen afkomstig waren van een enkele koperbindingsplaats met verschillende coördinatiegeometrieën, of van twee verschillende koperbindingsplaatsen, werd een X-band CW-EPR titratie-experiment uitgevoerd. Het eiwit werd voorbehandeld met EDTA (10 x de eiwitconcentratie) om koper te verwijderen en vervolgens van buffer ontdaan om EDTA te verwijderen. Dit kopervrije eiwitmonster werd getest en vertoonde, zoals verwacht, geen koperhoudend signaal. Toevoeging van 0,2 equivalenten koper (ten opzichte van de eiwitconcentratie) toonde een enkel signaal in het parallelle gebied, toegewezen aan het koper(II)-ion binnen de histidine-brace actieve site (species 1). Verdere toevoegingen van koper verhoogde dit histidine brace koper signaal, met gelijktijdige groei van het signaal voor soort 2, al duidelijk na 0,4 equivalenten van koper (Additional file 3: Figuur S3). Deze titratie-experimenten werden uitgevoerd bij een vaste pH en tonen aan dat de twee soorten in het EPR-spectrum van met koper verzadigd TtAA10A twee verschillende Cu-bindingsplaatsen vertegenwoordigen met enigszins verschillende koperbindingsaffiniteiten, waarbij soort 1 de hogere affiniteitsplaats is. Bovendien werd het monster van TtAA10A met 0,4 Cu-equivalenten 48 uur bij 4 °C bewaard en werd het EPR-spectrum opnieuw onderzocht. Dit monster vertoonde geen verschil in de verhouding van de kopersoorten, waaruit blijkt dat de verschillende bindingsplaatsen niet ontstaan zijn door grote verschillen in de kinetiek van de koperbinding.

Opvallend is dat in verschillende preparaten die we produceerden, een monster van TtAA10A werd geïsoleerd dat slechts een enkel kopersignaal in het EPR-spectrum vertoonde. De redenen voor dit verschil in koper stoichiometrie van het geïsoleerde eiwit zijn niet duidelijk, omdat deze monsters klaarblijkelijk werden bereid onder identieke omstandigheden als die waarin TtAA10A met twee verschillende Cu-signalen in het X-band EPR-spectrum werd verkregen (species 1 en species 2). We konden geen verschillen in activiteit detecteren voor deze enkelvoudig met koper bezette preparaten ten opzichte van eerdere monsters, maar we konden wel gebruik maken van deze monsters om zowel X-band als Q-band CW-EPR spectra te meten voor het actieve-centrum-Cu van TtAA10A (Fig. 4) met alleen de histidine-beugel bezet, te beoordelen aan de hand van eerdere spectra. Dit monster stelde ons daarom in staat om een gelijktijdige fit uit te voeren van zowel de X-band als de Q-band spectra om nauwkeuriger spin Hamiltonian parameters te verkrijgen voor het koperion in de histidine brace actieve plaats (species 1). Deze waarden zijn vermeld in tabel 2. Toevoeging van PASC aan TtAA10A veroorzaakte geen verandering in de EPR-spectra (gegevens niet weergegeven).

3D structuur van TtAA10A

Om meer inzicht te krijgen in de moleculaire basis voor de biochemische eigenschappen van TtAA10A, en om deze, potentieel ongebruikelijke, dubbele Cu-structuur te onderzoeken, hebben we de kristalstructuur voor het recombinant tot expressie gebrachte eiwit bepaald tot 1,4 Å resolutie (Additional file 4: Tabel S1). De algemene structuur onthulde een kern immunoglobuline-achtige plooi versierd met lussen en een spiraalvormige bundel zoals typisch waargenomen voor enzymen uit deze familie (Fig. 5). Structuurvergelijkingen met behulp van de DALI-server onthulden inderdaad de nauwste structurele overeenkomsten met Cellvibrio japonicus AA10A (PDB ID 5fjq) en Serratia marcescens CBP21 (PDB ID 2bem) met RMSD’s van 2,4 Å en 2,3 Å over respectievelijk 180 en 170 Cα-posities, wat neerkomt op slechts 30% overeenkomst op het niveau van de sequentie. Gezien de hoge activiteit van TtAA10A op cellulose is het wellicht enigszins verrassend dat de twee structuurmatches die het dichtst bij dit enzym liggen chitine-actieve AA10’s zijn. De op twee na beste structuurmatch was echter de AA10 van Streptomyces coelicolor (ScAA10, PDB ID 4oy7 ), een cellulose-specifieke AA10 met een RMSD van 2,5 Å over 160 Cα-atomen. TtAA10A en ScAA10 delen slechts 26% sequentie-identiteit, hoewel ze actief zijn op hetzelfde substraat, wat nog eens onderstreept hoe moeilijk het is om LPMO-substraatspecificiteit te relateren aan sequentie en algemene structuur alleen (verder besproken in de context van AA9 in Ref. ).

Zoals voor alle tot nu toe bestudeerde LPMO’s (bepaald door hun activiteit), wordt de actieve plaats van TtAA10A gevormd door het “histidine beugel”-motief dat zich in het midden van een bijna vlak oppervlak bevindt (Fig. 5a, b). Een enkel koperion werd op deze plaats gemodelleerd, gecoördineerd in een typische T-vormige geometrie door de amino terminus en de zijketen van His 1 en de imidazool van de zijketen van His 107. In de axiale posities rond het koperion van de actieve plaats heeft TtAA10A Phe 195 en Gly 105. Deze posities worden in andere AA10’s vaak bezet door respectievelijk een fenylalanine/tyrosine en een alanine-zijketen. Dit laatste is betrokken bij het creëren van een sterische omgeving die de vorming van de vervormde coördinatiegeometrie van het actieve gebied bevordert, zoals waargenomen bij chitine-specifieke AA10’s in hun Cu(II)-oxidatietoestand. Hier zorgt de vervanging van Ala door Gly ervoor dat het koper in het actieve gebied een iets meer axiale coördinatiegeometrie aanneemt, die dichter ligt bij die welke typisch is voor AA9s en cellulose-actieve AA10s en consistent is met de spin Hamiltonian parameters van species 1 in onze eerder beschreven EPR analyse, Fig. 4. LPMO-kristalstructuren worden vaak gehinderd door fotoreductie als gevolg van stralingsschade, zodat de rustgeometrie van de actieve site niet direct in kristalstructuren kan worden waargenomen (voorbeelden zijn onder andere ). Analyse van de bol rond het koperion in TtAA10A laat slechts een zwakke dichtheid zien voor een watermolecuul op 2,6 Å van het koper en een sterkere dichtheid voor een tweede watermolecuul op 3,2 Å afstand dat hydrogeen bindt aan Glu 53. Deze watermoleculen zijn te ver van het koper verwijderd om als direct coördinerend te kunnen worden beschouwd. Het lijkt er daarom op dat het koper in dit enzym ook een foto-reductie naar de Cu(I) oxidatietoestand heeft ondergaan.

Onze structuur onthult de positie van de tweede koperbindingsplaats die werd waargenomen in de EPR spectra. Deze plaats bevindt zich op 14,4 Å (Cu…Cu) van het koperion van de histidine-brace in een grote negatief geladen patch op het eiwitoppervlak (Fig. 5a, b; Additional file 5: Figuur S4). Dit tweede koperion wordt direct gecoördineerd door His 165, Glu 5, Asp 101, een watermolecuul en His 207* dat wordt geleverd door de Strep-tag van een aangrenzend molecuul in het kristal. Vanwege de observatie van deze interactie controleerden we de oligomere toestand van het eiwit in oplossing met SEC-MALLS (Additional file 6: figuur S5). Dit bevestigde dat het eiwit monomeer is, wat suggereert dat de koper-His207* interactie een kristal artefact is (hoewel een die kan hint naar potentiële eiwit-eiwit interactie). Niettemin suggereert de structuur, in combinatie met de EPR-gegevens, dat deze tweede plaats in oplossing bezet is, waarbij His 207* waarschijnlijk vervangen is door een watermolecuul. Meervoudige sequentie alignment van de top 500 TtAA10A orthologen geïdentificeerd via BlastP zoekopdrachten toont aan dat, terwijl een zuur residu op positie 5 niet ongewoon is onder AA10s, residuen 101 en 165 grotendeels alleen geconserveerd zijn binnen LPMOs van bacteriën die nauw verwant zijn aan Teredinibacter.

Er is veel discussie geweest over mogelijke posities waarin elektronendonoren, zowel kleine moleculen als eiwitten, zich aan LPMOs kunnen binden om katalyse mogelijk te maken wanneer het enzym aan het vaste substraatoppervlak is gebonden (zie bijvoorbeeld ). Onderzoek van de TtAA10A-structuur op potentiële ladingsoverdrachtroutes met het programma EHPath toont aan dat er een duidelijke en snelle “hole-hopping”-route met een gemiddelde gat-verblijftijd van slechts 20 ms bestaat tussen histidine 1 en tyrosine 3 (10 Å afstand). Tyrosine 3 grenst (5,3 Å) aan de tweede Cu-locatie, waardoor een efficiënt pad voor ladingsoverdracht tussen de twee koperlocaties ontstaat. Daarom hebben we, gezien de mogelijke route van ladingsoverdracht tussen de twee koperplaatsen, onderzocht of de tweede metaalplaats (in ons geval bezet door koper, hoewel we het Cu niet konden verplaatsen met zouten van Fe, Ni, Zn en Mn) een bindingsplaats is voor een eiwitachtige redoxpartner (de binding van een ander eiwit aan deze plaats wordt gesuggereerd door de associatie van het Strep-tag met een naburig molecuul in het kristallijne rooster), en we hebben geprobeerd eiwitten uit het door T. turnerae te halen die een stabiele interactie met TtAA10A zouden kunnen aangaan, met behulp van een affiniteitskolom (StrepTrap HP) waarin TtAA10A geïmmobiliseerd is. Deze experimenten (gegevens niet weergegeven) leidden niet tot de isolatie van kandidaat-activatoren op basis van eiwitten voor TtAA10A, maar het kan niet worden uitgesloten dat een activerend enzym zich in deze regio tijdelijk zou kunnen binden om elektronentransfer naar het LPMO mogelijk te maken en zo de katalyse op gang te brengen. Opgemerkt moet echter worden dat we tijdens de structuurverfijning ook een natriumbindingsplaats op het eiwitoppervlak hebben geïdentificeerd (Additional file 7: figuur S6). Of deze extra bindingsplaatsen een gevolg zijn van de verhoogde lading die dit eiwit kan hebben om stabiel te zijn in het zoute milieu waarin T. turnerae zich bevindt, blijft een open vraag. Niettemin kunnen deze oppervlakte-eigenschappen van TtAA10A van belang zijn voor enzym-ingenieurs als LPMO’s moeten worden gestabiliseerd of aangepast aan specifieke omstandigheden om te worden ingezet in industriële bioreactoren.