Een complexe structuur van arrestine-2 gebonden aan een G eiwit-gekoppelde receptor

Functionele karakterisering en structuurbepaling van Arr2-NTSR1 complex

Interacties van arrestines op niet-zichtbare GPCR is relatief zwak en zeer dynamisch, maar het verkrijgen van een stabiel complex is een essentiële stap voor structurele studies. Daarom voorafgaand aan onze structurele studies, we de interactie van NTSR1 gekarakteriseerd met arrestines door gebruik te maken van de commerciële NanoBiT systeem, dat is een effectieve methode om eiwit-eiwit interacties detecteren.17 NTSR1 bleek te interageren met zowel Arr2 en Arr3, die wordt versterkt door de verhoogde concentraties van peptide agonist, neurotensine (NTS). Arrestine mutanten met drie C-terminale hydrofobe residuen gemuteerd tot alanine (3 A mutanten; I386A, V387A en F388A in Arr2, en I387A, V388A en F389A in Arr3),18,19 die bekend staan als pre-geactiveerde vorm van arrestines, toonden verhoogde bindingsactiviteit met NTSR1 (Fig. 1b).

We testten de arrestine-NTSR1 interactie verder met Tango assay, een cel-gebaseerde assay die bindingsactiviteiten van membraaneiwitten aan oplosbare bindingspartners bepaalt.7,20 Onze Tango assays toonden aan dat de bindingsactiviteit van NTSR1 aan Arr2 werd verhoogd met ongeveer twee tot drie keer, respectievelijk, wanneer peptide agonist NTS of kleine molecule agonist ML314, een bekende positief-allosterische modulator (PAM),21,22 werd toegevoegd. De bindingsactiviteit van Arr2 aan NTSR1 werd ongeveer verviervoudigd wanneer zowel NTS als ML314 werden gebruikt. De binding van NTSR1 aan Arr2 werd verder versterkt door de invoering van 3A mutaties (Fig. 1c).

Op basis van bovenstaande resultaten, voerden we structurele studies met behulp van de 3A mutant van Arr2 in complex met NTSR1 in aanwezigheid van NTS en ML314, maar het complex gedissocieerd in cryo-EM roosters als gevolg van de nadelige effecten geassocieerd met het monster verglazing. Om dit dissociatie probleem te overwinnen, we gefuseerd het wil-type menselijke NTSR1 met de menselijke 3A mutant Arr2 op de C-terminus met een drie aminozuur linker (GSA). Cytochroom b562 RIL domein (BRIL) was ook gefuseerd met de N-terminus van de receptor om het complex expressie te verhogen. Arr2 werd verder gestabiliseerd door fuseren Fab30 lichte keten, een antilichaam fragment gebruikt om de actieve vorm van Arr2 te stabiliseren,23 op de C-terminus met een 12 aminozuur linker (GSAGSAGSAGSA). De constructie van het fusiecomplex werd gecoëxpresseerd met His8-getagde Fab30 zware keten en een GPCR kinase, GRK5, die de receptor fosforyleerde voor een betere arrestine binding. Het complexe eiwit werd gezuiverd met behulp van een nikkel-affiniteitskolom in aanwezigheid van 2 µM NTS en 10 µM ML314, vervolgens geconcentreerd en verder gezuiverd door gelfiltratiechromatografie voor structurele studies (Fig. 1d, e, zie “Materialen en methoden” sectie voor details).

Het gezuiverde BRIL-NTSR1-Arr2-Fab30 complex eiwit vertoonde een relatief hoge smelttemperatuur (Tm) bij 58 ° C bepaald door thermostability shift assay24 (Fig. 1f). Het vertoonde een uniforme verdeling wanneer geïnspecteerd door negatieve kleuring EM (Fig. 1g). Single deeltje cryo-EM gegevens werden verzameld met een FEI Titan Krios microscoop. Een totaal aantal van 17.206 microfoto’s werden opgenomen, en meer dan 5 miljoen complexe deeltjes werden geplukt en gesorteerd voor verdere verwerking van gegevens. 2D classificatie identificeerde meerdere conformaties van complexe deeltjes. Na intensieve 3D-classificatie, 220.464 deeltjes (~ 4,5% van de totale initiële deeltjes) werden geselecteerd voor de structuur reconstructie (Aanvullende informatie, Fig. S1). De dichtheid kaart toonde een gemiddelde resolutie van 4,8 Å bepaald door het criterium van Fourier shell correlatie (FSC) van 0,143, met de kern structuur die bestaat uit Arr2 en Fab variabele regio (Fv) met een resolutie bereik tot 4,5 Å (Fig. 2a en Aanvullende informatie, Figs. S1, S2). Echter, de conformationele heterogeniteit tussen NTSR1 en Arr2 is nog steeds aanwezig, zoals geïllustreerd in de multi-body analyse (Aanvullende informatie, Fig. S3), ook al werd een zeer klein deel van de volledige dataset gebruikt in de uiteindelijke reconstructie.

Ondanks de matige resolutie, de EM kaart maakte het mogelijk duidelijke bepaling van de positie en oriëntatie van NTSR1, Arr2, en Fab30 in het complex assemblage (Fig. 2). Het complexe model werd gebouwd door docking de kristalstructuur van de NTSR1-NTS complex (PDB: 4GRV),14 en de structuur van Arr2 gebonden met gefosforyleerde vasopressine C-terminale peptide (V2Rpp) en Fab30 (PDB: 4JQI) 23 in de dichtheid kaart, gevolgd door handmatige aanpassing van het model, real space verfijning, en iteratieve cycli van Rosetta verfijning en model te herbouwen tegen de EM map.25 Het uiteindelijke complex model bevat NTSR1 residuen van R49 tot T416, waarvan ICL3 (A270 tot P292) en de linker regio tussen helix 8 en de C-terminale staart (P384 tot S404) ontbreken. Het model van Arr2 bevat de residuen T6 tot en met M352 en het model van Fab30 bevat in totaal 409 residuen die zowel de lichte keten als de zware keten van het Fab vormen. De N-terminaal gefuseerde BRIL en de kleine molecule ML314 zijn niet zichtbaar in de dichtheidskaart, en dus niet opgenomen in het complexmodel. De statistieken en de geometrie van het structuurmodel zijn samengevat in Aanvullende informatie, Tabel S1.

De algemene structuur van het Arr2-NTSR1 complex

Het Arr2-NTSR1 complex wordt gevormd door asymmetrische assemblage van de twee componenten waarbij de horizontale as van Arr2 het binnenoppervlak van het celmembraan snijdt onder een hoek van ongeveer 20°, resulterend in de interactie van de hydrofobe C-rand lussen (L191 en M192, en L334 tot en met L338) van het arrestine met het celmembraan (Fig. 2a, b). Dit is consistent met de kristalstructuur van visueel arrestine-rhodopsine complex, die voor het eerst de asymmetrische arrestine-GPCR assemblage toonde en de functie bevestigde van de hydrofobe C-rand lussen van arrestine als een membraananker dat de binding van arrestine aan membraan-geïntegreerde receptor stabiliseert, wat later experimenteel werd bevestigd.7,26,27 De interactie van de hydrofobe C-edge lussen van Arr2 met de celmembraanlaag suggereert dat het lipide bindend vermogen een algemene eigenschap is van de arrestine familieleden.

Ondanks de overeenkomst in de asymmetrische assemblage van het Arr2-NTSR1 complex met dat van het Arr1-rhodopsine complex, is de relatieve oriëntatie van arrestine op de receptor dramatisch verschillend tussen deze twee arrestine-receptor complexen. Superpositie van de receptor TMDs van deze twee complexen laat zien dat de oriëntatie van Arr2 90° om de transmembraanas is gedraaid ten opzichte van die van visueel arrestine (Fig. 2c). In deze nieuwe oriëntatie zijn de posities van ICL3 en zowel TM5 als TM6 van de receptor gericht op het N-terminale domein van Arr2, waardoor het mogelijk wordt voor ICL3 om op de C-terminale staart te lijken voor interactie met het N-domein van Arr2 (Fig. 2b).

Om de conformationele stabiliteit van de complexe assemblage te beoordelen, voerden we zes onafhankelijke, twee microseconden durende all-atom moleculaire dynamische simulaties uit van het Arr2-NTSR1 complex zonder de stabiliserende Fab30. In de loop van de simulatie, de C-rand lus L334 tot en met L338 bleef in associatie met het membraan lipiden en de NTSR1 C-terminale staart bleef in interactie met de N-terminale domein van Arr2 (Supplementary information, Figs. S4 en S5). Echter, de arrestine kernstructuur kan in beperkte mate roteren rond de cryo-EM structuur, en de verlengde vingerlus kan zich losmaken van de NTSR1 TMD kern (Aanvullende informatie, Fig. S5). Deze simulatie gegevens suggereren dat de vinger lus evenals de kern interface tussen Arr2 en de receptor is zeer dynamisch en de montage van Arr2-NTSR1 complex vastgelegd door de cryo-EM structuur is waarschijnlijk een van de vele conformationele toestanden, die consistent is met het feit dat de conformationele heterogeniteit van Arr2-NTSR1 complex montage nog steeds bestaat in de deeltjes van de 3D-klasse gebruikt in de uiteindelijke cryo-EM reconstructie (Supplementary information, Fig. S3).

De Arr2-NTSR1 kern interface

Het Arr2-NTSR1 complex wordt geassembleerd door intermoleculaire interacties die bestaan uit twee gescheiden belangrijke interfaces: een kern interface bestaande uit twee gescheiden patches tussen de centrale kruin lussen van arrestine en de intracellulaire zijde van de receptor TMD, en een staart interface tussen het N-terminale domein van Arr2 en de receptor C-terminale staart (Fig. 2b). Een deel van het kerninterface tussen Arr2 en NTSR1 wordt gevormd door de vingerlus (van E66 tot en met L71) van het arrestine, die in de intracellulaire holte van de receptor TMD wordt gestoken en wordt omgeven door ICL1, ICL2, TM5 en 6, van de receptor (Fig. 3a). In deze configuratie vormt het bovenste oppervlak van de vingerlus een direct raakvlak met de bocht tussen TM7 en helix 8 van de receptor (fig. 3a).

Om de interface van de complexe structuur te valideren, voerden we cel-gebaseerde disulfide crosslinking experimenten uit. In deze experimenten werden plaats-specifieke cysteïneresiduen geïntroduceerd op het grensvlak van Arr2 en NTSR1. Beide eiwitten met cysteïne mutaties werden als afzonderlijke eiwitten in cellen geexpresseerd. De crosslinking producten werden gevormd door cellen te behandelen met oxiderende reagens en werden gecontroleerd door SDS-PAGE gevolgd door western blotting om de Flag tag die was gefuseerd met de C-terminus van Arr2 te detecteren. Dezelfde methode is gebruikt om de visuele arrestine-rhodopsine complex interface te valideren.7,9 Verknopingsreacties van een totaal van 177 residu-paren werden uitgevoerd, waaronder we waargenomen sterke verknoping signalen tussen Arr2 residuen D67 en L68 in het centrale gebied van de vinger lus, met NTSR1 residuen V367 tot en met N370 gelegen in de bocht tussen TM7 en helix 8 (Fig. 3b, en de posities van deze interface residuen worden gepresenteerd als bollen in Fig. 3a). Ter vergelijking, residu L71 aan het C-terminale einde van de vinger lus toonde geen of een zeer zwak verknoping signaal met die NTSR1 residuen (Fig. 3a, b). Verschillende vinger lus residuen bleken ook te verknopen met residuen op ICL1 (Q98) en TM6 (R294 en A297), die componenten zijn van de intracellulaire holte van de receptor TMD (Supplementary information, Fig. S6). Deze crosslinking gegevens valideerden de interface patch tussen Arr2 vinger lus en de receptor en toonden aan dat de arrestine vinger lus dient als een belangrijke component van de kern interface van deze Arr2-GPCR complex.

De aminozuursequenties van Arr2 vinger lus zijn verrijkt met zure residuen, vergelijkbaar met die van visuele arrestine (Fig. 3c), waarvan bekend is dat het zich bindt aan de positief geladen TMD holte.7 Wanneer NTSR1 en rhodopsine over elkaar worden gelegd, neemt de vingerlus van Arr2 dezelfde ruimte in als het corresponderende gebied van visueel arrestine, maar het steekt niet zo diep in de TMD holte als visueel arrestine (Fig. 3d), wat aangeeft dat de associatie van de Arr2 vingerlus met de intracellulaire holte van NTSR1 TMD dynamischer zou kunnen zijn dan die tussen visueel arrestine en rhodopsine.

De andere patch van het kerninterface tussen Arr2 en NTSR1 is de interactie van de kamregio’s van Arr2 met ICL1 en ICL2 van de receptor, die verschilt van die in het visuele arrestine-rhodopsine complex. In tegenstelling tot de vergelijkbare oriëntaties van de vingerlussen van de twee arrestines, liet superpositie van de twee receptoren de kernstructuren van de arrestines achter in twee oriëntaties die verschillen met een hoek van ongeveer 90°, zoals te zien is in Fig. 2c. De verschillende oriëntaties van Arr2 en visuele arrestine kernstructuren in hun GPCR complexen resulteren in verschillende bindingsmodi van de crest regio’s van arrestines met de intracellulaire lussen van de receptoren, met name ICL1 en ICL2, in deze twee arrestine-GPCR complexen (Figs. 2c en 4).

Structurele vergelijking van NTSR1 en rhodopsine laat zien dat zij een geconserveerde TMD-conformatie delen, waarbij hun ICL1 een verlengde lus aanneemt en ICL2 een korte helix vormt in hun respectieve arrestine-gebonden complexen. De ICL2 helix van rhodopsine wordt ingebracht in de spleet die gevormd wordt door de middelste lus, onderste lus en lariat lus van visueel arrestine (MBL spleet genoemd).7 Dezelfde MBL spleet in Arr2 wordt echter bezet door het ICL1 van NTSR1 (Fig. 4a) vanwege de verschillende oriëntatie van het arrestine. Dienovereenkomstig wordt ICL2 van NTSR1 weggedraaid van de MBL spleet te herpositioneren aan de top van de lariat lus (Fig. 4a). Disulfide crosslinking experimenten toonden crosslinking signalen tussen receptor residuen L94 tot en met S96 op ICL1 van NTSR1 en residu G286 op de onderste lus van Arr2, wat consistent is met het raakvlak van ICL1 van NTSR1 met deze kam regio van Arr2 (Fig. 4b).

ICL3 van de receptor, ondanks het feit dat het onzichtbaar is in de dichtheidskaart, vormt waarschijnlijk een interface met het N-domein van β-arrestine op basis van de Arr2-NTSR1 complex conformatie (Fig. 2b). Disulfide verknoping gegevens bleek dat ICL3 residuen Q275, C277, T278 en V279 van NTSR1 verknoopt met residuen T56, T58, V81 en N83 op het bovenoppervlak van de Arr2 N-domein (Fig. 4c en aanvullende informatie, Fig. S6). Deze ICL3 residuen vertoonden ook sterke crosslinking signalen met Arr2 residu K160 (Fig. 4d). Aanvullende disulfide verknoping signalen werden waargenomen tussen de meeste residuen van Q273 tot en met G280 van de NTSR1 ICL3 en residu P14 van Arr2 (Fig. 4d). Deze verknopingsgegevens geven aan dat ICL3 van de receptor dicht bij het N-domein is gepositioneerd en kan interageren met residuen op het N-domein oppervlak van Arr2 (Fig. 4e).

De Arr2-NTSR1 staart interface

Terwijl de Arr2-NTSR1 kern interface zeer dynamisch is, lijkt de staart interface tussen NTSR1 C-terminale staart en de Arr2 N-domein vergelijkbaar met die in het visuele arrestine-rhodopsine complex9 (Fig. 5). We zagen elektronendichtheid op een contour niveau van 0,016 (waarbij de dichtheid van het totale complex structuur kan goed worden weergegeven) van ongeveer tien C-terminale staart residuen van NTSR1 die zich binden aan de eerste β-streng van Arr2 (Fig. 5a). Echter, gedetailleerde informatie over dit gebied van de C-terminale staart, met inbegrip van de specifieke residuen, is moeilijk te identificeren als gevolg van de beperkte resolutie van de dichtheid kaart. Analyses van NTSR1-Arr2-Fab30 fusie-eiwit door massaspectrometrie (Fig. 5b en aanvullende informatie, Fig. S7) bleek dat zeven serine of threonine residuen van S401 tot en met T416 op NTSR1 C-terminale staart werden gefosforyleerd, wat suggereert mogelijke betrokkenheid van deze regio in binding aan het positief geladen oppervlak van het arrestine N-domein. Disulfide crosslinking experimenten toonden aan dat Arr2 residu P14 aan de C-terminale wending van de eerste β-streng sterk crosslinkte met receptor residuen H406 tot en met S410 (Fig. 5d en Supplementary information, Fig. S6), wat aangaf dat receptor residuen C-terminal tot H406 waarschijnlijk de regio zijn die aan arrestine N-domein bindt (Fig. 5c).

Een model voor Arr3-GPCR interactie

Het menselijk genoom bevat twee subtypes van β-arrestine: Arr2 en Arr3, die meer dan 53% sequentie-identiteit delen maar zowel enkele overlappende als enkele divergerende functies hebben. Aangezien Arr3 NTSR1 bindingsaffiniteit vertoonde die vergelijkbaar is met die van Arr2 (Fig. 1b), wilden we testen of de bindingswijze van Arr3 aan NTSR1 geconserveerd is met die van Arr2. Onze disulfide crosslinking experimenten toonden aan dat Arr3 vinger lus residuen E67 tot en met L72 (overeenkomend met E66 tot en met L71 van Arr2) crosslinked met de overeenkomstige set van residuen (A369 en N370) bij de draai tussen TM7 en helix 8 van NTSR1 (Aanvullende informatie, Fig. S8), wat wijst op een geconserveerd vinger lus interface met TM7 en H8 van de receptor tussen deze twee β-arrestines.

Daarnaast toonden disulfide crosslinking gegevens aan dat Arr3 residu P15 (overeenkomend met P14 van Arr2) crosslinkte met residuen N405 tot en met T407 van de receptor C-terminale staart, wat duidt op een vergelijkbaar staartinterface tussen Arr3 en NTSR1 (Supplementary information, Fig. S8). Vergelijkbare verknoping patroon tussen NTSR1 ICL3 residuen en Arr3 N-domein residuen, met inbegrip van P15 op de C-terminus van de eerste β-stand en K161 (overeenkomend met K160 van Arr2) op de lus tussen de top β-strands werden ook waargenomen (Aanvullende informatie, Fig. S8). Samen suggereren deze crosslinking gegevens dat de algehele assemblage van Arr3 met NTSR1 vergelijkbaar is met die van Arr2 met NTSR1 in deze core engaged configuratie.

Een model voor β-arrestine rekrutering door 5-HTR1A en 5-HTR1B

Vele GPCRs, waaronder serotonine-receptoren 5-HTR1A en 5-HTR1B en verschillende dopamine-receptoren, hebben geen of een zeer korte C-terminale staart en er wordt voorgesteld dat ze hun ICL3 gebruiken als een alternatieve interface om β-arrestines te rekruteren.28 5-HTR1A en 1B hebben lange ICL3’s met meerdere fosforyleringsplaatsen voor mogelijke interactie met positief geladen N-domeinen van β-arrestines. Onze biochemische bindingsproeven toonden aan dat beide receptoren zich aan Arr2 en 3 bonden met een activiteit die vergelijkbaar is met die van NTSR1 met Arr2 (Supplementary information, Fig. S9). Echter, wanneer de visuele arrestine-rhodopsine complex structuur werd gebruikt als sjabloon, was het moeilijk om de bindingswijze van het gefosforyleerde ICL3 van 5-HTR1A of 1B aan de positief geladen kloof op het N-domein van β-arrestines te modelleren. Dat komt omdat zowel TM5 en 6 als ICL3 van rhodopsine op de tegenovergestelde plaats staan van het positief geladen oppervlak van het arrestine N-domein in de structuur van het visueel arrestine-rhodopsine complex.

De structuur van het Arr2-NTSR1 complex vertoont echter een andere complexe assemblage met Arr2 90° gedraaid ten opzichte van de positie van visueel arrestine in het arrestine-rhodopsine complex (Fig. 2c). TM5 en TM6 van NTSR1 zijn daarom gepositioneerd boven het voorste oppervlak van het N-domein van Arr2, waardoor ICL3 van de receptor (niet zichtbaar in de structuur) het positief geladen N-domein van Arr2 kan bereiken (Fig. 4e). Onze disulfide crosslinking gegevens leveren het bewijs dat NTSR1 ICL3 kan interageren met de positief geladen kloof van het N-domein van Arr2 en 3 (Fig. 4c-e, Aanvullende informatie, Figs. S6 en S8). Daarom kan de structuur van het Arr2-NTSR1 complex dienen als een geschikt sjabloon om de interface van β-arrestines met 5-HTR1A en 5-HTR1B te modelleren.

Gebruik makend van de Arr2-NTSR1 structuur als sjabloon, en de kristalstructuur van ergotamine-gebonden 5-HTR1B als een eerste model voor 5-HTR1B (PDB: 4IAR),29 hebben we een Arr2-5-HTR1B complex homologie model gegenereerd, waarin de kern interface tussen Arr2 en 5-HTR1B vergelijkbaar is met die van Arr2-NTSR1 complex (Fig. 6a, b). Vervolgens voerden we disulfide crosslinking experimenten uit om de complexe assemblage van Arr2-5-HTR1B te testen die in het homologiemodel wordt getoond (Fig. 6c en Aanvullende informatie, Fig. S10).

Wij hebben crosslinking-signalen waargenomen tussen vingerlusresiduen D67 L68, V70, en L71 van Arr2 en residuen N373, E374 en D375 bij de draai tussen TM7 en helix 8 van 5-HTR1B (Fig. 6c). Residuen D67, L68, V70, en L71 van de vinger-lus crosslinkten met receptor residuen R308 en K311 aan de binnenzijde van TM6 (Supplementary information, Fig. S10). Deze crosslinking gegevens ondersteunden een geconserveerde bindingswijze van de Arr2 vinger lus met de intracellulaire holte van het 5-HTR1B TM domein (Fig. 6a, b). Disulfide crosslinking gegevens toonden ook crosslinking signalen tussen Arr2 residuen R285 en G286 in de arrestine onderste lus met ICL1 residu K79 van 5-HTR1B (Fig. 6c en aanvullende informatie, Fig. S10). Deze specifieke verknoping is alleen consistent met de arrestine oriëntatie in het Arr2-NTSR1 model, maar het is niet compatibel met het visuele arrestine-rhodopsine complex. Samen ondersteunden deze crosslinking gegevens een kerninterface tussen de Arr2 crest regio en de intracellulaire kant van het 5-HTR1B TM-domein, dat geconserveerd is met dat in het Arr2-NTSR1 complex (Fig. 6a-c).

5-HTR1B bevat meerdere serine en threonine residuen in het centrale gebied van zijn lange ICL3 die gefosforyleerd kunnen worden voor binding aan het oppervlak van het positief geladen arrestine N-domein (Fig. 6d). We ontwierpen cysteïne-paar mutaties in het potentiële grensvlak tussen ICL3 van de receptor en het N-domein van Arr2 en ontdekten dat ICL3 residuen T268, S295, L298 en E300 gecrosslinked waren met residuen aan het oppervlak van de bovenste β-sheet, waaronder T56, V81, N83, K147 en K157 van Arr2 (Fig. 6e en Aanvullende informatie, Fig. S10). Residuen S260 en T268 op ICL3 vertoonden crosslinking signalen met residuen K11 op de eerste β-streng en N15 op de draai volgend op de eerste β-streng van Arr2 (Fig. 6e en Supplementary information, Fig. S10). Residu S260 bevindt zich nabij het C-terminale einde van TM5, en zijn verknoping met K11 aan de positief geladen kant van het N-domein van Arr2 is alleen mogelijk in de Arr2-NTSR1 oriëntatie, maar niet in de visuele arrestine-rhodopsine oriëntatie, omdat in de structuur van het visuele arrestine-rhodopsine complex zowel TM5 als 6 van de receptor aan de achterzijde van het positief geladen oppervlak van het arrestine N-domein zijn gepositioneerd.

We observeerden ook een bijna identiek Arr2 crosslinking patroon tussen 5HTR1A en 5-HTR1B. Crosslinking signalen werden waargenomen tussen vingerlus residuen D67, L68, V70 en L71 van Arr2 en residuen N404, K405 en D406 (overeenkomend met N373, E374, en D375 van 5-HTR1B) bij de draai tussen TM7 en helix 8 van 5-HTR1A (Supplementary information, Fig. S11). Residuen D67 en L68 van de vinger-lus waren ook gecrosslinked met receptor residuen R339 en K342 (overeenkomend met R308 en K311 van 5-HTR1B) aan de binnenzijde van TM6 (Supplementary information, Fig. S11). Verder zagen we disulfide crosslinking tussen Arr2 onderste lus residuen R285 en G286 en ICL1 residu L67 van 5-HTR1A (overeenkomend met K79 van 5-HTR1B) (Supplementary information, Fig. S11). Deze crosslinking gegevens ondersteunen een vergelijkbaar kerninterface tussen Arr2 met 5-HTR1A en 5-HTR1B, dat geconserveerd is met dat in het Arr2-NTSR1 complex (Fig. 6a, c).

De ICL3 van 5-HTR1A bevat meer dan 100 aminozuur residuen (233 tot en met 336) met 12 serine of threonine residuen die samen met glutaminezuur of asparaginezuur residuen zes gedeeltelijke fosforylatie codes vormen (Supplementary information, Fig. S12). Wij ontwierpen cysteïne-paar mutaties om het potentiële raakvlak tussen ICL3 van deze receptor en het N-domein van Arr2 in kaart te brengen. Crosslinking data toonden aan dat ICL3 residuen V230, T240, P250, R261, K270 en D285 crosslinkten met V81 en K160 in het Arr2 N-domein (Supplementary information, Fig. S11). Residu P14 van de eerste β-streng van Arr2 crosslinkte sterk met ICL3 residuen N300, P308, P315, P318, P321 en R323 van 5-HTR1A (Supplementary information, Fig. S11).Deze crosslinking gegevens, samen met het homologie model van Arr2-5-HTR1B complex, hebben een algemeen beeld gegeven van hoe 5-HTR1A en 5-HTR1B Arr2 rekruteren.

In dit artikel rapporteren we een structuur van Arr2 in complex met NTSR1, een klasse A GPCR, door cryo-EM analyse van een enkel deeltje. Hoewel de bindingsmodus van het staartinterface tussen de C-terminale staart van de receptor en het positief geladen arrestine N-domein geconserveerd is met die in het visuele arrestine-rhodopsine complex, vertoont deze structuur een andere Arr2 oriëntatie dan die gezien in het visuele arrestine-rhodopsine complex. Homologie-modellering en disulfide crosslinking interface mapping tonen aan dat deze kern-interface geconserveerd is in Arr2 complexen met 5-HTR1A en 1B subfamilie. In deze complex modellen zorgt de oriëntatie van Arr2 ervoor dat ICL3 van de receptor het oppervlak van het Arr2 N-domein kan bereiken, wat de mogelijkheid biedt voor een GPCR die een C-terminale staart mist om zijn ICL3 te gebruiken voor interactie met het arrestine N-domein. Aangezien Arr2 en Arr3 ubiquitair tot expressie gebrachte eiwitpartners zijn voor signaaltransductie van vele niet-visuele GPCRs, hebben onze structurele en biochemische studies van Arr2 interactie met NTSR1 en 5-HTR1 subfamilieleden een alternatief model verschaft voor het begrijpen van de interactie van Arr2 en Arr3 met niet-visuele GPCRs.