Effects of Statins on Angiogenesis and Vasculogenesis | Revista Española de Cardiología
INTRODUCTION
Statines remmen de activiteit van 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase, een enzym dat de mevalonaatsynthese katalyseert, de beperkende stap in de biosynthese van cholesterol.1 De resulterende verlaging van het intracellulaire cholesterol leidt tot een compenserende toename van de cholesterolopname door lage-densiteit-lipoproteïnereceptoren (LDL) en een daling van het plasmacholesterol. De ontdekking van de statines en hun toepassing bij personen met hoge cholesterolconcentraties heeft het mogelijk gemaakt de primaire en secundaire preventie van coronaire hartziekten sterk te verbeteren.2,3 Recentelijk is de effectiviteit van de statines bij de primaire en secundaire preventie van coronaire hartziekten ook waargenomen bij personen met lagere cholesterolgehalten.4-6 Naast de verlaging van LDL-cholesterol (C-LDL) hebben de statines een reeks pleiotrope effecten op verschillende componenten van atherosclerose, waaronder endotheelfunctie, celmigratie, ontsteking en de trombotische neiging van de plaque.7-12 Bij normocholesterolemische dieren is aangetoond dat statines een beschermend effect hebben tegen ischemie-reperfusieletsels van de hartspier, waarschijnlijk door mechanismen die verband houden met de productie van stikstofmonoxide (NO) door het endotheel.13
Het serine/threonine eiwit kinase Akt of eiwit kinase B (PKB) is een multifunctionele intracellulaire regulator van cellulaire overleving, groei en metabolisme 14 (figuur 1). In verband met zijn cardiovasculaire functies werkt Akt/PKB op de intracellulaire route die wordt gestimuleerd door vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF)14,15 en angiopoietine,16-18 die celoverleving bevordert en zorgt voor een adequate vasculaire ontwikkeling.19 Constitutieve activering van Akt-signalering beschermt cardiomyocyten tegen apoptose bij ischemie-reperfusieletsels.20 Naast zijn cytoprotectieve effect werkt Akt als een activator van de NO-productie door het endotheel in reactie op VEGF en schuifspanning door zijn vermogen om het endotheliale stikstofoxidesynthase (eNOS) te fosforyleren in serines 1179 of 1177,21,22 waardoor het de vasomotorische tonus controleert.23 Anderzijds is Akt essentieel in de migratie van endotheelcellen naar het VEGF-producerende brandpunt.24 Daarom suggereert het vermogen van Akt om celoverleving, NO-productie en VEGF-geïnduceerde migratie te mediëren, dat het eiwit kinase Akt de endotheelrespons op angiogene stimuli kan mediëren.
Fig. 1. Statines, Akt signalering en angiogenese/vasculogenese. Angiopoëtine 1 (Ang-1), VEGF en fibroblast groeifactor (FGF), wanneer gebonden aan hun membraanreceptoren, induceren de omzetting van fosfatidylinositol 4,5-bifosfaat (PIP2) naar fosfatidylinositol 3,4,5-trifosfaat (PIP3) door fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K). De vorming van PIP3 is noodzakelijk voor de fosforylering van Akt proteïnekinase door PDK-1 kinase. Behandeling met statines verhoogt de fosforylering van Akt, terwijl wortmanine (een PI3K-remmer) dit verhindert. Mevalonaat, het product van HMG-CoA reductase, remt ook PI3K en de daaropvolgende fosforylering van Akt. Daarom verhogen de statines, door het remmen van HMG-CoA reductase en de productie van mevalonaat, de fosforylering van Akt en tegelijkertijd de fosforylering en activering van endotheliaal stikstofoxide synthase (eNOS), de synthese van stikstofoxide (NO), en een verscheidenheid van fysiologische effecten die worden geïnduceerd in angiogenese en vasculogenese. Akt voorkomt ook apoptose van endotheelcellen.
Het is onlangs aangetoond dat de statines ook de intracellulaire signaalroute van proteïnekinase Akt/PKB25-27 in endotheelcellen25 en de endotheelprogenitorcellen (EPC) van het beenmerg,26,27 stimuleren en zo zowel angiogenese25 als vasculogenese induceren.26 De effecten van de statines op de kinetiek van EPC zijn ook bij mensen aangetoond door Vasa et al.28 In dit artikel wordt het effect van statines op de inductie van angiogenese25 en vasculogenese26 besproken via mechanismen die verband houden met Akt activering.25-27
ANGIOGENESIS EN VASCULOGENESIS
Angiogenese en vasculogenese zijn verantwoordelijk voor de ontwikkeling van het vasculaire systeem in het embryo.29-32 Vasculogenese is het proces van bloedvatvorming uit endotheliale progenitorcellen (angioblasten) die migreren en fuseren met andere endotheliale progenitorcellen en differentiëren tot endotheliale cellen terwijl ze nieuwe bloedvaten vormen. Angiogenese daarentegen is het proces van de uitbreiding van de gevormde bloedvaten door de ontluiking van nieuwe haarvaten door de migratie en proliferatie van eerder gedifferentieerde endotheelcellen (figuur 2).
Fig. 2. Schematische voorstelling van angiogenese en vasculogenese. (A) Vasculogenese is de aggregatie van angioblasten of endotheliale progenitorcellen om bloedvaten te vormen. Angioblasten smelten samen in situ of migreren om bloedvaten te vormen op afgelegen plaatsen. (B) Angiogenese is de vorming van nieuwe bloedvaten uit reeds bestaande vaten door de proliferatie en migratie van gedifferentieerde endotheelcellen. (C) Angiogenese en vasculogenese kunnen ook gelijktijdig optreden. (Overgenomen van Cleaver et al.29)
Op het eerste gezicht werd gedacht dat het vasculogene proces beperkt was tot de embryonale ontwikkeling, terwijl angiogenese (dat ook in het embryo optreedt) het enige proces was dat betrokken was bij neovascularisatie bij volwassenen. Onlangs werd het paradigma van postnatale neovascularisatie echter herzien en werd ontdekt dat endotheliale progenitorcellen die in het perifere bloed circuleren,33 worden geïncorporeerd door neovascularisatiehaarden in volwassen dieren,34 in aantal toenemen als reactie op weefselischemie,35 en dat zij de ontwikkeling van collaterale bloedvaten bevorderen na hun expansie in vitro en latere transplantatie.36 Deze studies hebben aangetoond dat zowel angiogenese als vasculogenese verantwoordelijk zijn voor neovascularisatie bij volwassenen.
Een derde mechanisme dat waarschijnlijk bijdraagt tot de ontwikkeling van collaterale vaten is de toename van de grootte en het kaliber van reeds bestaande arteriolaire collaterale verbindingen, een proces dat arteriogenese wordt genoemd.37 De aanwezigheid en het aantal van deze inheemse collaterale vaten varieert sterk tussen individuen en soorten. Wanneer een vat afgesloten raakt, is er een toename van de snelheid van de bloedstroom door reeds bestaande collaterale vaten en een toename van de luminale schuifspanning, factoren die bijdragen tot de rijping van de collaterale vaten, vooral die van gemiddelde grootte.
Methodes van studie in vitro
De ontwikkeling van technieken voor de kweek van endotheelcellen heeft het mogelijk gemaakt om de processen die betrokken zijn bij angiogenese te begrijpen.38 Endotheelcellen in kweek behouden de capaciteit om te reageren op factoren die angiogenese stimuleren of remmen, alsook de capaciteit om in vitro endotheelbuisjes te vormen. Met behulp van tests van de celproliferatie kan het effect van een bepaalde stof op de endotheelcelproliferatie worden geanalyseerd. De migratie van endotheelcellen naar een oplossing die een bepaalde stof bevat, gescheiden door een permeabel membraan, kan worden onderzocht in een Boyden-kamer. De mechanismen van tubulaire endotheelvorming en het effect van een bepaalde stof op tubuli kunnen worden bestudeerd met behulp van tweedimensionale of driedimensionale assays. Met deze technieken worden de processen van vorming van het endotheliale lumen en de invloed van de extracellulaire matrix op de capillaire ontwikkeling geanalyseerd.38 Tenslotte maken culturen van endotheelcellen de studie mogelijk van de moleculaire pathways die betrokken zijn bij angiogeneseprocessen.
Recentelijk zijn, door gebruik te maken van celselectietechnieken en speciale kweekmedia, technieken die ontwikkeld zijn om gedifferentieerde endotheelcellen te bestuderen, gebruikt om endotheliale progenitorcellen te bestuderen.33-36
Methoden van studie in vivo
Hoewel met technieken in vitro een voorlopige analyse van angiogenese en vasculogenese kan worden gemaakt, zijn er vele factoren die deze processen in vivo kunnen beïnvloeden of moduleren.38 Om de mechanismen van bloedvatvorming in vivo te bestuderen, zijn verschillende biologische systemen ontwikkeld om het effect van een bepaalde stof te kwantificeren of aan te tonen: modellen van hoornvliezen van muizen, chorioalantoïdemembraan van kippenembryo’s, of spongieuze implantaten.38 Deze systemen vereisen het opofferen van het dier, zodat zij alleen het effect op een specifiek moment vastleggen. Om de temporele evolutie van gebeurtenissen in één enkel weefsel te bestuderen, zijn intravitale microscopietechnieken ontwikkeld voor de huid op de rug of de schedel van de muis.39 Tenslotte heeft de ontwikkeling van de technieken van genetische manipulatie het mogelijk gemaakt het effect te bestuderen van de onderdrukking (knock-out) of toevoeging (knock-in) van een gen aan de processen van vasculogenese en angiogenese.
De studie van postnatale vasculogenese en het effect van bepaalde stoffen op vasculogenese processen is mogelijk geworden dankzij het gebruik van een flow-cytometrie technieken, fluorescentie-geactiveerde cell sorting (FACS), speciale technieken voor het kweken van endotheliale progenitorcellen (EPC) uit perifeer bloed, en murine beenmerg transplantatie modellen.33-36 FACS wordt gebruikt om EPC in perifeer bloed op te sporen en te kwantificeren met behulp van antilichamen tegen de oppervlakteantigenen van deze cellen. De invloed van geneesmiddelen of groeifactoren op het aantal van deze cellen in het perifere bloed kan op deze manier worden geanalyseerd. De speciale technieken voor celselectie en -kweek die door onze groep zijn ontwikkeld, hebben het ook mogelijk gemaakt EPC op te sporen en te kwantificeren. In het muriene model van beenmergtransplantatie worden beenmergcellen van een muizendonor getransplanteerd in een muizenreceptor met een gen dat codeert voor de uitwerking van een stof waarmee deze later kan worden opgespoord (figuur 3). In ons geval codeerde het gen voor de uitwerking van bèta-galactosidase door endotheelcellen. Selectieve expressie wordt bereikt omdat dit gen wordt gereguleerd door een specifieke endotheelcelpromotor, Tie-2, in de muizendonor. Daarom zullen alleen endotheelcellen uit het beenmerg van de dierlijke donor het bèta-galactosidase tot expressie brengen dat in de dierlijke receptor kan worden opgespoord. Als de hierboven beschreven biologische experimenten worden uitgevoerd na beenmergtransplantatie in de dierlijke receptor, kunnen we de invloed van een bepaalde stof op de vasculogenese analyseren door het aantal endotheelprogenitorcellen afkomstig uit het beenmerg te kwantificeren.
Fig. 3. Muismodel van beenmergtransplantatie voor de studie van vasculogenese. De gebruikte beenmergdonoren zijn transgene muizen die constitutief het gen LacZ tot expressie brengen (dat codeert voor beta-galactosidase), gereguleerd door een specifieke endotheelpromotor, Tie-2. Het beenmerg wordt geëxtraheerd en getransplanteerd in een muizenreceptor waarvan het beenmerg sublethaal bestraald is. Na een periode van 4 weken om de reconstitutie van het getransplanteerde beenmerg tot stand te brengen, worden in de muizenreceptor één of meer ingrepen verricht (het getoonde geval is een hoornvliesmodel) om de neovascularisatie te stimuleren. Na deze ingrepen worden de dieren opgeofferd en wordt een histologisch onderzoek verricht om de expressie van betagalactosidase op te sporen. Met X-GAL-kleuring krijgen cellen die bèta-galactosidase tot expressie brengen een blauwachtige kleur. Door het gebruik van een specifieke promotor voor endotheelcellen kunnen de blauwe cellen die in neovascularisatiehaarden zijn opgenomen, worden geïdentificeerd als cellen van endotheelafkomst.
EFFECT VAN STATINS OP DE INDUCTIE VAN ANGIOGENESIS EN VASCULOGENESIS
Onderzoek in ons laboratorium en elders heeft aangetoond dat de statines de intracellulaire signaalroute van het proteïnekinase Akt/PKB,25-27 stimuleren, die zowel angiogenese25 als vasculogenese bevordert.26 Bovendien hebben Vasa et al. ook bij mensen de effecten van statines op de kinetiek van EPC kunnen aantonen.28
Effecten in vitro van statines
De statines activeren snel het proteïnekinase Akt/PKB in endotheelcellen25 en EPC,26,27 waardoor de fosforylering van eNOS en de daaropvolgende productie van NO toeneemt. Activering van Akt door statines bevordert de proliferatie, migratie en cellulaire overleving van endotheelcellen en EPC, alsmede de vorming van de vasculaire structuur. Bovendien leidt de remming van Akt door het gebruik van adenovirus dat codeert voor dominant negatieve vormen van Akt tot remming van de door statines geïnduceerde effecten. Het potentieel van statines in weefselregeneratieprocessen werd eerder aangetoond in osteoblasten. In deze cellen verhoogden statines de proliferatie en het activiteitsniveau, waardoor de botvorming toenam.40
Hoewel de mechanismen van Akt activering door statines niet nauwkeurig bekend zijn, is het waarschijnlijk dat fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) signalering betrokken is omdat dit proces geblokkeerd wordt door wortmanine en LY294002, twee remmers van het enzym (figuur 1). Bovendien is remming van HMG-CoA-reductase noodzakelijk, want de activering van Akt door simvastatine werd geremd door toevoeging van mevalonaat aan de incubatie (figuur 1). Mevalonaat is niet alleen noodzakelijk voor de biosynthese van cholesterol, maar ook voor de produktie van ubiquinon, dolicholen en isoprenoïden, die essentieel zijn in verschillende celprocessen. Hoewel de statines het boodschapper-RNA (mRNA) van eNOS stabiliseren door de synthese van isoprenoïden te wijzigen,41 hebben wij geen veranderingen waargenomen in de waarden van het eiwitsynthase eNOS. In deze zin is het belangrijk te benadrukken dat de toename van de mRNA-concentratie later was (24 uur) dan de activering van eNOS-fosforylering door Akt (15 minuten). Deze kortere activeringstijd is in overeenstemming met de door statines geïnduceerde veranderingen in de produktie van NO en in de ex vivo in aorta annuli waargenomen vasodilatatie.42
Effecten in vivo van statines
De statines en de activering van de intracellulaire Akt signalering bevorderen de angiogenese in modellen van perifere ischemie ontwikkeld bij normocholesterolemische konijnen.25 Bij dieren die statines kregen, werden hogere perfusiedrukken, een groter aantal collaterale vaten, en een grotere capillaire dichtheid waargenomen (figuur 4). Anderzijds verhogen de statines het aantal endotheliale progenitorcellen in het perifere bloed bij zowel muizen26,27 als mensen.28 Bovendien verhogen de statines de neovascularisatie van het hoornvlies bij normocholesterolemische muizen, gedeeltelijk als gevolg van vasculogenese uit EPC verkregen uit het beenmerg (Figuren 3 en 5).26 Met behulp van het muismodel van beenmergtransplantatie was het mogelijk om een groter aantal EPC uit het beenmerg aan te tonen in de hoornvliezen van muizen die met statines werden behandeld. Daarom hebben statines een belangrijk effect op de EPC-kinetiek, zoals eerder is aangetoond met VEGF of granulocyten- en monocyten-koloniestimulerende factor (GM-CSF),35 en door statine geïnduceerde mobilisatie van deze cellen zou de postnatale neovascularisatie kunnen toenemen.
Fig. 4. Statine-geïnduceerde toename van neovascularisatie in het been van een konijn als reactie op een unilaterale resectie van de liesslagader. a) De liesslagader en zijn takken worden ontleed. De genetische overdracht naar endotheel wordt gemaakt door infusie van adenovirus dat codeert voor beta-galactosidase (Ad-βgal) of Akt (Ad-myrAkt) in de distale femorale slagader en incubatie gedurende 15 min terwijl de femorale ader tijdelijk wordt afgeklemd. b) Op de derde dag wordt de gastrocnemiusspier geëxtraheerd en wordt de X-GAL-kleuring uitgevoerd om de transgene distributie te bepalen in histologische preparaten gekleurd met hematoxyline-eosine. c) Angiografie via de interne iliacale wordt uitgevoerd om de vorming van collaterale vaten in verschillende behandelingsgroepen te analyseren. In angiografieën gemaakt na 40 dagen, is een toename in de vorming van collaterale vaten zichtbaar in de dieren die 0,1 mg/kg simvastatine kregen door intraperitoneale injectie, vergeleken met de dieren die wel werden ingegrepen maar alleen een zoutoplossing kregen ingespoten. Kwantitatieve analyse van de collaterale vaten werd gemaakt in de controlegroep, de met simvastatine behandelde groep, en de groep dieren die een intramusculaire injectie van Ad-VEGF kregen. De angiografische score werd geanalyseerd in de experimentele groepen die een infusie kregen van zoutoplossing, Ad-βgal en Ad-myrAkt 31 dagen na de operatie. d) Kleuring voor alkalische fosfatase in de adductor spier van het ischemische been toonde een grotere capillaire dichtheid in de groep dieren die behandeld werd met simvastatine ten opzichte van de groep controle 40 dagen na de operatie. De gegevens van elk experiment worden gepresenteerd als gemiddelde±SD (n=6 konijnen in elk van de behandelingsgroepen, *P25)
Fig. 5. Toename van corneale neovascularisatie door statine-geïnduceerde vasculogenese. a) Representatieve foto’s tonen corneale neovascularisatie (links, voertuig; rechts, simvastatine). b) X-gal kleuring van hele cornea’s. De blauwachtige punten zijn cellen die beta-galactosidase tot expressie brengen (links, voertuig; rechts, simvastatine). c) Representatieve microfoto’s van de histochemische studie van fluorescentie in paraffine-embedded hoornvliezen van Tie2/LacZ/BMT muizen (links, voertuig; rechts, simvastatine). De aanwezigheid van dubbel positieve cellen bewijst dat uit beenmerg verkregen endotheelprogenitorcellen (EPC) zijn opgenomen door de neovascularisatiehaarden (vasculogenese). De rode kleur duidt in dit geval op beta-galactosidase en de groene kleur op de specifieke endotheliale merker isolectine B4. De dubbel positieve cellen (gele kleur) zijn EPC verkregen uit beenmerg die zijn opgenomen door de nieuwe vaten. d) Representatieve microfoto’s van de histochemische studie van fluorescentie in hele hoornvliezen van Tie2/LacZ/BMT muizen (links, voertuig; rechts, simvastatine). De rode kleur toont beta-galactosidase en de groene kleur toont de specifieke endotheliale merker lectine BS-1. e) Kwantificering van de EPC afkomstig van transplantatie geïncorporeerd in de neovasculatuur. Uitgedrukt als de verhouding tussen het aantal EPC en het totale aantal endotheelcellen die de nieuwe vaten vormen. *P26)
CONCLUSIES
Statines bevorderen de proliferatie, migratie en cellulaire overleving van endotheelcellen en EPC verkregen uit beenmerg door mechanismen die verband houden met de activering van serine/threonine proteïnekinase Akt of PKB. Op een vergelijkbare manier als VEGF bevorderen statines de angiogenese en vasculogenese. Daarom kan Akt activering verantwoordelijk zijn voor sommige van de gunstige effecten van statines, waaronder postnatale neovascularisatie.