Elevated Alkaline Phosphatase in a Cancer Patient: Think You Know the Source?

Casuspresentatie

Een 45-jarige man met recidiverend gemetastaseerd Ewing sarcoom meldde zich bij het Memorial Sloan Kettering Cancer Center voor mogelijke deelname aan een klinisch onderzoek. De eerste laboratoriumresultaten waren opmerkelijk voor verhoogde alkalische fosfatase niveaus en γ-glutamyl transferase niveaus, maar waren verder onopvallend, inclusief normale niveaus van aspartaat aminotransferase (AST) en alanine transaminase (ALT). Verhogingen van de ALP- en GGT-spiegels deden vermoeden dat er sprake was van een leveraandoening, hoewel de patiënt geen voorgeschiedenis van leverafwijkingen had. Gezien de voorgeschiedenis van de patiënt van metastatische botziekte, werd vermoed dat de waargenomen verhoging van het ALP te wijten was aan een verhoogd bot-ALP-isoenzym. Het was echter belangrijk om de oorsprong van het verhoogde ALP te documenteren, omdat de patiënt zou worden opgenomen in een onderzoek dat de dosering en de bijwerkingen van het geneesmiddel zou bepalen. Stijgingen van het ALP in de loop van het onderzoek die te wijten waren aan leverspecifieke isoenzymen zouden worden gerapporteerd als een dosisbeperkende toxiciteit en zouden de behandeling kunnen vertragen of de patiënt mogelijk uitsluiten van het klinisch onderzoek. Omgekeerd zouden stijgingen in ALP afkomstig van botten en secundair aan ziekte niet als toxiciteit worden gerapporteerd.

Het laboratorium werd geraadpleegd over testmogelijkheden om het (de) specifieke isoenzym(en) te identificeren die verantwoordelijk waren voor het verhoogde ALP van deze patiënt. Daartoe werd een botspecifieke chemiluminescentie-immunoassay voor ALP (Beckman Access Ostase) uitgevoerd. Het resultaat van deze test was 68,5 μg/L (referentie-interval: 0,0-20,1 μg/L), wat een significante verhoging van het bot-ALP betekent. Om de mogelijke bijdrage van andere ALP-isoenzymen te onderzoeken, werd elektroforese uitgevoerd in een referentielaboratorium. Deze methode maakt gebruik van elektroforese om ALP-isoenzymen te scheiden, gevolgd door densitometrie voor kwantificering. Vergelijkbaar met de resultaten verkregen in het MSKCC, was de totale ALP-spiegel van de patiënt verhoogd tot 524 U/L (referentie-interval: 45-115 U/L). Interessant is dat het bot ALP niveau abnormaal laag was met 7,8% (referentie-interval: 19,1-67,7%) van het totale ALP niveau, terwijl het lever ALP niveau verhoogd was en goed was voor 92,2% van het totale ALP niveau. Noch placentale isoenzymen, noch intestinale isoenzymen werden gedetecteerd. In het licht van deze resultaten startte het klinische zorgteam een work-up voor mogelijke hepatobiliaire aandoeningen terwijl het laboratorium de afwijkende resultaten verder onderzocht.

Een alternatieve methode waarbij een combinatie van enzymactiviteit en hitte-inactivatie werd gebruikt, werd in een referentielaboratorium uitgevoerd. De resultaten van deze assay waren ook verhoogd voor zowel lever (359 U/L; referentie-interval: 0-94 U/L) als bot (101 U/L; referentie-interval: 0-55 U/L) isoenzymen. Beeldvormingsonderzoek werd uitgevoerd en toonde de aanwezigheid aan van congestieve hepatopathie als gevolg van een perfusie-afwijking secundair aan hepatische veneuze congestie. Deze aandoening presenteert zich typisch met verhoogde ALP- en GGT-spiegels met normale AST- en ALT-spiegels. Een MRI bevestigde progressie van de ziekte in de rechter humerus en nieuwe metastatische laesies in het scapulier lichaam. De beeldvormingsstudies bevestigden de aanwezigheid van leverdisfunctie en progressieve botziekte, die beide kunnen leiden tot verhoogde lever ALP en bot ALP spiegels. Vanwege deze complicaties werd de patiënt uitgesloten van de klinische proef.

Discussie

ALP is een hydrolase-enzym dat verantwoordelijk is voor de defosforylering van vele soorten moleculen, waaronder eiwitten en nucleotiden. Er zijn 4 primaire isoenzymen van ALP, waaronder bot, lever, intestinaal, en placentaal. Ongeveer 95% van de totale ALP activiteit in menselijk serum is afkomstig van bot en lever bronnen die in een verhouding van ongeveer 1:1 voorkomen in gezonde volwassenen (1). Bij volwassenen kunnen verhogingen van het ALP-niveau worden waargenomen bij talrijke aandoeningen, waaronder zwangerschap, congestief hartfalen, colitis ulcerosa en bacteriële infecties. Een verhoogd ALP-niveau in de lever wordt het vaakst waargenomen bij hepatobiliaire aandoeningen, met name cholestase, terwijl een verhoogd ALP-niveau in de botten wordt aangetroffen bij pathologieën met een verhoogde activiteit van de osteoblasten, zoals de ziekte van Paget of bepaalde kankers die ofwel hun oorsprong vinden in de botten ofwel zich naar de botten hebben verspreid (2). Omdat ALP uit verschillende bronnen afkomstig kan zijn en als gevolg van een verscheidenheid van aandoeningen verhoogd kan zijn, is het vaak noodzakelijk om op ALP-isoenzymen te testen om de oorsprong te bepalen.

Er zijn 3 primaire methoden beschikbaar om ALP-isoenzymen te evalueren. Elektroforese is 1 methode, waarbij ALP-isoenzymen worden gescheiden op basis van verschillen in lading. Omdat de mobiliteit van lever- en botisoenzymen echter vrijwel gelijk is, is een extra stap nodig. Tarwekiem lectine (tarwekiem agglutine: WGA) wordt toegevoegd om de verschillen in sialatie tussen lever- en botisoenzymen te benutten. Het botisoenzym is doorgaans rijk aan siaalzuur en zal met WGA in de agarosegel reageren en neerslaan. Na scheiding worden de isoenzymen op een densitometer afgelezen voor kwantificering en uitgedrukt in percentages van het totale ALP (3). De tweede methode maakt gebruik van de verschillen in hittestabiliteit tussen de isoenzymen. Bij deze methode wordt de totale ALP-activiteit van het monster direct en na verhitting gemeten. Bot-ALP is hittestabiel; daarom zullen metingen die na verhitting worden verricht, geen bot-ALP-activiteit te zien geven. Lever ALP is hittestabiel en zal in beide metingen actief zijn. Het bot-ALP kan dan worden bepaald door de twee metingen van elkaar af te trekken (4). De derde methode is een immunoassay die uitsluitend wordt gebruikt om het bot ALP te kwantificeren (5). Er zijn verschillende immunoassaykits voor bot ALP in de handel verkrijgbaar, maar in dit onderzoek is de Beckman Access Ostase-assay gebruikt. Deze methode is een 1-staps immunoenzymatische assay. In het kort wordt een muismonoklonaal antilichaam dat specifiek is voor bot-ALP toegevoegd aan paramagnetische deeltjes die gecoat zijn met een geit-antimuis polyklonaal antilichaam. Patiëntenserum wordt vervolgens aan de gecoate deeltjes toegevoegd, en eventueel aanwezig bot-ALP zal zich binden aan het monoklonale antilichaam tegen bot-ALP. Een chemiluminescent substraat wordt toegevoegd en het licht dat door de reactie wordt opgewekt, is recht evenredig met de concentratie van bot-ALP in het monster.

In dit geval werden, gezien de voorgeschiedenis van Ewing-sarcoom van de patiënt en het ontbreken van symptomen of een voorgeschiedenis van leverdisfunctie, eerst de verhogingen in bot-ALP-niveaus onderzocht. Het bot ALP was verhoogd; vanwege een verschil in eenheden tussen de immunoassay voor bot ALP en de enzymatische assay voor totaal ALP (immunoassay meet hoeveelheid in microgram per liter versus enzymatische assay meet activiteit in eenheden per liter), kunnen de resultaten echter niet door elkaar worden gebruikt en moeten ze op de juiste manier worden geïnterpreteerd. De waargenomen stijging van het bot-ALP leverde het bewijs dat de totale ALP-verhoging ten minste gedeeltelijk van bot afkomstig was, maar het was niet mogelijk om het bot-ALP definitief als de enige bijdrage te identificeren. Latere tests met elektroforese en hittestabiliteit om de verhoging van andere ALP-isoenzymen vast te stellen, brachten een verhoging van het lever ALP-niveau aan het licht, maar deze toonden ook een verschil aan in het bot ALP-niveau. Beeldvormingsonderzoek toonde een onderliggende pathologie aan voor zowel de verhoogde lever- als botisoenzymen. Derhalve werd geconcludeerd dat de discrepante resultaten het gevolg waren van een verlaagd bot ALP, bepaald met de elektroforese-methode.

Het vermogen van de elektroforetische methode om het bot ALP te onderscheiden van het lever ALP is gebaseerd op de vooronderstelling dat het in serum aanwezige bot ALP rijk is aan siaalzuur. In serum zijn er 3 primaire bot ALP isovormen, namelijk, B1, B2, en B/I (6). Interessant is dat is aangetoond dat deze isovormen verschillen in het aantal aanwezige siaalzuurresiduen. In een eerdere studie werd het aantal siaalzuurresiduen geschat op 29 en 45 voor respectievelijk elk B1- en B2-homodimeer. B/I bestaat uit 70% bot en 30% intestinaal isoenzym en heeft zeer weinig siaalzuurresiduen (7). De verschillende isovormen neerslaan in verschillende mate in aanwezigheid van WGA op basis van het aantal aanwezige siaalzuurresiduen, waarbij B2 de hoogste mate van neerslag vertoont, gevolgd door B1 en B/I. Evenzo toonde een studie van Farley et al. aan dat hitte-inactivatie en immunoassay superieur waren aan WGA-precipitatie assay voor het detecteren van bot ALP in het serum van postmenopauzale osteoporotische personen (8). Het is aannemelijk dat de isovorm aanwezig bij deze patiënt minder siaalzuurresiduen had, wat het afwijkende normale bot ALP resultaat bij gebruik van de elektroforetische methode zou kunnen verklaren. Het is interessant op te merken dat de 3 ALP-isovormen een vergelijkbare warmte-inactiveringskinetiek vertoonden (7).

In dit geval werden 3 verschillende methoden gebruikt om de bron van het verhoogde ALP vast te stellen bij een patiënt met metastatische botziekte en zonder voorgeschiedenis van leverdysfunctie. De juiste interpretatie van het initiële bot ALP resultaat door immunoassay was instrumenteel in de daaropvolgende diagnose en behandeling van een voorheen niet gediagnosticeerde leveraandoening. Dit onderzoek benadrukt het belang van het begrijpen van de specifieke methodologieën en beperkingen achter verschillende ALP assays.

2 Niet-standaard afkortingen

• ALP

  alkalische fosfatase

• AST

  aspartaataminotransferase

• ALT

  alaninetransaminase

• GGT

  γ-glutamyl transferase

• WGA

  tarwekiemagglutine.