EMBL – European Molecular Biology Laboratory

Informatie over de vorm en de conformatie van een eiwit en over de interactie tussen macromoleculen kan worden verkregen uit de sedimentatie- en diffusiecoëfficiënten die uit een sedimentatiesnelheidsexperiment worden verkregen. Sedimentatiecoëfficiënten zijn bijzonder nuttig om veranderingen in de conformatie van een eiwit te volgen. Het resulterende model voor de algemene vorm van het eiwit of eiwitcomplex kan worden vergeleken met door elektronenmicroscopie verkregen beelden om te beoordelen in hoeverre die beelden van toepassing zijn op het gedrag van deze deeltjes in oplossing.

Associatie

In tegenstelling tot andere methoden voor de bestudering van bindingsprocessen is de sedimentatie-evenwichtsmethode bijzonder gevoelig voor de bestudering van relatief zwakke associaties met associatieconstanten (Ka) in de orde van grootte van 10-100 M-1. Maar ook bindingsprocessen met Ka waarden aanzienlijk groter dan 107 M-1 kunnen worden bestudeerd.

Het instrument

De analytische ultracentrifuge die we op het EMBL hebben is een Beckman Optima XL-A. Het instrument draait het eiwitmonster onder vacuüm met een gecontroleerde snelheid en temperatuur rond, terwijl het op gezette tijden de concentratieverdeling registreert. Afhankelijk van de rotor kan de snelheid oplopen tot 60.000 rpm (wat overeenkomt met 250.000 x g). Voor de metingen worden speciale cellen gebruikt die bestand zijn tegen het hoge gravitatieveld en die de doorgang van licht door het monster mogelijk maken. Het eigenlijke monster wordt in een sectorvormige holte geplaatst die tussen twee kwartsvensters is ingeklemd (zie fig. 1). Deze holte bevindt zich in een middenstuk van aluminiumlegering of versterkte epoxy. Dubbele sectorcellen worden ook gebruikt om te kunnen corrigeren voor de extinctie van het monsteroplosmiddel. Deze cellen maken ook de meting mogelijk van verschillen in sedimentatiecoëfficiënt en van diffusiecoëfficiënten. De middenstukken hebben een weglengte van 3 tot 12 mm, die in combinatie met selecteerbare golflengten het mogelijk maakt een breed scala van monsterconcentraties te onderzoeken. Voor de assemblage van een cel, zie het assemblageprotocol.