Frontiers in Bioengineeringand Biotechnology

Introductie

Serumalbumines zijn eiwitten die vaak worden gebruikt in biodiagnostiek en als model in bio-interface onderzoek (Rosi en Mirkin, 2005; Singh et al, 2005; Arcot et al., 2015). Daarvan is boviene serumalbumine (BSA) het goedkoopst en een eiwit dat op grote schaal wordt gebruikt als blokkeermiddel in ELISA-tests (Maingonnat et al., 1999). In papieren diagnostiek verhoogt BSA (Huang et al., 2018) selectief de hydrofobiciteit van papier om de bio-vloeistoffen en de elutiestroom te verbeteren door de vloeistofabsorptie te verminderen. BSA beschermt en verhoogt de levensduur van functionele biomoleculen die op papier zijn gedroogd. De functionaliteit en levensduur van immunoglobine G en immunoglobine M, gedroogd op met BSA behandelde oppervlakken, kan met een orde van grootte toenemen (van Remoortere et al., 2001). BSA voorkomt ook aspecifieke adsorptie van analyten eiwitten voor kwantitatieve analyse.

Multiple artikelen hebben uitgebreid gerapporteerd over de BSA moleculen sorptie fenomeen op verschillende interfaces, zoals goud (Dennison et al., 2017), mica (Fitzpatrick et al., 1992), silicium (Jachimska et al., 2016; Givens et al., 2017), en cellulose (Mohan et al., 2014; Lombardo et al., 2017). De conformatie van het geadsorbeerde BSA-molecuul en de topologie van de gevormde laag worden sterk beïnvloed door pH, ionensterkte en temperatuur. BSA-moleculen behouden hun natieve structuur tussen pH 4,0 en 8,0. Onder pH 4,0 en boven 8,0 veranderen BSA-moleculen hun vouwconformatie die verschilt van hun natieve structuur (Su et al., 1998a; Barbosa et al., 2010; Phan et al., 2015). Het isoëlektrische punt van BSA ligt bij pH 4,5. Bij deze pH wordt de netto oppervlaktelading nul en aggregeren BSA-moleculen. Verhoging van de pH verhoogt de lading van het BSA en de overheersende elektrostatische afstoting stabiliseert de BSA-moleculen en voorkomt aggregatie (Li et al., 2008).

Ondanks het feit dat het een van de meest bestudeerde eiwitten is, blijven er meerdere vragen over het effect van pH en ionensterkte op de conformatie van het BSA bij adsorptie. In deze context mist het concept van oppervlaktebedekking, uitsluitend gedefinieerd door oppervlaktefractie of gewichtsdichtheid, duidelijkheid. Er is behoefte aan een beter begrip van de variabelen die de vast-vloeibaar interface van het BSA bepalen om robuuste biodiagnostische apparaten te ontwikkelen.

Rovine serumalbuminemoleculen adsorberen aan een interface en vormen een laag met een dikte in de nanometerschaal. Enkele karakteriseringsmethoden zoals reflectiviteit (Su et al., 1998b, 2016; Raghuwanshi et al., 2017a, b), ellipsometer, atoomkrachtmicroscoop (AFM), oppervlakteplasmonresonantie (SPR) en kwartskristalmicrobalans met dissipatie (QCM-D) kunnen de dikte van de geadsorbeerde eiwitlaag op de nanometerschaal meten die vereist is. In het bijzonder kan QCM-D het sorptieproces van biomoleculen kinetisch volgen door de geadsorbeerde eiwitmassa aan een interface in nanogrammen te meten (Kristensen et al., 2013; Luan et al., 2017). QCM-D maakt de controle van temperatuur, ionensterkte en pH-omgeving mogelijk. De dissipatiemodus van QCM onthult de stijfheid van de geadsorbeerde eiwitlagen.

In deze studie wordt een omkeerbaar pH-responsief gedrag beschreven van BSA-moleculen geadsorbeerd aan het goud-zoutinterface. De geadsorbeerde BSA-laag gedraagt zich als een pH-gevoelige spons waar de watermoleculen adsorberen en desorberen afhankelijk van de omringende pH tussen 4 en 8. Dit werk controleert en kwantificeert het water sorptie fenomeen in BSA spons zoals laag en verheldert de mechanismen die betrokken zijn bij verschillende pH en ionische sterkte. Het is ons doel om de BSA-dekking te beschrijven op het vast-vloeibaar grensvlak in termen van aantal moleculen en gewicht/dikte van de laag. Dit is om het concept van biomolecule oppervlaktedekking te verduidelijken en het dynamische gedrag van geadsorbeerde BSA moleculen in de context van bio-diagnostiek op te helderen.

Materialen en Experimenten

Materialen

Bovine Serum Albumine gelyofiliseerd poeder (97%) en natriumchloride (NaCl) zout (99,5%) werden gekocht van de Sigma Aldrich (Castle Hill, NSW, Australië). Zoutzuur (HCl) en natriumhydroxide (NaOH) werden gekocht bij Merck Ltd. Alle chemicaliën zijn van analytische kwaliteit en werden zonder enige zuivering gebruikt.

QCM-D Metingen

Kwarts kristal microbalans met dissipatie metingen werden uitgevoerd op een E4-QCM-D instrument van Biolin Scientific Ltd. Goud gecoate kwarts kristal sensoren werden gebruikt na reiniging in een H2O2:NH3:H2O (1:5:5) oplossing gedurende 15 min en gevolgd door UV-Ozone reiniging gedurende 10 min.

De gouden sensoren werden geplaatst in vloeibare cel modules. 1 mg/mL BSA werd opgelost in de zoutoplossing (0,9% NaCl) en de pH van de oplossing werd ingesteld op pH 7,0 en 4,5. Afzonderlijk werd de pH van de zoutoplossing op 7,0 en 4,5 gebracht. De bereide oplossingen werden door de vloeistofcelmodules geleid met behulp van een slangenpomp. Veranderingen in de resonantiefrequentie (F) en dissipatie (D) van de kwarts-sensor ten opzichte van de grondfrequentie van 5 MHz en zes verschillende oneven boventonen (1, 3, 5, 7, 9, en 13) werden gelijktijdig gecontroleerd.

Eerst werd een zoutoplossing in de vloeistofcel gepompt en in evenwicht gebracht om een stabiele basislijn te genereren. Daarna werd BSA in een zoutoplossing door de cel gepompt, waardoor de BSA-moleculen aan het goudoppervlak adsorbeerden. De zoutoplossing werd vervolgens gepompt om alle niet-vastgehechte BSA-moleculen te verwijderen. Spoelen cycli van zoutoplossingen bij verschillende pH en water werd vervolgens als volgt:

De verkregen variaties in de resonantiefrequentie ΔF en de dissipatie ΔD werden gepast door de Sauerbrey model met behulp van de software Dfind.

DLS Metingen

Dynamische lichtverstrooiing (DLS) op de BSA gedispergeerd in de zoutoplossing bij verschillende pH (4,5 en 7,0) werden gemeten op DLS deeltjesgrootte analyzer (Brookhaven Nanobrook Omni). Een bron van 40 mW (640 nm) temperatuurgeregelde rode halfgeleiderlaser werd gebruikt. De metingen werden driemaal uitgevoerd en gemiddeld. Alle metingen werden uitgevoerd bij kamertemperatuur (22°C).

Contacthoekmetingen

Contacthoek op goud en BSA geadsorbeerd bij verschillende pH op een goud-interface werden gemeten met behulp van een opstelling OCA 35 DataPhysics Instruments GmbH, Duitsland. De metingen werden direct op het sensoroppervlak uitgevoerd en na de meting uit de QCM-opstelling gehaald. Alle metingen werden uitgevoerd bij kamertemperatuur (22°C). Een minimum van vijf contacthoek metingen werden uitgevoerd op het sensoroppervlak en gemiddeld.

Atomic Force Microscope (AFM)

Atomaire-krachtmicroscopie metingen werden uitgevoerd in tikken modus met een JPK Nanowizard III AFM. De cantilevers (AC160TS-R3) geselecteerd voor beeldvorming had een nominale frequentie van 300 kHz en veerconstante van 26 N / m. De beeldvorming werd uitgevoerd op de kale goud-interface en de geadsorbeerde BSA laag bij pH 4,5 op het goud-interface. De beelden werden direct genomen op het sensoroppervlak uit de QCM opstelling na de meting. Alle metingen werden uitgevoerd bij kamertemperatuur (22°C).

Results

Een omkeerbaar pH responsief water sorptie fenomeen van BSA moleculen geadsorbeerd aan de vast-vloeibaar interface wordt bestudeerd door QCM-D met spoelcycli van zoutoplossing bij pH 7,0 en 4,5. Goud werd geselecteerd als vaste interface omdat zijn hydrofobiciteit de BSA-adsorptie stuurt (Lori en Hanawa, 2004; Phan et al., 2015; Ozboyaci et al., 2016). De BSA-lagen die bij verschillende pH-waarden zijn geadsorbeerd, worden gespoeld met afwisselende cycli van zoutoplossingen bij pH 4,5 en 7,0. Bovendien werd het spoelen met zuiver Milli-Q water uitgevoerd om het effect van de ionensterkte op de geadsorbeerde BSA-laag te evalueren.

Figuur 1 (Top) toont de verandering in frequentie (F5 en F7) voor de BSA-moleculen geadsorbeerd bij 7,0 pH van de BSA/zoutoplossing gevolgd door het spoelen met de oorspronkelijke zoutoplossing (pH 7). De volgende spoelcyclus werd uitgevoerd met de zoutoplossing bij pH 4,5. Afwisselende cycli van zoutoplossingen bij pH 4,5 en 7 volgen dan.

In figuur 1, na een aanvankelijke stabiele basislijn, werd een plotselinge daling van F waargenomen die BSA moleculen adsorptie op het goud-vloeistof interface aangeeft. De F daalde tot ΔF = -35,5 en gestabiliseerd. Na spoelen met zoutoplossing (pH 7) nam de F toe van ΔF = -35,5 tot ΔF = -34,0, wat wijst op verwijdering van de niet-geadsorbeerde BSA-moleculen van het oppervlak. Na spoelen met zoutoplossing (pH 4,5) nam de F verder toe tot ΔF = -30,0, wat wijst op extra massaverval van het sensoroppervlak. Verrassend is dat latere spoelcycli met zoutoplossing (pH 7,0) de F doen dalen tot ΔF = -34,0, wat een toename van de massa aan het sensoroppervlak betekent als gevolg van de absorptie van watermoleculen in de BSA-laag. Latere zoutoplossing spoelen cycli volgen dezelfde cyclische massaverandering op het goud interface.

In het tweede experiment, vergelijkbaar met het eerste experiment, BSA-moleculen adsorptie bij pH 4,5 werd gevolgd door zoutoplossing spoelen cycli bij verschillende pH (Figuur 1: Bottom). De geadsorbeerde BSA-moleculen komen overeen met de daling van F tot ΔF = -38,5. Naspoelen met zoutoplossing (pH 4,5) verwijdert de niet-geadsorbeerde BSA (ΔF = -38,0).

Naspoelen met zoutoplossing (pH 7,0) doet de massa van de laag aan het goudoppervlak verder toenemen, wat overeenkomt met de afname van F tot ΔF = -43. De toename van de massa is te wijten aan de absorptie van watermoleculen in de BSA-laag. Later spoelen met zoutoplossing (pH 4,5) desorbeert watermoleculen en brengt de F-waarde terug tot ΔF = -37. Elke spoelcyclus adsorbeert en desorbeert dezelfde hoeveelheid watermoleculen.

In hetzelfde experiment werd het effect van de ionensterkte op de geadsorbeerde BSA-laag bestudeerd door de laag te spoelen met zuiver water. Figuur 1 toont de BSA-adsorptie bij pH 7,0 en 4,5 gevolgd door spoelcycli met zoutoplossing bij verschillende pH en met zuiver Milli-Q water.

In beide gevallen verhoogt het spoelen met water de waarde in ΔF = -29,2 (BSA geadsorbeerd bij pH 4,5) en -26,5 (BSA geadsorbeerd bij pH 7,0). Dit wijst erop dat spoelen met water de massa verder doet afnemen, wat overeenkomt met verdere desorptie van watermoleculen uit de interface. Elke spoeling cyclus onderhoudt hetzelfde gedrag in de massa verandering die te wijten is aan het water sorptie in de BSA-laag.

Interestingly, in alle experimenten, afwisselend zout spoelen cycli bij pH 4,5 en 7,0 tonen de omkeerbare sorptie van watermoleculen binnen de geadsorbeerde BSA laag. Het spoelen van de BSA-laag met zoutoplossing bij pH 7,0 adsorbeert watermoleculen binnen de BSA-laag structuur die de massa van de vaste stof-vloeistof interface toeneemt. Het spoelen van de BSA-laag met zoutoplossing bij pH 4,5 daarentegen desorbeert watermoleculen uit de BSA-laag waardoor de massa van het grensvlak afneemt. De volledig omkeerbare water sorptie gemeten geeft aan dat de BSA moleculen niet desorberen tijdens het spoelen en hun oppervlakte dekking blijft identiek, alleen het aantal watermoleculen in de interfase varieert.

Het water sorptie fenomeen op zout spoelen (bij verschillende pH) komt alleen door geadsorbeerde BSA laag en wordt bevestigd door een aparte zoutoplossing spoelen experiment op de kale gouden sensor (Supplementair materiaal S1). Een stabiele basislijn op de kale gouden sensor frequentie wordt gehandhaafd door de zoutoplossing (bij pH 4,5). Daarna werd de goudinterface gespoeld met een alternatieve zoutspoelcyclus van pH 7,0 en 4,5 (aanvullend materiaal S1). De resultaten tonen duidelijk aan dat de alternatieve zoutspoeling bij verschillende pH-waarden geen effect heeft op de goudsensorfrequentie. Daarom alleen de geadsorbeerde BSA laag op goud vertoont de verandering in frequentie op zoutoplossing spoelen cycli bij verschillende pH-waarden.

De geadsorbeerde massa, de oppervlakte dekking en de dikte van de geadsorbeerde BSA laag worden geëxtraheerd door het Sauerbrey model passen op de QCM-gegevens. Het model wordt gebruikt om een stijve laag passen waar de dissipatie waarde kleiner is dan 2, zoals waargenomen in al onze experimenten (Supplementair materiaal S2). De Sauerbrey vergelijking wordt gegeven door Δm=-CΔfn, waarbij, C = 17,7 ng/Hz.cm2 is constant voor de 5 MHz goud gecoate kwarts kristal, n is de boventoon, Δm is de geadsorbeerde massa en Δf is de verandering in frequentie.

De BSA moleculen geadsorbeerd tot een massa dekking van 6,3 mg/m2 (dikte 5,6 nm) bij pH 7,0 (figuur 2A). Spoelen pre-adsorbed BSA laag met zoutoplossing (pH 4,5) daalde de massa dekking tot 5,6 mg / m2 en de dikte tot 4,9 nm (tabel 1), die het gevolg is van het vrijkomen van watermoleculen uit de geadsorbeerde BSA laag structuur. Verder spoelen met zoutoplossing (bij pH 7,0) heradsorbeert watermoleculen in dezelfde hoeveelheid. Het verschil in massaverandering is Δm = 0,7 mg/m2.

Zo ook in figuur 2B, het spoelen van de voorgeadsorbeerde BSA-laag bij pH 4,5 met zoutoplossing (bij pH 7,0) verhoogt de geadsorbeerde massa van 6,4 mg/m2 tot 7,4 mg/m2 en de dikte van 6,2 tot 6,9 nm; dit is te wijten aan de absorptie van watermoleculen in de BSA-laag. De spoelcyclus van zoutoplossing bij verschillende pH-waarden hield het massaveranderingsverschil van Δm = 1,0 mg/m2, wat 1,4 keer hoger is dan de massaverandering bij pH 7,0 (0,7 mg/m2).

Het gemiddelde aantal watermoleculen geadsorbeerd/gedesorbeerd in de BSA-laag tijdens de spoelcyclus van zoutoplossing wordt berekend uit het verschil in geadsorbeerde massa bij verschillende pH (aanvullend materiaal S3). De BSA-laag geadsorbeerd bij pH 4,5 adsorbeert / desorbeert 3,3 x 1019 watermoleculen tijdens de spoeling cycli, die 570 watermoleculen / BSA molecuul vertegenwoordigt (tabel 1). De BSA-laag, geadsorbeerd bij pH 7,0, adsorbeert/desorbeert echter 2,3 × 1019 watermoleculen, of 450 watermoleculen/BSA-molecuul, tijdens de omkeerbare zoutspoelcyclus.

Dynamic Light Scattering (DLS)-metingen verduidelijken de geaggregeerde en niet-geaggregeerde toestand van BSA in zoutoplossing bij pH 4,5 en pH 7,0 (figuur 3). Bij pH 4,5, DLS onthult de BSA moleculen aggregaten en toont meerdere grootte distributies: 5 nm, 10 nm, 20 nm en 50 nm. Echter, bij pH 7,0, de BSA-moleculen niet aggregeren, als gevolg van elektrostatische afstotingen, en hebben grootteverdeling van 5 en 10 nm. De 5 en 10 nm grootte van gehydrateerd BSA is vergelijkbaar met de grootte en vorm van individuele BSA-moleculen (14 nm × 4 nm × 4 nm) (Anderegg et al., 1955; Wright and Thompson, 1975).

Atomaire-krachtmicroscoop beelden bevestigen de adsorptie van BSA molecuul op het goud interface (figuur 4). Deze beelden tonen verschillen in de oppervlaktemorfologie van kaal goud (Figuren 4a,b) en de BSA geadsorbeerd aan het goud interface bij pH 4,5 (Figuren 4c,d). Bij vergelijking van de vergrote beelden van het kale goud (figuur 4b) en BSA geabsorbeerd oppervlak (figuur 4d) de verschillen tussen de oppervlakken is merkbaar. Hoewel beide oppervlakken door deeltjes worden gevormd, is de definitie en dus het afgebeelde materiaal verschillend. De deeltjes van het kale goudoppervlak zijn meer gedefinieerd (b.v. scherpere grenzen tussen de vormen) wat wijst op een harder materiaal in vergelijking met het BSA gecoate oppervlak. De BSA gecoate goud toont de aanwezigheid van extra aggregaten van BSA moleculen. De vergrote AFM beeld van BSA gecoat goud (figuur 4d) toont de laterale dimensie van de geaggregeerde BSA moleculen varieert tussen 30 en 100 nm met hoogte in het bereik van 5-15 nm.

De contacthoek gevormd door waterdruppels op twee oppervlakken: goud en BSA geadsorbeerd op goud werd gemeten om de bevochtigbaarheid te verduidelijken (figuur 5). De gouden sensor is hydrofiel met een contacthoek van 66°. Echter, de BSA laag geadsorbeerd bij pH 4,5 wordt meer hydrofiel als het water contact hoek daalde tot 60 °, die verder daalde tot 55 ° voor de BSA laag geadsorbeerd bij pH 7,0. Een soortgelijke observatie werd gerapporteerd voor BSA-lagen geadsorbeerd op een siliciumoppervlak als de watercontacthoek daalde van 57° (bij pH 4,5) tot 54° (bij pH 7,0) (Jachimska et al., 2016). Verandering in de contacthoek en laagdikte voor BSA geadsorbeerd bij verschillende pH wijzen op structurele en topografische verschillen tijdens het adsorptieproces op het goudinterface.

Discussie

Het iso-elektrische punt van BSA ligt tussen pH 4,5-4,8; het is de pH waarbij de nettolading van het molecuul nul wordt. Dichtbij het iso-elektrisch punt hebben de BSA-moleculen minder inter-molecuul elektrostatische afstoting. De hoge ionische sterkte van zoutoplossing (0,15 M) speelt ook een rol bij het screenen van ladingen en het belemmeren van elektrostatische interacties. Daarom, BSA moleculen aggregeren in de BSA / zout suspensie. DLS-metingen (figuur 3A) bevestigen de aanwezigheid van BSA aggregaten met afmetingen tot 60 nm in de BSA / zoutoplossing bij pH 4,5.

Tijdens BSA adsorptie (bij pH 4,5) op de goud-interface, geen elektrostatische aantrekking van BSA in de richting van de goud-interface wordt verwacht. Een zwakke positieve lading van het bolvormige BSA-eiwit kan echter een voldoende drift leveren voor adsorptie aan een interface (Su et al., 1998a; Jachimska et al., 2016). Meerdere artikelen hebben eerder gemeld dat de adsorptie van BSA en soortgelijke eiwitten in de buurt van het isoëlektrische punt wordt aangedreven door hydrofobe interacties die zwaarder wegen dan de elektrostatische interacties (Uyen et al., 1990; Tilton et al., 1991; Figueira and Jones, 2008; Norde, 2008; Jeyachandran et al., 2009; Rabe et al., 2011; Huang et al., 2017; Xu et al., 2018; Attwood et al., 2019). De contacthoekmetingen (figuur 5) laten zien dat het kale goudinterface minder hydrofoob is, en albumine bindt met goud via hydrofobe interacties (Norde en Giacomelli, 2000; Figueira en Jones, 2008). Aangezien de inter-BSA moleculen afstotingen worden afgeschermd, de gehydrateerde BSA moleculen adsorberen in grote hoeveelheden (6,4 mg / m2) als aggregaten en met meerdere contactpunten op de goud-interface (figuur 6A). De AFM beeld (figuren 4c,d) bevestigt de adsorptie en aggregatie van BSA moleculen op het goud-interface. AFM beelden onthullen de laterale dimensie van aggregaten varieert tussen 30 en 100 nm met de hoogte verdeeld tussen 5 en 15 nm. Dit bevestigt de BSA moleculen geadsorbeerd als een combinatie van zowel staande en platte conformaties.

Bij pH 7,0 zijn de BSA-moleculen negatief geladen. Hierdoor ontstaat een elektrostatische afstoting tussen BSA-moleculen die de agglomeratie van BSA in oplossing belemmert. DLS-metingen tonen de verdeling van niet-geaggregeerde BSA-moleculen van grootte 5 en 10 nm (figuur 3B). Deze maten zijn vergelijkbaar met de afmetingen van individuele BSA-moleculen (14 nm × 4 nm × 4 nm) (Anderegg et al., 1955; Wright and Thompson, 1975). Tijdens de adsorptie van BSA aan goud vormt een combinatie van zowel elektrostatische afstoting als hydrofobe interacties een BSA-laag op de interface. De sterke laterale inter-molecuul afstoting tussen de geadsorbeerde BSA-moleculen vermindert de BSA-adsorptiecapaciteit (5,6 mg/m2) aan de interface. Daarom, BSA moleculen adsorberen als individuele moleculen (niet aggregaten) en vormen een monolaag op de goud-interface (figuur 6A).

In de QCM-D experimenten (figuur 1), vooraf gehydrateerde BSA moleculen worden geadsorbeerd op de interface. Bij alternatieve zoutoplossing spoelen bij verschillende pH, de BSA-laag verder adsorbeert / desorbeert watermoleculen. Het bij pH 4,5 geadsorbeerde BSA absorbeert en geeft meer watermoleculen af (1,0 mg/m2) dan het bij pH 7,0 geadsorbeerde BSA-moleculen (0,7 mg/m2). De reden hiervoor is de hoeveelheid BSA geadsorbeerd bij pH 4,5 (6,4 mg/m2) is groter dan die bij pH 7,0 (5,6 mg/m2).

De berekende droge massa (niet gehydrateerd) van de BSA-moleculen geadsorbeerd voor volledige oppervlaktedekking van de goudsensor is ongeveer 2 mg/m2 (aanvullend materiaal S3). De berekende droge massa is vergelijkbaar met de gerapporteerde literatuur (Jachimska et al., 2016). Wanneer een droog BSA-molecuul gehydrateerd is, binden zijn hydrofiele groepen zich snel met water. De binding is het gevolg van de dipolaire structuur van het water die interageert met de polaire groepen in BSA. In gehydrateerd BSA zijn sommige watermoleculen stevig gebonden, terwijl andere watermoleculen losjes gebonden zijn of gewoon verstrikt zitten tussen de lusstructuur van BSA. De hoeveelheid water die de BSA-laag hydrateert verhoogt de geadsorbeerde massafractie aan het grensvlak. In de zoutoplossing spoelen cyclus bij verschillende pH-waarden leiden tot een herverdeling van de kosten op de geadsorbeerde BSA laag. Deze herverdeling van de lading creëert een gradiënt tussen de geadsorbeerde BSA-laag en de bulkoplossing. De gradiënt fungeert als een drijvende kracht te entrap en los gebonden watermoleculen vrij te geven van de BSA layer.

De dikte van de BSA-laag wordt geëvalueerd door het Sauerbrey model te passen aan de QCM-D gegevens (figuur 2). De gehydrateerde BSA laag geadsorbeerd bij pH 4,5 en gespoeld met zoutoplossing (pH 7,0) geeft de grotere dikte van 6,9 nm (figuur 6B). De grote hoeveelheid geadsorbeerde BSA-moleculen (6,4 mg/m2) slorpt veel watermoleculen op die de BSA-laag doen opzwellen. Het spoelen van dezelfde laag met de zoutoplossing (pH 4,5) vermindert de laagdikte tot 6,4 nm, wat te wijten is aan het vrijkomen van watermoleculen uit de laag. Een soortgelijk verschijnsel wordt waargenomen voor de BSA-moleculen die bij pH 7,0 zijn geadsorbeerd. De BSA-laagdikte is echter dunner dan voor de BSA-laag geadsorbeerd bij pH 4,5 (figuur 6B).

Verder blijft de geadsorbeerde BSA-laag bij beide pH-waarden stijf en onomkeerbaar gehecht tijdens zoutspoelcycli. Alleen sorptie van watermoleculen treedt op tijdens pH-variatie. De stijfheid en onomkeerbaarheid van het geadsorbeerde BSA is te wijten aan de grote omvang en het hoge moleculaire gewicht van het BSA. Het BSA-molecuul vormt een veelheid van contactpunten op het goud-vloeistofinterface door elektrostatische en hydrofobe interacties die desorptie van BSA-moleculen van de interface voorkomen.

De BSA-laag komt niet los van het goudinterface, zelfs niet bij veranderingen in de ionensterkte van de oplossing (spoelen met gedeïoniseerd water). Spoelen met water desorbeert alleen meer watermoleculen uit de BSA-laag en de massa op het sensoroppervlak neemt verder af (figuur 2). Door de ionensterkte van gehydrateerd BSA te veranderen met zuiver water komen er meer watermoleculen vrij uit de laag. De BSA laag krimpt tot een dikte 4,8 nm (wanneer geadsorbeerd bij pH 4,5) en 4,3 nm (wanneer geadsorbeerd bij pH 7,0) zoals getoond figuur 6B. Voortdurende zoutoplossing spoelen cycli produceert dezelfde omkeerbare water sorptie fenomeen.

Conclusie

Bovine serumalbumine in zoutoplossing (0,9% NaCl) werd geadsorbeerd aan het goud-vloeistof interface bij pH 7,0 en 4,5. Het dynamische proces werd gemeten met QCM-D en bevestigd door AFM, DLS en contacthoekmetingen. Een omkeerbaar, snel en pH-afhankelijk water sorptie fenomeen wordt waargenomen voor de geadsorbeerde BSA laag door het uitvoeren van spoelcycli van zoutoplossing bij pH 4,5 en 7,0. De watermoleculen hydrateren de BSA-laag bij pH 7,0 en drogen hem uit bij pH 4,5. De bij pH 4,5 geadsorbeerde BSA-laag wordt gehydrateerd door 1,4 maal meer watermoleculen dan de bij pH 7,0 geadsorbeerde BSA-laag. Dit fenomeen wordt verklaard door de verschillende conformatie van de BSA-moleculen die bij verschillende pH-waarden worden geadsorbeerd. In de buurt van het isoëlektrische punt bij pH 4,5 neutraliseren de BSA-moleculen en adsorberen ze in grote hoeveelheden als aggregaten: 6,4 mg/m2. Bij pH 7,0 worden de BSA-moleculen geladen (elektrostatische afstoting) en adsorberen als een laag van individuele moleculen bij 5,6 mg/m2. De laag van geaggregeerde BSA-moleculen (bij pH 4,5) die aan het goudraakvlak adsorbeert, houdt meer watermoleculen vast (570 watermoleculen/BSA) dan de laag van individuele BSA-moleculen (bij pH 7,0), die 450 watermoleculen/BSA vasthoudt. Verandering van de ionische sterkte door het spoelen van de BSA laag met zuiver water alleen desorbeert meer water uit de geadsorbeerde laag structuur. In alle gevallen is de BSA-laag stijf en onomkeerbaar geadsorbeerd aan de goud-interface en alleen de watermoleculen adsorberen / desorberen tijdens het spoelen cyclus. Het waargenomen fenomeen is belangrijk voor fundamenteel begrip en om nieuwe bio-diagnostische apparaten en robuuste sensors.

Data Availability Statement

De ruwe gegevens ter ondersteuning van de conclusies van dit artikel zal beschikbaar worden gesteld door de auteurs, zonder onnodig voorbehoud, aan elke gekwalificeerde researcher.

Author Contributions

VR, CB, en BY voerde de experimenten. VR en GG voerden de gegevensanalyse uit en schreven het manuscript.

Funding

Dit werk werd ondersteund door de Australian Research Council (ARC), Australisch papier, Norske Skog, Orora en Visy via de Industry Transformation Research Hub subsidie IH170100020.

Conflict of Interest

De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in afwezigheid van enige commerciële of financiële relaties die zouden kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Aanvullend materiaal