Frontiers in Cellularand Infection Microbiology

Introduction

Bacteroides fragilis, die wordt aangetroffen in de gastro-intestinale flora van mens en vee, is een anaerobe bacterie. Het is een van de prominente menselijke commensalen en een van de meest voorkomende geïsoleerde Bacteroides uit de klinische monsters die diarree, peritonitis, intra-abdominale abcessen, sepsis en endogene purulente infecties veroorzaakt (Sears et al., 1995, 2014).

Het is aangetoond dat B. fragilis darmontstekingsziekten voorkomt bij dier met colitis als gevolg van de productie van immunomodulerend molecuul polysaccharide A (PSA) dat een ontstekingsremmende immuunrespons in darmweefsel induceert (Mazmanian et al., 2008; Lee et al., 2018). De pathogeniciteit van B. fragilis is te danken aan verschillende factoren, waaronder het kapsel, buitenmembraaneiwitten (OMP’s), en speciale enzymen die een 20 kDa metalloprotease omvatten dat Bacteroides fragilis toxine (BFT) wordt genoemd (Sears et al, 1995, 2014).

BFT-producerende B. fragilis, enterotoxigene B. fragilis (ETBF), is bekend als een oorzaak van diarree aandoeningen bij mens en dier (Myers et al., 1987; Purcell et al., 2017). ETBF staat bekend als een risicofactor voor inflammatoire darmziekten (IBD) en het is aanwezig in de ontlasting en biopsiemonsters van de patiënten (Prindiville et al., 2000; Basset et al., 2004; Zamani et al., 2017). BFT-expressie blijkt het extracellulaire domein van E-cadherine te klieven, dat een belangrijk structureel bestanddeel is van de zonula adherens en verantwoordelijk is voor celadhesie. Bovendien kan BFT het B-catenine signaal activeren en IL8 secretie induceren in colon epitheliale cellen (Wu et al., 1998). Een studie toonde aan dat na BFT behandeling van HT29/C1 cellen, verlies van membraan geassocieerd E-cadherine de nucleaire lokalisatie van ß-catenine initieerde, wat c-myc translatie induceerde en leidde tot persisterende cellulaire proliferatie (Wu et al., 2003). De potentie van ETBF en zijn invloed op de gastro-intestinale epitheliale structuur en fysiologie suggereren dat de aanwezigheid van ETBF kan bijdragen aan chronische colonziekten, waaronder oncogene transformatie, intestinale ontsteking, chronische colon disfuncties, en colorectale precancereuze en kankerachtige laesies (Wu et al, 1998, 2003; Sears et al., 2014).

Colorectale kanker (CRC) is een van de meest voorkomende kankers wereldwijd en omvat 9% van alle kankers en het is de vierde oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen wereldwijd (Sears et al., 1995; Ferlay et al., 2015). Er is echter een significant verschil tussen landen in de leeftijd gestandaardiseerde incidentie van deze kanker; de incidentie in de VS en Europese landen is meer dan 25 keer hoger dan die van Afrikaanse en Aziatische landen. De morbiditeit en mortaliteit van CRC is de laatste jaren aan het dalen door verbeterde screeningtests die colorectale modificaties in vroegere stadia kunnen detecteren en verbeteringen in medicatie en procedures (Boyle en Langman, 2000; Rafiemanesh et al, 2016).

CRC is een van de meest voorkomende vormen van kanker in Iran en is de op twee na meest voorkomende kanker onder Iraanse mannen (8,1-8,3 per 100.000 populaties) en de op drie na meest voorkomende kanker onder Iraanse vrouwen (6,5-7,5 per 100.000 populaties) (Moghimi-Dehkordi et al., 2008; Kolahdoozan et al., 2010). De risicofactoren van CRC zijn zwaarlijvigheid, een zittende levensstijl, een vetrijk dieet, een dieet met weinig groenten en fruit, roken, alcoholmisbruik en niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID’s). Chronische ontsteking, IBD, poliepen, adenomen en dysplasie veroorzaken veranderingen in de dikke darmcellen en maken ze vatbaar voor kanker (Boyle en Langman, 2000; Johnson et al., 2013).

De incidentie en mortaliteit van CRC neemt af in ontwikkelde westerse naties, terwijl de incidentie de laatste decennia in Iran toeneemt onder beide geslachten als gevolg van veranderingen in levensstijl en dieet. Een andere reden voor deze daling kan de toename van het aantal faciliteiten en de verbetering van apparatuur en technologie zijn, omdat meer mensen naar de gezondheidszorg verwijzen voor screening, terwijl in het verleden een persoon misschien kanker had en zelfs was overleden, maar de kanker ongediagnosticeerd bleef door gebrek aan apparatuur en faciliteiten (Malekzadeh et al., 2009; Siegel et al, 2014).

In deze studie werden de frequentie en abundantie van ETBF in biopsiemonsters van de patiënten met CRC en precancereuze aandoeningen vergeleken met die van de personen zonder persoonlijke of familiaire voorgeschiedenis van colorectale ziekte om de associatie tussen de aanwezigheid van BFT en tumorontwikkeling te onderzoeken.

Materialen en Methoden

Patiënten en Preparaten

In deze case-control studie werden 120 mucosale biopten verzameld van Iraanse patiënten met precancereuze en CRC aandoeningen (n = 68) en controlegroep (n = 52) met behulp van colonoscopie. Patiënten met precancereuze (Geserreerde laesies, Adenoma omvatten Laag-grade Dysplasie: LGD en hooggradige dysplasie: HGD) en kankeraandoeningen (Colorectale Kanker: CRC) die tussen maart 2015 en jan 2017 naar het Imam Khomeini ziekenhuis in Teheran werden verwezen, werden geselecteerd om deel te nemen aan deze studie. De ethische commissie van de Tehran University of Medical Sciences keurde het studieprotocol goed. Ook werd geïnformeerde toestemming verkregen van alle deelnemers. Alle patiënten werden gediagnosticeerd op basis van klinische symptomen, evenals histologische en radiografische normen, die typische kenmerken vertoonden met een speciale verdeling (Swiderska et al., 2014). Alle gegevens over leeftijd, geslacht en type laesies werden opgehaald uit de dossiers van de patiënten. Alle patiënten die in de studie binnenkomen, werden gediagnosticeerd op het moment van colonoscopie en chemotherapie begon niet voor de behandeling ervan.

In dezelfde periode werden 52 gezonde controles, zonder persoonlijke of familiaire geschiedenis van diagnostische colorectale ziekte, waarvan leeftijd en geslacht overeenkwamen met die van de patiënten, opgenomen in de studie als controles. Een recente voorgeschiedenis van diarree en IBD was een uitsluitingscriterium voor de controles. Geen van de deelnemers aan deze studie gebruikte antibiotica of probiotica in de laatste 3 maanden. Alle specimens werden bewaard in de steriele container met thioglycollaat medium (Merck, Duitsland) en naar het laboratorium vervoerd in anaerobe toestand voor onmiddellijke behandeling. Ook werden van elke patiënt 2 slijmvliesbiopten afgenomen voor kweek en DNA-extractie.

Bacteriële cultuur

Twee glazen homogenisatoren werden gebruikt voor mechanische disruptie en homogenisatie voor alle biopten; vervolgens werden ze gekweekt op Bacteroides Bile Esculin agar (BBE) (Himedia Laboratories Pvt. Ltd, India) medium. In deze studie werd het Anoxomat-systeem (MART Microbiology Drachten, Nederland) gebruikt om anaërobe gasatmosfeer te creëren; de platen werden vervolgens gedurende 72 uur in een anaërobe kamer bij 37°C geïncubeerd. Bovendien werd B. fragilis bevestigd met behulp van real-time PCR.

DNA-extractie

DNA werd rechtstreeks uit het biopsieweefsel geëxtraheerd met behulp van RTP® Mycobacteria Kit (Invitek, Berlijn, Duitsland). De optische dichtheid (OD) van het geëxtraheerde DNA werd bepaald bij 260 nanometer. Daarna werd het DNA bewaard bij -20°C voor latere analyse en real-time PCR.

Real-Time PCR

De sequenties van het bft- en 16S rRNA-gen werden uit de Genenbank gehaald. De primers en probes werden ontworpen met behulp van primer 3 plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi). Alle primers en probes die werden gebruikt voor de detectie van alle bft-genstypes waren ontworpen in onze vorige studie (Zamani et al., 2017). Om de bft-gen subtypes te detecteren, werd de real-time PCR uitgevoerd zoals eerder beschreven (Merino et al., 2011).

Het genomisch DNA van ETBF-stam D-134 en RIGLD-kloon 1 werden gebruikt als positieve controles (Rashidan et al., 2018). De negatieve controle was PCR TaqMan master mix met gedestilleerd water in plaats van DNA.

Standaard-DNA werd bereid voor amplificatie en het aantal moleculen van de template per gram werd berekend met de gedefinieerde formule (Zamani et al., 2017). De standaardcurve voor bft en 16S rRNA-gen werd beoordeeld met behulp van elke primer en probe met een 10-voudige seriële verdunning van B. fragilis DNA-monsters, overeenkomend met 101-106 gemiddelde waarde per gram biopten.

Volgens de standaardcurve en het y-intercept werden monsters die het fluorescentiesignaal niet eerder dan de Ct van 38 vertoonden, als negatief bepaald. Ook werden monsters die fluorescentie produceerden met een Ct-waarde ≤ 10 verdund. De werkzaamheid van de real-time PCR werd bepaald als E = 10(-1/slop) – 1 (Zamani et al., 2017).

Na optimalisatie van de standaardcurven werd de verdunningsreeks in elke amplificatierun gezet. Real-time PCR-tests werden geëvalueerd met behulp van LinGene K Real Time PCR-tool (Bioer, Hangzhou, PR, China). Alle tests werden uitgevoerd in een volume van 25 μL (Zamani et al., 2017). Om de kwaliteit te waarborgen, werden alle experimenten onafhankelijk voor een tweede keer herhaald en werden de gemiddelden gerapporteerd.

Om de specificiteit van de PCR en de verwachte grootte van het product te controleren, werden de primers toegepast in een conventionele PCR en werden de amplicons op de agarosegel uitgevoerd. Bovendien werd de specificiteit van de positief geamplificeerde fragmenten aangetoond door sequencing. Het PCR-product werd naar de Zuid-Koreaanse Macrogen Corporation gestuurd voor sequencing. De sequencingresultaten werden geanalyseerd met Chromas 2.6 software. Vervolgens werden alle sequenties in de NCBI-databank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) opgenomen. In alle gesequenteerde isolaten was het percentage overeenkomst met de verwante genen (16s rRNA gen en bft gen) aanwezig in de NCBI database meer dan 95%.

Statistische analyse

De resultaten werden vergeleken met behulp van Fisher’s exact, Chi kwadraat, en Mann-Whitney tests. P < 0.05 werd als statistisch significant beschouwd. Ook werden gemiddelde waarden ± std. fout van het gemiddelde (SEM) berekend voor B. fragilis en ETBF. De gegevens werden geanalyseerd met SPSS 13.0 statistische software.

In deze studie werd conditionele logistische regressie gebruikt om de odds ratio’s (OR) en 95% betrouwbaarheidsintervallen te bepalen. In dit ontwerp is de odds ratio een consistente schatter van de rate ratio van CRC bij blootstelling met ETBF versus niet-blootgestelde proefpersonen.

Resultaten

In deze studie werden 68 monsters verzameld van CRC-patiënten (36 mannen en 32 vrouwen; gemiddelde leeftijd: 55 jr.; range: 35-78) en 52 monsters werden genomen van gezonde controles (HC) (30 mannen en 22 vrouwen; gemiddelde leeftijd: 56 jr.; range: 42-78). Alle patiënten werden gediagnosticeerd op basis van colonoscopische procedures op het moment van bemonstering. Alle patiënten die op het moment van de colonoscopie werden gediagnosticeerd, waren in totaal 26 patiënten met invasieve CRC, 18 patiënten met gekartelde laesies, 24 patiënten met adenomen, 14 patiënten met LGD en 10 patiënten met HGD volgens de huidige classificatie (figuur 1). Deze biopten werden genomen van de rechterzijde (opgaand), de linkerzijde (neergaand), en beide zijden bij respectievelijk 22, 32, en 14 patiënten (tabel 1).

De resultaten voor B. fragilis cultuur was positief voor 31 (51%) en 25 (48%) monsters van de patiënten en gezonde controles, respectievelijk (tabel 2) (P = 0,7).

Volgens de standaardcurve leverden verdunningen van ETBF (controle positief) DNA op 101, 102, 103, 104, 105, en 106 Ct-waarden op van respectievelijk 15,08 ± 0,1, 18,04 ± 0,2, 21,42 ± 0,2, 25,02 ± 0,2, 28,02 ± 0,4, en 31,96 ± 0,4. De efficiëntie van de real-time PCR lag tussen 98 en 100%.

Positieve monsters voor 16S rRNA-gen en bft-gen waren 63 en 47% bij patiënten. Positieve resultaten werden echter getoond in respectievelijk 81 en 3,8% van de HC-monsters (tabel 3). Het verschil tussen de positiviteit van het bft-gen bij patiënten en HC was statistisch significant (P = 0,00).

Ook het aantal positieve monsters voor bft-genen in CRC en HC binnen de clinicopathologische groepen wordt weergegeven in tabel 3. De hoogste OR werd gevonden in gekartelde laesies groep gevolgd door adenomateuze laesies met LGD groep. Ook de OR voor alle patiënten (OR 22,22, 95% CI: 5, 98,74) beschreef de associatie van ETBF en het bestaan van laesies.

De resultaten van de kwantitatieve analyse van real-time PCR voor 16S rRNA-gen geteld voor B. fragilis en bft-gen geteld voor ETBF per ng DNA werden getoond in Tabel 4. Het verschil tussen de aantallen kopieën van het 16S rRNA-gen in patiënten en HC was niet statistisch significant (P ≥ 0,05). De aantallen kopieën van het bft-gen waren hoger in de monsters van patiënten dan in die van gezonde controles (P = 0,00). Bovendien waren er meer kopieën van het bft-gen in ETBF-positieve monsters in de groep met precursorlaesies dan in die met CRC; dit verschil was echter niet statistisch significant. De sequencing-resultaten bevestigden de aanwezigheid van bft- en 16S rRNA-genen (gegevensblad 1).

Verder bleek uit de resultaten van deze monsters dat het meest voorkomende subtype van het bft-gen bft1 was, gevolgd door bft2. Van de 32 bft gen-dragende isolaten, subtyppeerden 18 (56,2%) isolaten als bft-1 en 14 (43,7%) isolaten als bft-2. Bovendien werd het bft-gen gedetecteerd in 2 van de HC-monsters, en al deze monsters werden als bft-1 getypeerd. Geen enkel DNA-monster herbergde het subtype bft-3.

Discussie

Er is groeiend bewijs voor het effect van microbiële dysbiose in de darm, initiatie en ontwikkeling van colorectale kanker (Sears en Garrett, 2014; Gagniere et al., 2016). Hoewel de incidentie van CRC in Iran lager werd gerapporteerd in vergelijking met andere landen, werd verwacht dat het percentage in de toekomst zou stijgen (Hosseini et al., 2004; Malekzadeh et al., 2009). In eerdere studies werd ook gerapporteerd dat ETBF een rol kan spelen bij diarree en IBD (Myers et al., 1987; Prindiville et al., 2000; Basset et al., 2004; Merino et al., 2011; Purcell et al., 2017; Zamani et al., 2017).

Enkele onderzoeken hebben gesuggereerd dat bepaalde bacteriesoorten (bijv. ETBF) kunnen werken als pathogene bacteriën die de ontwikkeling van dysbiose in de microbiële gemeenschap van de darm verduidelijken en CRC uitlokken (Hajishengallis et al., 2012; Hajishengallis en Lamont, 2016). De colorectale tumorigenese werd geïnduceerd door immuunreacties en activering van proinflammatoire cytokinen als gevolg van BFT (Wu et al., 2004, 2009).

De bevindingen van deze studie gaven aan dat ETBF significant geassocieerd was met de getande laesies gevolgd door LGD. De hogere odds ratio in deze laesies toonde ook aan dat blootstelling aan ETBF een risicofactor is voor de kankerachtige en vooral precancereuze toestanden. Dit ondersteunt de hypothese dat BFT-producerende stammen een belangrijke rol kunnen spelen bij het op gang brengen van de ontsteking en de immunologische reactie bij genetisch vatbare personen en kunnen leiden tot CRC. De eerste studie die een verhoogde prevalentie van ETBF in de ontlasting van patiënten met colorectale kanker (38%) in vergelijking met de controlegroep (12%) aantoonde, werd uitgevoerd door Ulger Toprak et al. (2006). Bovendien hebben enkele eerdere rapporten een associatie aangetoond tussen bft-gen en CRC, met name in het late stadium van CRC (Dejea et al., 2014; Boleij et al., 2015; Viljoen et al., 2015). Een studie uitgevoerd door Purcell et al. toonde significante associaties van ETBF met tubulaire adenomen, getande laesies, en laaggradige dysplasie, wat vergelijkbaar was met de resultaten van de huidige studie (Purcell et al., 2017).

In deze studie vertoonden voorloperlaesies, inclusief die met laaggradige dysplasie, een stijgende trend in bft-gen hoeveelheid in vergelijking met die met CRC; dit verschil was echter niet statistisch significant. Bovendien hebben de auteurs eerder gemeld dat ETBF-markers werden waargenomen in het colon en het terminale ileum van de ulceratieve colitispatiënten die een predispositie hebben voor CRC (Zamani et al., 2017; Rashidan et al., 2018). Evenzo werd in een eerdere studie alleen het bft1 subtype van dit gen gedetecteerd (Zamani et al., 2017). Hoewel het bft1-gen het meest voorkomende subtype was, werd in deze studie ook het bft2-gen gevonden.

In deze studie werd ETBF gedetecteerd in de laesies van de CRC-patiënten, en soortgelijke resultaten zijn ook eerder gerapporteerd door andere onderzoekers die ETBF in colon mucosale monsters bestudeerden (Boleij et al., 2015; Viljoen et al., 2015). Recente studies naar de rol van het darmmicrobioom hebben aangetoond dat dysbiose in de microbiële gemeenschap voorkomt in de niet-tumor- en tumorregio’s van de CRC-patiënten (Dejea et al., 2014; Flemer et al., 2017; Purcell et al., 2017). In deze studies bleek dat sommige van de bacteriën, waaronder Fusobacterium nucleatum, ETBF, Escherichia coli, Streptococcus gallolyticus, en Enterococcus faecalis en butyraat-producerende bacteriën een belangrijke rol kunnen spelen bij de ontwikkeling van CRC (Dejea et al, 2014; Flemer et al., 2017; Park et al., 2018).

De resultaten van Real-time PCR voor detectie van B. fragilis toonden aan dat meer percentage van de patiënten en HC B. fragilis bevatte in vergelijking met de kweekmethode. De gouden standaard methode voor detectie van bacteriën is gebaseerd op kweek, maar het vereist een hoog aantal levensvatbare cellen en specifiek voor anaerobe bacteriële kweek, kunnen enkele beperkingen optreden. Mogelijk beïnvloeden deze beperkingen het verschil tussen de resultaten.

De verschillen in B. fragilis kweek en Real-time PCR resultaten tussen controles en CRC monsters is niet significant. Deze gegevens suggereren dat waarschijnlijk de stammen die bft-gen herbergen, en niet B. fragilis zelf, in deze studie konden bijdragen aan CRC. Het is aangetoond dat B. fragilis een prominente menselijke commensaal is, zodat deze bacterie ook kan worden geïsoleerd uit gezonde controles zoals de patiënten. Maar bij patiënten met kankerachtige en precancereuze laesies zijn sommige van de stammen die bft-genen bevatten toegenomen en deze dysbiose kan waarschijnlijk ontstekingen induceren. Bovendien hebben sommige studies aangetoond dat de menselijke commensaal B. fragilis de ontwikkeling van colitis voorkomt en een effectieve therapeutische strategie voor CRC kan bieden, terwijl verschillende studies suggereren dat enterotoxigene stammen van deze bacterie geassocieerd zijn met intestinale tumoren als gevolg van enterotoxineproductie (Sears et al., 1995, 2014; Mazmanian et al., 2008; Lee et al., 2018).

Er waren enkele beperkingen in deze studie. Er werden verschillende methoden gebruikt om het bft-gen te diagnosticeren, dat rechtstreeks werd geëxtraheerd uit tumorweefsels in de dikke darm van de patiënten. Daarom wordt het uitvoeren van een groot cohortonderzoek op bevolkingsniveau sterk aanbevolen. Bovendien is verder onderzoek nodig om een mogelijke correlatie aan te tonen tussen de aanwezigheid van het bft-gen en getande laesies, LGD, en CRC.

Conclusies

De resultaten van deze studie suggereren dat ETBF aanwezig zou kunnen zijn in de mucosale biopten van de patiënten met precancereuze aandoeningen, zoals getande laesies en LGD, in aanvulling op CRC-patiënten. Er werd een significant verband gevonden tussen de aanwezigheid van ETBF in de aangetaste weefsels en het aantal van deze bacteriën in de monsters van de patiënten, vooral in de precancereuze carcinogene laesies: adenomen met laaggradige dysplasie en getande laesies. In feite wordt ETBF vaker gedetecteerd in vroege laesies, maar verder onderzoek met een groter aantal specimens leek nuttig om dit precies vast te stellen.

Ook is aanvullend onderzoek nodig om te bepalen of leeftijd, geslacht, dieet en andere omgevingsfactoren de ETBF-diagnose bij mensen in de loop van de tijd beïnvloeden.

Tot slot zou ETBF een marker kunnen zijn voor de prognose van CRC, vooral in de precancereuze laesies, en zou het kunnen worden gebruikt om deze aandoeningen te screenen.

Data Availability Statement

De ruwe gegevens die de conclusies van dit manuscript ondersteunen, zullen door de auteurs, zonder onnodig voorbehoud, ter beschikking worden gesteld aan elke gekwalificeerde onderzoeker.

Ethics Statement

De studies waarbij menselijke deelnemers betrokken waren, werden beoordeeld en goedgekeurd door het Ethisch Comité van de Tehran University of Medical Sciences. De patiënten/deelnemers gaven hun schriftelijke geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan deze studie.

Author Contributions

SZ is de eerste auteur die alle laboratoriumexperimenten uitvoerde, gegevens verzamelde en analyseerde, en het manuscript opstelde. RT is de gastro-enteroloog die colonoscopie deed en de specimens van alle gevallen leverde. LS nam deel aan de opzet en coördinatie van de studie en adviseerde bij alle onderdelen van de studie. AS en SJ hebben deelgenomen aan het verzamelen van de monsters en het uitvoeren van de testen. MF heeft toezicht gehouden op alle onderdelen van de studie. Alle auteurs hebben het manuscript gelezen en goedgekeurd.

Funding

Dit werk werd ondersteund door de Tehran University of Medical Sciences (Grant No: 32467).

Conflict of Interest

De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in afwezigheid van enige commerciële of financiële relaties die zouden kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Acknowledgments

De auteurs willen het personeel van het Imam Khomeini ziekenhuis bedanken voor hun vriendelijke ondersteuning bij het verzamelen van de monsters.

Supplementary Material

Het supplementaire materiaal voor dit artikel is online te vinden op: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2019.00449/full#supplementary-material

Datablad 1. De sequencing resultaten van bft en 16S rRNA genen in één isolaat.