Frontiers in Endocrinology

Introduction

Cardiovascular disease (CVD) is de meest voorkomende en ernstige diabetes complicatie, die leidt tot aanzienlijke sterfte, en invaliditeit onder patiënten met type 2 diabetes mellitus . Patiënten met T2DM lopen een twee- tot driemaal hoger risico op CVD dan patiënten zonder T2DM (3, 4). In vergelijking met traditionele factoren zoals bloeddruk, lipiden, en body mass index , endogene kleine molecule verbindingen gedetecteerd door metabolomics benaderingen zijn meer kans om de cellulaire toestand in verband met gezamenlijke effecten van cel voeding, drugs, milieuverontreinigende stoffen, en andere externe factoren (7) weerspiegelen. Acylcarnitinemetabolieten zijn een groep esterstoffen die worden gevormd door een combinatie van vrij carnitine en acyl-co-enzym A (acyl-CoA) dat door vetzuren wordt geproduceerd (8). Uit een cohortstudie bleek dat de plasmaconcentraties van bepaalde acylcarnitinen bij T2DM-patiënten hoger waren dan bij niet-T2DM-patiënten (9). Bovendien was de concentratie van acylcarnitines en mitochondriaal 4-hydroxynonenal in het hartweefsel van muizen die met fructose werden gevoed hoger dan in de controlegroep (10). Aangezien 4-hydroxynonenal wordt geproduceerd door lipide peroxidatie, kan een verhoogd 4-hydroxynonenal wijzen op hoge oxidatieve stress (11). Er zijn echter maar weinig klinische studies die verbanden tussen acylcarnitines en CVD bij T2DM hebben onderzocht. Het blijft inderdaad onduidelijk of er associaties zijn tussen acylcarnitines en CVD bij T2DM.

Daarom hebben we een ziekenhuisgebaseerd cross-sectioneel onderzoek uitgevoerd om de associatie tussen acylcarnitine metabolieten en CVD bij Chinese patiënten met T2DM te schatten.

Materialen en Methoden

Studiemethode en Populatie

Deze studie gebruikte een cross-sectionele studieopzet om de associatie tussen acylcarnitines en CVD in T2DM te onderzoeken. We haalden elektronische medische dossiers op van 2.554 ziekenhuispatiënten met beschikbare metabolietgegevens uit de belangrijkste elektronische database van het Liaoning Medical University First Affiliated Hospital (LMUFAH), Jinzhou, China, die van mei 2015 tot augustus 2016 in het ziekenhuis waren opgenomen (12).

De inclusiecriteria waren als volgt vastgesteld: (1) leeftijd ≥ 18 jaar; (2) gediagnosticeerd als T2DM; en (3) acylcarnitinemetabolieten waren beschikbaar: acetylcarnitine (C2), propionylcarnitine (C3), butyrylcarnitine (C4), hydroxylbutyrylcarnitine (C4-OH), succinylcarnitine (C4DC), isovalerylcarnitine (C5), 3-hydroxyisovalerylcarnitine (C5-OH), glutarylcarnitine (C5DC), tiglylcarnitine (C5:1), hexanoylcarnitine (C6), octanoylcarnitine (C8), decanoylcarnitine (C10), lauroylcarnitine (C12), myristoylcarnitine (C14), 3-hydroxyl-tetradecanoylcarnitine (C14-OH), tetradecanoyldiacylcarnitine (C14DC), tetradecenoylcarnitine (C14:1), palmitoylcarnitine (C16), 3-hydroxypalmitoylcarnitine (C16-OH), 3-hydroxypalmitoleylcarnitine (C16:1-OH), octadecanoylcarnitine (C18), arachidisch carnitine (C20), behenisch carnitine (C22), tetracosaancarnitine (C24), hexacosaancarnitine (C26). De uitsluitingscriteria waren: (1) gediagnosticeerd als diabetes type 1; (2) zwangerschap. In totaal werden 741 T2DM-patiënten die voldeden aan de inclusie- en niet aan de exclusiecriteria, opgenomen in de analyse.

Ethische goedkeuring van de studie werd verkregen van de Ethische Commissie voor Klinisch Onderzoek van LMUFAH en er werd afgezien van geïnformeerde toestemming door de Ethische Commissie voor Klinisch Onderzoek van LMUFAH vanwege de retrospectieve aard van de cross-sectionele studie.

Gegevensverzameling en klinische definitie

Demografische en klinische gegevens werden opgehaald uit de belangrijkste elektronische database van het ziekenhuis, waaronder leeftijd, geslacht, duur van diabetes, diabetescomplicaties, medicijngebruik (antidiabetische middelen, antihypertensiva, en lipidenverlagende geneesmiddelen), BMI, systolische bloeddruk (SBP), diastolische bloeddruk (DBP), geglyceerd hemoglobine (HbA1c), triglyceride (TG), low-density lipoproteïne cholesterol (LDL-C), en high-density lipoproteïne cholesterol (HDL-C).

CVD werd gedefinieerd als het hebben van voorafgaande coronaire hartziekte (CAD), hartfalen (HF), of beroerte. BMI werd berekend als lichaamsgewicht in kilogram gedeeld door de gekwadrateerde lichaamslengte in meter, uitgedrukt in kg/m2. Overgewicht werd gedefinieerd als BMI ≥ 24,0 kg/m2 maar <28,0 kg/m2, en obesitas gedefinieerd als BMI ≥ 28,0 kg/m2 zoals aanbevolen door de Chinese Diabetes Associatie voor gebruik in het Chinees (13). Gekalibreerde kwik sfygmomanometer werd gebruikt om SBP en DBP te meten nadat de patiënten 5-10 minuten hadden gerust. Van T2DM-patiënten werd ’s nachts nuchter bloed afgenomen (ten minste 8 uur vasten). Metingen van HbA1c, TG, HDL-C, en LDL-C werden uitgevoerd in het biochemisch laboratorium van LMUFAH. Op basis van het aantal koolstofatomen in de acylgroepketen werden de acylcarnitines ingedeeld in drie groepen: acylcarnitines met korte ketens, waaronder C2, C3, C4, C4-OH, C5, C5-OH, C5DC, C5:1, en C6; middellange-keten acylcarnitines waaronder C8, C10, C12, C14, C14-OH, C14DC, en C14:1; lange-keten acylcarnitines waaronder C16, C16-OH, C16:1-OH, C18, C20, C22, C24, en C26 (14).

Acylcarnitine Kwantificering

De metabolomics assay-methode was beschreven in eerdere studies (15). Kort gezegd, droge bloedvlek monsters verzameld door vingerprik na 8 uur vasten werden gebruikt de metabolomics assay. De metabolomics in droge bloedvlekken werden gemeten met behulp van massaspectrometrie (MS) technologie. De MS metabolomics analyse werd uitgevoerd met een AB Sciex 4000 QTrap systeem (AB Sciex, Framingham, MA, USA). De elektrospray-ionisatiebron was ionenbron. De ionenspray-spanning bedroeg 4,5 kV. De positieve modus werd gebruikt om analyten te scannen. De mobiele fase waarin de te testen component zich bevond, was een waterige oplossing van 80% acetonitril. Isotoop-gelabelde interne standaarden van acylcarnitine van Cambridge Isotope Laboratories (Tewksbury, MA, USA) werden gebruikt voor absolute kwantificering.

Statistische analyse

Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van Statistical Analysis System Release 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Een P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Categoriale gegevens tussen twee groepen werden vergeleken met behulp van de Chi-kwadraat toets of Fisher’s exact-test, indien van toepassing, en uitgedrukt in aantal en percentage. De P-P-plot of Q-Q-plot werd gebruikt om de normaliteit te testen wanneer de analysevariabele een continue variabele was. Continue variabelen die voldeden aan de normale verdeling werden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) en vergeleken met de Student’s t-test, of als mediaan met interkwartiel bereik (IQR) anders en vergeleken met Wilcoxon Signed Rank Test.

Om het hoofd te bieden aan meervoudige vergelijkingen, werd factoranalyse gebruikt om een groot aantal gecorreleerde acylcarnitines te reduceren tot een kleiner aantal ongecorreleerde factoren. Kaiser-Meyer-Olkin (KMO) en Bartlett sfericiteitstests werden gebruikt om de geschiktheid voor factoranalyse te evalueren (16). Een KMO-coëfficiënt < 0,5 wordt als onaanvaardbaar beschouwd, terwijl waarden rond 0,8 als verdienstelijk werden beschouwd. Principale componentenanalyse werd gebruikt om factoren te extraheren en de overeenkomstige factorladingsmatrix te verkrijgen. Door varimax-rotatie werd de initiële factorbelastingsmatrix geroteerd om een oplossing te verkrijgen die beknopter en gemakkelijker te interpreteren is dan de initiële factorextractie (17). Individuele acylcarnitines met de maximale belasting voor een factor werden gebruikt als relevante componenten van de factor. Scree plot is een lijnplot van de eigenwaarden van factoren in factoranalyse (18). De horizontale as van de scree plot is het aantal factoren, en de verticale as is de eigenwaarde van de factoren. Het aantal acylcarnitine factoren werd bepaald door eigenwaarde, communaliteiten, en scree plot: eigenwaarde > 1, communaliteiten ≥ 50%, aantal factoren gelegen op de steile helling van de scree plot.

Multivariabele binaire logistische regressie werd gebruikt om odds ratio’s (OR) en hun 95%-betrouwbaarheidsintervallen (CI) van de geëxtraheerde acylcarnitine factoren voor CVD in T2DM te schatten. Een gestructureerd aanpassingsschema werd toegepast om te controleren voor verstorende effecten van demografische en klinische variabelen. Specifiek, model 1 was univariabel model; model 2 werd aangepast voor alle andere acylcarnitine factoren; model 3 werd verder aangepast voor leeftijd, geslacht, BMI, duur van diabetes, HbA1c, SBP, DBP, TG, LDL-C, HDL-C; en model 4 paste verder aan voor medicijngebruik, inclusief antidiabetische geneesmiddelen, antidiabetische geneesmiddelen en lipidenverlagende geneesmiddelen in aanvulling op de variabelen aangepast in model 3.

Result

Description of Study Subjects

De gemiddelde leeftijd van de studiepatiënten was 57,9 (SD: 14,1) jaar, en de mediane duur van diabetes was 5 (IQR: 0-10) jaar. Van hen waren 391 (52,8%) mannen en 288 (38,9%) hadden CVD (87 met alleen CAD, 109 met alleen beroerte, 6 met alleen HF, 51 met zowel CAD als beroerte, 53 met zowel CAD als HF, 18 met zowel beroerte als HF, en 18 met alle) (tabel 1, gegevensblad 1).

Vergeleken met de niet-CVD groep, waren T2DM patiënten met CVD vaker ouder en hadden een langere duur van diabetes, hogere SBP, lager HbA1c, en gebruikten minder vaak insuline. Deze patiënten hadden meestal een lager LDL-C, gebruikten minder vaak antidiabetesmedicijnen en gebruikten vaker lipidenverlagende en antihypertensieve middelen. Er waren geen significante verschillen in geslacht, BMI, DBP, HDL-C, en TG tussen de twee groepen. C2, C4, C6, C8, C10, C12, C14, C14-OH, en C14:1 waren hoger, terwijl C5-OH en C24 lager waren bij patiënten met CVD dan bij hun tegenhangers zonder CVD. Andere acylcarnitines waren vergelijkbaar in de twee groepen (Tabel 2).

Geëxtraheerde factoren van Acylcarnitines

Resultaten van de factoranalyse waren aanvaardbaar zoals gesuggereerd door een hoge KMO coëfficiënt van 0,898 en een zeer significante P-waarde van Bartlett sfericiteitstest van <0,0001. Factoren 1-5 hadden eigenwaarden van meer dan 1 en bevonden zich op de steile helling van de scree plot (Figuur 1). Er werden dus vijf factoren geëxtraheerd en de ladingen van acylcarnitines op de vijf factoren na varimax-rotatie werden vermeld in tabel 3. Factor 1 omvatte C2, C4, C4-OH, C5DC, C6, C8, en C14DC; Factor 2 omvatte C10, C12, C14, C14-OH, C14:1, en C16-OH; Factor 3 omvatte C16, C16:1-OH, C18, C20, en C3; Factor 4 omvatte C22, C24, en C26; Factor 5 omvatte C4DC, C5, C5-OH, en C5:1. De vijf factoren verklaarden 65,9% van de totale variantie.

Associaties tussen geëxtraheerde factoren en CVD-risico bij T2DM

Factoren 1, 2, en 4 waren alle positief geassocieerd met CVD-risico bij T2DM in univariate analyse. Na correctie voor andere factoren waren deze positieve associaties nog steeds significant (Model 2). Echter, alleen factor 1 (OR: 1,42, 95% CI: 1,03-1,95) en factor 2 (OR: 1,24, 95% CI: 1,03-1,49) waren nog steeds positief geassocieerd met het risico van CVD na verdere correctie voor leeftijd, geslacht, BMI, duur van de diabetes, HbA1c, SBP, DBP, TG, LDL-C, en HDL-C. Na de laatste correctie voor geneesmiddelengebruik bleef de effectgrootte van factor 1 (OR: 1,45, 95% CI: 1,03-2,03) en factor 2 (OR: 1,23, 95% CI: 1,02-1,50) grotendeels onveranderd (tabel 4).

Gevoeligheidsanalyse

Na gemiddelde imputatie en meervoudige imputatie van ontbrekende waarden in HbA1c (n = 200), bleven de effectgroottes van factoren 1 en 2 voor CVD-risico bij T2DM stabiel en significant in uni- en multivariabele analyses (Tabel S1).

Discussie

Deze studie toonde aan dat sommige acylcarnitines, d.w.z., C2, C4, C4-OH, C5DC, C6, C8, en C14DC in factor 1, en C10, C12, C14:1, C14, C14-OH, en C16-OH in factor 2, geassocieerd waren met het risico van CVD in T2DM en de associaties waren onafhankelijk van andere acylcarnitine factoren en traditionele CVD risicofactoren. Deze acylcarnitinemetabolieten geëxtraheerd in factor 1 en 2 waren voornamelijk korte en middellange keten acyl-carnitines.

De energieleveringsroute van lange keten vetzuuroxidatie in de mens is als volgt. In cellen combineert langketenig vetzuur (FA) met co-enzym A (COA) om langketenig acyl-co-enzym A (acyl-COA) te vormen (19). Carnitine combineert met de acylgroep van langketenig acyl-COA tot langketenig acylcarnitine door carnitinepalmitoyltransferase 1, dat zich in het buitenste mitochondriale membraan bevindt (20). Acylcarnitine wordt via carnitine acylcarnitine translocase (CATC) (21) naar de mitochondriën getransporteerd. Lange keten acylcarnitine wordt door carnitine palmitoyltransferase 2 in het binnenste mitochondriale membraan afgebroken tot lange keten acyl-CoA en carnitine (22). Het lange-keten acyl-COA wordt onder invloed van het dehydrogenase van het zeer lange-keten acyl-COA gedehydrogeneerd tot enoyl-COA (23). Enoyl-COA produceert 3-hydroxyacyl-CoA door hydratatie onder regulering van enoyl-CoA hydratase (23). 3-hydroxyacyl-CoA wordt gedehydrogeneerd door 3-hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase met lange keten om 3-ketoacyl-CoA te vormen (24). Het 3-ketoacyl-CoA ondergaat thiolyse door lange-keten letoacyl-CoA thiolase om een acetyl-CoA en een twee-koolstofketen verkort acyl-CoA te produceren (25). Het verkorte COA komt opnieuw in deze metabolische cyclus terecht, waarna het in de oxidatieroute van vetzuren met een korte keten terechtkomt. Vergeleken met lange-keten vetzuren kunnen middellange en korte-keten vetzuren direct de mitochondriën binnenkomen zonder hulp van CACT. Gelijkaardig aan lange-keten vetzuren, produceren middellange en korte-keten vetzuren verkort-COA vergeleken en acetyl-CoA onder de gecombineerde katalyse van sommige gelijkaardige enzymen. Het verkorte-COA komt opnieuw in de korte-keten-vetzuurcyclus terecht totdat het wordt omgezet in acetyl-CoA. Ten slotte levert acetyl-CoA dat bij de oxidatie van vetzuur ontstaat, energie door deel te nemen aan de tricarbonzuurcyclus (figuur 2A).

Verschillende studies meldden verminderde percentages van glucose-oxidatie, verhoogde oxidatiesnelheden van FA en myocardiaal zuurstofverbruik bij ob/ob en db/db muizen (26, 27). Een Amerikaans onderzoeksteam kwam tot een soortgelijke conclusie door herhaaldelijk metingen te verrichten bij muizen van verschillende weken oud (28). Het team vermoedde, door middel van verdere PCR-experimenten, dat de genexpressie die betrokken is bij FA-opname en -oxidatie uit balans was, wat ertoe leidde dat FA in cardiomyocyten de mitochondriale oxidatieve capaciteit overschreed. Bovendien vonden enkele andere onderzoeken dat cardiomyocyten van Zucker-ratten geen significant verhoogde oxidatie vertoonden in vergelijking met de verhoogde lange-keten FA in cardiomyocyten (29, 30). In een studie werden de menselijke FA-niveaus bepaald en werd vastgesteld dat, hoewel de FA-oxidatiesnelheid toenam, het percentage van de vetzuuroxidatiehoeveelheid lager was als gevolg van de toegenomen inname (31). Bovendien kan acyl-CoA zich ophopen in het cytoplasma als FA overbelast is (32). In overeenstemming hiermee bleek uit metabolomics analyse dat in vergelijking met niet-T2DM patiënten, de oxidatie van lange keten vetzuren bij T2DM patiënten onvolledig was, wat leidde tot significant verhoogde plasmawaarden van C6, C8, C10, C12, en C14 (33). Sommige onderzoekers toonden aan dat het lichaamsvetpercentage positief correleerde met serumspiegels van C2, C3, C4, C5, C6, C8:1, en C16:1 (34). Het was waarschijnlijk dat een hoger lichaamsvet correleerde met een onvolledige bèta-oxidatie van vetzuren, wat overwegend leidde tot hogere hoeveelheden korte- of middellange-keten acylcarnitine. Zij vonden ook dat serumspiegels van C2, C6, C8, C10, C12, C14, C14:1, en C14-OH verhoogd waren in prediabetische toestand (34).

Daarom vermoeden wij dat een licht verhoogde vetzuuroxidatiesnelheid van cardiomyocyten bij patiënten met T2DM niet in staat is om vrije FA’s met lange ketens, die zich in cardiomyocyten hebben opgehoopt, adequaat te oxideren. De opgehoopte vrije FA’s induceren cardiotoxiciteit. Anderzijds kan de oxidatieroute van middellange en korte-keten vetzuren worden geremd door de verhoogde oxidatiesnelheid van lange-keten vetzuren. Als gevolg van deze remming wordt het middellange- en korte-keten co-enzym A niet voldoende omgezet in acetyl-CoA. Tenslotte leidt de cumulatieve binding van carnitine aan acyl-CoA tot een toename van middellange- en korte-keten acylcarnitines (figuur 2B).

Er zijn in onze studie verschillende beperkingen opgemerkt. Ten eerste, onze studie was een cross-sectionele studie en kon geen oorzakelijk verband tussen de acylcarnitines en CVD in T2DM vast te stellen. Ten tweede, onze proefpersonen waren intramurale patiënten. Hun T2DM waren ernstiger dan de patiënten met T2DM in het algemeen. Onze bevindingen kunnen dus niet geëxtrapoleerd worden naar de algemene populatie van patiënten met T2DM. Ten derde, onze studie verzamelde geen dieetfactoren en dieetgewoonte kan een van de belangrijkste confounders zijn in onze analyse (35). We hadden echter zorgvuldig gecorrigeerd voor mogelijk verstorende effecten van andere acylcarnitine metabolieten, en demografische en klinische factoren met inbegrip van maar niet beperkt tot leeftijd, BMI, BP, HbA1c, en lipidenprofiel. Als “uitkomsten” van voeding, kan aanpassing voor deze acylcarnitine metabolieten en klinische factoren gedeeltelijk de verstorende effecten van voedingsgewoonten hebben verwijderd. Niettemin hebben wij erkend dat ondanks zorgvuldige correctie voor deze verstorende factoren, wij niet kunnen uitsluiten dat er niet-gecorrigeerde verstorende effecten waren. Daarom moeten onze resultaten met de nodige voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Ten vierde hebben wij de niveaus van insulineresistentie en acyl-CoA niet bepaald. Tenslotte ontbraken 200 gevallen van HbA1c bij onze proefpersonen. Deze associaties bleven echter stabiel na gemiddelde imputatie en meervoudige imputaties, wat suggereert dat een grote bias onwaarschijnlijk is.

Ons onderzoek had belangrijke implicaties voor de volksgezondheid. CVD is een veel voorkomende en ernstige complicatie bij T2DM, die significant geassocieerd is met vroegtijdig overlijden bij T2DM. Hoewel intensief beheer van hyperglykemie, hypertensie en abnormale lipiden het risico op CVD bij T2DM kan verminderen, blijft het resterende risico op CVD aanzienlijk hoog (36). Het is belangrijk om de mechanismen van CVD in T2DM beter te begrijpen. Onze studie geeft een nieuw inzicht in de routes van metabole stoornissen in T2DM naar CVD.

In conclusie, onze studie vond dat verhoogde plasmaspiegels van sommige acylcarnitinemetabolieten geëxtraheerd in factoren 1 en 2, d.w.z., C2, C4, C6, C8, C10, C12, C14, C14OH, en C14:1, geassocieerd waren met het risico van CVD bij Chinese patiënten met T2DM. Gezien de aard van de cross-sectionele studie, zijn prospectieve cohortstudies nodig om onze bevindingen in de toekomst te repliceren.

Data Availability Statement

De datasets die voor deze studie zijn gegenereerd, zijn te vinden in Metabolights, met de unieke identificatie MTBLS1427, toegankelijk via http://www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS1427.

Ethics Statement

De studies waarbij menselijke deelnemers betrokken waren, werden beoordeeld en goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Klinisch Onderzoek van het First Affiliated Hospital van de Liaoning Medical University. Schriftelijke geïnformeerde toestemming voor deelname was niet vereist voor deze studie in overeenstemming met de nationale wetgeving en de institutionele eisen.

Author Contributions

Z-ZF, SZ, en XY ontwierp de studie. SZ en X-FF analyseerden de gegevens en schreven het ontwerp. H-HL en MG verzamelden de gegevens. JL, Y-FC, en X-YS gaven kritisch commentaar en droegen bij aan het schrijven van dit manuscript. SZ, TH, J-XC, JZ, en DS namen deel aan de revisie van dit manuscript.

Funding

Dit werk werd ondersteund door het project voor het National Key Research and Development Program (2019YFA0802300), Liaoning Province Natural Science Foundation (20170540364), Algemeen wetenschappelijk onderzoeksproject van Liaoning Provincial Department of Education (L2015326), Liaoning Province Key Research and Development Program (2019JH8/10300036), het dertiende 5-jarenplan en TMU-talentenproject (11601501/2016KJ0313), geïndividualiseerde diagnose en behandeling van colorectale kanker (LNCCC-B05-2015), Stichting van Comité voor Wetenschap en Technologie van Tianjin (15JCYBJC54700), de China Postdoctoral Science Foundation (2016M590210), Tianjin Health Bureau Science Foundation Key Project (16KG154), en Tianjin Project of Thousand Youth Talents.

Conflict of Interest

De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd in afwezigheid van commerciële of financiële relaties die zouden kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Acknowledgments

De auteurs danken alle artsen, verpleegkundigen en onderzoeksmedewerkers van het LMUFAH in Jinzhou, voor hun deelname aan deze studie.

Supplementary Material

Het Supplementary Material voor dit artikel is online te vinden op: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fendo.2020.00212/full#supplementary-material