Frontiers in Pharmacology

Introduction

Biologisch actieve peptiden zijn de algemene term voor verschillende peptiden die bestaan uit verschillende samenstellingen en rangschikkingen van natuurlijke aminozuren. Het is bekend dat ze een verscheidenheid aan biologische functies bezitten, zoals antioxiderende, immuunbevorderende, hormoonmodulerende, antibacteriële, antitrombotische, antivirale en antihypertensieve activiteiten als gevolg van multifunctionele verbindingen die zijn afgeleid van dierlijke of plantaardige eiwitten (Wang et al., 2017). Bovendien hebben ze een hoge voedselveiligheid en hoge biologische beschikbaarheid, waardoor ze potentiële kandidaten zijn voor de ontwikkeling van functionele peptide geneesmiddelen en functionele levensmiddelenadditieven (Sarmadia en Ismaila, 2010).

Volgens een schatting van de Wereldgezondheidsorganisatie is CVD verantwoordelijk voor de sterfte van meer dan 17,5 miljoen mensen per jaar. Onder de belangrijke kenmerken van CVD is hypertensie een essentieel doelwit voor de preventie en behandeling van CVD (Celermajer et al., 2012). De momenteel gebruikte bloeddrukverlagende geneesmiddelen zoals captopril en enalapril zijn beperkt in hun gebruik vanwege bijwerkingen zoals hoest, huiduitslag en hoofdpijn (Yu et al., 2018). De steeds toenemende incidenties van CVD vereisen echter enkele nieuwe en veilige alternatieven, zoals van voedsel afgeleide actieve peptiden. De laatste tijd is er aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het identificeren en screenen van voedingscomponenten die de cardiovasculaire gezondheid positief beïnvloeden (Martinez-Maqueda et al., 2012; Liu et al., 2018). Onder dergelijke verbindingen hebben peptiden speciale aandacht gekregen vanwege hun anti-hypertensieve werking. Eerder werd de in vitro hypotensieve activiteit van peptiden voornamelijk bepaald door het meten van de remmende activiteit van angiotensineconverterend enzym (ACE), dat een dipeptidylcarboxypeptidase is dat zich op het celmembraan bevindt en hoge schade kan veroorzaken door het verstoren van de balans tussen de twee hormonale systemen die de bloeddruk en de vochtbalans reguleren (Clayton et al., 2015; Gebre et al., 2018). Bovendien werd bevestigd dat van voedsel afgeleide anti-hypertensieve peptiden een hypotensief effect uitoefenen op hypertensieve patiënten zonder enige toxiciteit of bijwerkingen (Martinez-Maqueda et al., 2012). De scheiding en zuivering van anti-hypertensieve peptiden uit voedseleiwitten zou een nieuwe richting bieden voor de ontwikkeling van natuurlijke anti-hypertensieve geneesmiddelen.

Ginkgo biloba zadenbronnen zijn over de hele wereld op grote schaal bestudeerd vanwege hun opmerkelijke biologische activiteit en farmacologische werking. Ginkgo zaad, als een traditionele Chinese geneeskunde, heeft een geschiedenis van meer dan 600 jaar, maar er is weinig bekend over de belangrijkste actieve bestanddelen. Slechts enkele studies rapporteerden de antioxiderende, anti-vermoeidheid en bacteriostatische effecten van G. biloba zaden eiwit isolaat (Lena en Philip, 2002; Huang et al., 2010). Wu et al. (2013) hydrolyseerden Ginkgo peptide met alcalase en pepsine om twee antioxidant peptiden te verkrijgen met een vermogen om vrije radicalen te scharrelen en de lipide peroxidatie te remmen. Ginkgo hypotensieve peptiden moeten echter verder worden onderzocht om hun onderliggende mechanismen voor een hogere werking te ontrafelen.

Hierin gebruikten we vier soorten proteasen om GPI te hydrolyseren, om een van de hydrolyzaten met een hoge ACE remmende activiteit te kiezen en ultrafiltratie uit te voeren om componenten met verschillende MW’s te verkrijgen. De effecten van MW’s op de ACE-remmende activiteit van GPH’s werden bestudeerd. Ook werd de relatie tussen aminozuursamenstelling en peptideactiviteit vastgesteld. De nieuw geëxtraheerde ACE remmende peptiden werden gezuiverd, geïdentificeerd en gesynthetiseerd; hun IC50 waarden werden getest en peptide remmingspatronen door Lineweaver-Burk plots werden onderzocht. We hebben ook het ACE-remmingsmechanisme opgehelderd met behulp van moleculaire docking-analyse.

Materialen en methoden

Materialen

De zaden van G. biloba L. werden gekocht in Linyi stad van de provincie Shandong, China. De zaden werden gepeld, gepeld en gebruikt voor verdere experimenten. Angiotensine-I-omzettingsenzym en hippuryl-l-histidyl-L-leucine (HHL), hippurinezuur werden gekocht bij Sigma (St. Louis, MO, Verenigde Staten) en Yuanye Bio-Technology (Shanghai, China), respectievelijk. Captopril werd verkregen van MedChem Express (NJ, Verenigde Staten).

Bereiding van GPI

De zaden van G. biloba L. werden gedroogd bij 45°C, vervolgens vermalen tot poeder en gezeefd door 80 mesh. Het poeder werd gevriesdroogd na een dephenolatie- en ontvettingsbehandeling. Het resulterende G. biloba-zadenpoeder werd opgelost in DW (1:20, w/v; pH 10,0). De bovenstaande suspensie werd gedurende 12 uur geroerd en geëxtraheerd, gevolgd door centrifugatie bij 10.000 g gedurende 30 minuten. Het verkregen supernatans werd op het iso-elektrische punt van ginkgo-eiwit pH 4,62 gebracht en gedurende 60 min geïncubeerd, gevolgd door verdere centrifugatie bij 10.000 g gedurende 30 min. Het verkregen neerslag werd opnieuw gesuspendeerd met gedestilleerd water, en de oplossing werd aangepast aan pH 7. Vervolgens werden de verkregen GPI gevriesdroogd tot het volgende gebruik.

Bereiding van Ginkgo Proteïne Hydrolyzaten (GPH’s)

Hiervoor werd 4% GPI oplossing bereid en afzonderlijk gehydrolyseerd met vier proteasen bij hun optimale hydrolyse omstandigheden gedurende 5 uur. De enzymdoseringen bedroegen 2.000 U. Na de hydrolyse werden de enzymen gedurende 10 min geïnactiveerd bij 90°C en werd de oplossing gedurende 30 min gecentrifugeerd bij 3.000 g om de afzonderlijke supernatanten te verkrijgen die werden verkregen uit vier enzymen.

Graad van hydrolyse

De graad van hydrolyse (DH) werd berekend door te verwijzen naar de methode van Kimatu et al. (2017) als volgt:

waarbij, B de hoeveelheid (mL) NaOH vertegenwoordigde die werd toegevoegd om de pH constant te houden tijdens het hydrolyseproces; Nb de molaire concentratie van NaOH-oplossing was; MP de massa (g) van het eiwit was; α de gemiddelde mate van dissociatie in eiwitsubstraten tijdens hydrolyse aanduidde; htot het totale aantal peptidebindingen in het eiwit was.

Isolatie en zuivering van ACE-remmend peptide

De ultrafiltratie van het monster werd uitgevoerd met behulp van MSC300 cup type ultrafilter (MoSu, Shanghai, China). Het monster werd toegevoegd vanuit de voedingspoort en de stikstoffles werd aangesloten op de slangfitting van de ultrafiltratiebeker. Daarna werd de ultrafiltratiebeker op de magneetroerder geplaatst die verbonden was met de stikstoffles met een druk van niet meer dan 0,22 MPa. De monsters werden achtereenvolgens door ultrafiltratiemembranen van 1, 3, 5 en 10 kDa geleid en er werden vier fracties verkregen (<1, 1-3, 3-5, en 5-10 kDa). De vier fracties werden verzameld, gevriesdroogd en vervolgens gebruikt om de ACE-remmende activiteit te testen. De componenten met een hogere ACE-activiteit werden geselecteerd voor verdere zuivering volgens de procedure van Zheng et al. (2017). Het gevriesdroogde hydrolysaat (200 mg) verkregen na ultrafiltratie werd geresuspendeerd in gezuiverd water om een eindconcentratie van 50 mg/mL te verkrijgen en onderworpen aan verdere zuivering met behulp van Sephadex G-15 gelfiltratiekolom (1,5 cm × 60 cm). De monsters werden gefilterd met een microfiltratiemembraan en de elutie werd uitgevoerd met gedestilleerd water met een debiet van 1 ml/min. Het monster werd gecontroleerd en gescheiden bij een golflengte van 220 nm met P270 semi-preparatieve HPLC (Aixin, Guangzhou, China). Fracties (7,5 mL elk) werden verzameld en gevriesdroogd.

Bepaling van ACE-remmende activiteit

Deze test werd uitgevoerd volgens de beschrijvingen worden gegeven door het vorige rapport van O’Loughlin et al. (2014) met enkele wijzigingen. Kort gezegd werden het substraat hippuryl-histidyl-leucine (HHL, 5 mM) en monsters gemengd in 0,1 M Na2 (pH 8,3) met 0,3 M natriumchloride. Daarna werden 50 μL monster en 150 μL substraat toegevoegd aan een centrifugebuis, gemengd en 5 min. in water van 37°C laten staan. Vervolgens werd de ACE-oplossing (50 mU/mL) toegevoegd en gedurende 45 minuten bij 37 °C geïncubeerd. De reactie werd beëindigd door toevoeging van 250 μl 1M HCl en de oplossing werd gefiltreerd door een nylon spuitfilter van 0,45 μM alvorens te worden geanalyseerd met RP-HPLC (Waters, Milford, MA, Verenigde Staten) op een Inertsil ODS-3 (250 × 4,6 mm, 5 μm deeltjesgrootte). De mobiele fase bestond uit gedestilleerd water: acetonitril = 75:25 (V/V, met 0,1% TFA) met een stroomsnelheid van 0,5 mL/min en detectie bij 228 nm. Captopril werd als controle gebruikt en de remmende activiteit (%) werd als volgt bepaald:

waarbij A de piekoppervlakte van hippurinezuur met het monster was, B zonder het monster.

LC-MS/MS-analyse en identificatie van gezuiverde peptidesequenties

De gezuiverde monsters werden geanalyseerd met Q Exactive (Thermo Fisher Scientific, MA, Verenigde Staten) met behulp van een Easy-nLC 1000 (Thermo Fisher Scientific, MA, Verenigde Staten). Het monster werd ontzout en gelyofiliseerd, gereconstitueerd in een 0,1% FA-oplossing en bij -20°C bewaard tot het volgende gebruik. De twee mobiele fasen waren als volgt: mobiele fase A was een waterige oplossing van 0,1% mierenzuur, en mobiele fase B was een 0,1% mierenzuur waterige oplossing van acetonitril (acetonitril was 84%). Na equilibratie van de kolom met 95% van de A-oplossing werd het monster uit de autosampler op de Trap-kolom geladen. De massa/ladingsverhouding van de fragmenten van peptiden werd als volgt verzameld: na elke volledige scan werden in totaal 20 fragmentpatronen verkregen. Het ruwe bestand van de massaspectrometrietest werd doorzocht met behulp van Mascot 2.2 software voor de overeenkomstige database.

Synthese van Peptiden

Potentiële ACE-remmer peptiden geïdentificeerd door LC-MS/MS werden gesynthetiseerd bij GL Biochem (Shanghai, China). De zuiverheid van de synthetische peptiden werd verder bevestigd door HPLC die groter was dan 95%.

Kinetiek van ACE-remming

Het kinetische remmingsmodel van G. biloba peptide werd getest volgens de methode van Lin et al. (2017). Kort gezegd werden verschillende concentraties substraat HHL (0,5, 1, 2, en 5 mM) toegestaan om te reageren met ACE. De Lineweaver-Burk plot was gebaseerd op de reciproke van de reactiesnelheid (1/v) en de substraatconcentratie (1/). De intervallen op de X- en Y-as vertegenwoordigden de reciprocalen van Km en Vmax, respectievelijk.

Docking Analyse

Voor deze, drie-dimensionale structuur bestand van ACE eiwit (PDB ID: 1O8A) van RCSB Protein Data Bank (PDB1) werd gedownload. De drie-dimensionale structuur van G. biloba peptiden werd getekend met behulp van de moleculaire simulatie software Discovery Studio 3.5. De hydro verwerking werd uitgevoerd en de energie werd geminimaliseerd door het CHARMM programma. Bovendien werd Zn2+ in het ACE model behouden. De software DS 3.5 gaf het docking-resultaat een score volgens zijn eigen scoringsfunctie, gebaseerd op de scores en de gecombineerde vrije energie van elk resultaat. Uit alle resultaten werd een beter overeenstemmend resultaat geselecteerd.

Statistische analyse

One-way ANOVA, gevolgd door Duncan’s multiple-range tests met SPSS Statistics 20.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL, Verenigde Staten) werd gebruikt voor gegevensanalyse met een significant verschil (P ≤ 0,05).

Resultaten

DH en ACE-remmende activiteit van GPHs

Zoals kan worden gezien in figuur 1A, werd de DH verlengd met de tijd tijdens het gehele hydrolyseproces. DH nam snel toe vóór het interval van 2 uur, daarna vertraagde de toename geleidelijk met de tijd. In het algemeen was de snelheid van hydrolyse hoog gedurende de eerste 1 uur, die daarna werd verminderd of constant werd. Van de vier proteasen had alcalase de hoogste DH die 14.7% bereikte na 5 uur, gevolgd door trypsine (8.91%) en dispase (6.91%). De laagste DH werd waargenomen bij flavourzyme, dat slechts 3,23% bedroeg na 5 uur. Deze resultaten impliceerden dat GPI door proteasen op verschillende plaatsen werd gesplitst, wat resulteerde in eiwithydrolyzaten met verschillende peptidensamenstellingen.

Wat betreft de ACE-remmende activiteit van de vier protease hydrolyzaten, nam de activiteit toe met DH in de loop van de tijdsperiode. Zoals blijkt uit Figuur 1B, waren de remmende activiteiten van alcalase, trypsine, dispase, en flavourzyme na 5 uur respectievelijk 62,70, 39,81, 48,39, en 25,95%. Als gevolg van hun verschillende splitsingsplaatsen werden verschillende peptiden met uiteenlopende ACE-remmende activiteiten verkregen. Onder hen was de activiteit van het alkalische hydrolyzaat relatief sterker, wat aangeeft dat alkalische protease effectief een hydrolyzaat kan produceren met een hogere ACE remmende werking.

ACE remmende activiteit van GPH’s en membraanfractie

De ACE remmende activiteit van de GPH’s en de resulterende fracties was significant afhankelijk van MW, zoals blijkt uit figuur 1C,D. Bij 1 mg/ml monsterconcentraties nam de remmende activiteit van ACE geleidelijk toe naarmate de MW van de componenten afnam. De remmende activiteit bij 3-5 en 5-10 kDa bedroeg respectievelijk 44,94% (IC50 = 1,257 mg/mL) en 44,04% (IC50 = 1,765 mg/mL). Vervolgens nam de activiteit geleidelijk toe met de lagere MW en bereikte het hoogste niveau (69,86%; IC50 = 0,224 mg/mL) bij <1 kDa.

Purificatie van Ginkgo Peptiden

Alcalase wordt vaak gebruikt voor de bereiding van actieve peptiden vanwege zijn brede specificiteit en sterke vermogen om eiwitten af te breken. Uit de ultrafiltratiebehandeling bleek dat de ACE-remmende activiteit verbeterde naarmate de MW van het polypeptide afnam. Daarom werd het peptide van de <1 kDa-fractie verder gezuiverd met Sephadex G-15-kolom. Uit figuur 2A blijkt dat Sephadex G-15 in drie componenten (A1, A2 en A3) werd verdeeld. De drie componenten werden verzameld en gelyofiliseerd, en hun ACE-remmende activiteiten werden gemeten. De resultaten worden getoond in figuur 2B. De ACE-remmende activiteiten van de drie componenten (1 mg/mL) bedroegen respectievelijk 64,08, 58,55, en 74,96%. Daarom werd de meest actieve A3-component geselecteerd voor structurele identificatie in de volgende stap.

Identificatie van Ginkgo Peptiden en Peptide Synthese

Om de potentiële ACE remmende peptide te identificeren, werd de meest actieve component A3 geanalyseerd door LC-MS/MS (Supplementaire Tabel S1). Op basis hiervan werden drie peptiden van de A3 component gescreend en hun aminozuursequenties waren Thr-Asn-Leu-Asp-Trp-Tyr (TNLDWY), Arg-Ala-Asp-Phe-Tyr (RADFY), en Arg-Val-Phe-Asp-Gly-Ala-Val (RVFDGAV) (figuur 3). De geïdentificeerde sequenties van deze peptiden bestonden uit 5-7 aminozuurresiduen. Om de ACE-remmende activiteit van deze drie peptidefracties te identificeren, werden de peptiden chemisch gesynthetiseerd. De verkregen gesynthetiseerde peptiden werden geïdentificeerd door massaspectrometrie (Figuren 4A-C). Uit de resultaten bleek dat de IC50-waarden van TNLDWY, RADFY en RVFDGAV respectievelijk 1,932, 1,35 en 1,006 mM bedroegen (figuur 4D).

Remmingsmechanisme van Ginkgo Peptiden

De remmingsmodus van G. biloba peptide werd geanalyseerd aan de hand van de Lineweaver-Burk plot. Zoals uit figuur 5 blijkt, veranderden zowel Vmax als Km wanneer het Ginkgo-peptide TNLDWY werd toegevoegd. Vmax nam toe met de toenemende peptideconcentratie, terwijl Km niet significant veranderde met de peptideconcentratie, wat erop wijst dat het remmingspatroon een niet-competitieve remmingswijze kan zijn. Voor RADFY en RVFDGAV veranderde Vmax niet significant met de concentratie; terwijl Km toenam met de toenemende peptideconcentratie, wat erop wijst dat beide peptiden competitieve remmers zijn, die zich kunnen binden aan de actieve plaatsen van ACE, waardoor de binding van ACE aan het substraat wordt geblokkeerd en de activiteit van ACE wordt geremd.

Molecular Docking Simulation Between Peptides and ACE

In deze studie werd de interactie van drie peptiden met ACE geëvalueerd. De resultaten toonden aan dat alle peptiden zich goed konden binden aan ACE en een stabiel complex konden vormen, wat wijst op hun gebruik als een potentiële ACE remmer. De score van – Cdocker Interactie Energie werd getoond in Tabel 1. De scores van TNLDWY, RADFY, en RVFDGAV fracties waren respectievelijk 102.995, 105.335, en 117.706. Moleculaire dockingresultaten werden getoond in figuur 6 en tabel 2. De optimale docking positie van TNLDWY kan zes waterstofbruggen vormen, waaronder waterstofbruggen met Ala 354, Tyr523 in S1 actieve zak, His353, His513 in S2 actieve zak, en Zn2+ residuen en het bleek stabiel te binden met al deze residuen. Dit kan verband houden met de sterke ACE-remmende activiteit van het peptide. Uit figuur 6B bleek dat RADFY zeven waterstofbruggen kan vormen met aminozuurresiduen, en intermoleculaire waterstofbruggen met de residuen Gln281, His353, His513, en Tyr520 in de S2 actieve zak. De vorming van deze waterstofbruggen stabiliseerde het enzym-peptide complex aanzienlijk. Bovendien vormde RADFY een ionische binding met Zn2+, conjugaatkrachten met Val380, His383, Glu384, His387, Glu411, Lys511, en Tyr523, alsmede van der Waals krachten met aminozuur residu Trp356. Deze interacties kunnen resulteren in de vervorming van het Zn2+ ligand en de inactivatie van ACE. Vergeleken met TNLDWY en RADFY, kan RVFDGAV vier waterstofbruggen vormen met aminozuur residuen, die stabiel verbonden waren met ALA354, TYR523 in de S1 actieve zak, en Glu162 in de S1′ actieve zak. RVFDGAV kon echter ionische bindingen vormen met Zn2+, wat direct leidde tot de deactivering van ACE moleculen. Bovendien vormde het een conjugaat met de aminozuur residuen zoals Glu162, His353, Glu376, Val379, His387, Phe391, His410, Phe457, en Phe527 (figuur 6C).

Discussie

In de afgelopen jaren hebben voedsel-afgeleide ACE remmende peptiden van plantaardige eiwitten meer en meer de aandacht getrokken vanwege hun minder bijwerkingen. In deze studie werden alcalase, dispase, trypsine, en flavourzyme gebruikt om Ginkgo eiwit te hydrolyseren. De DH en ACE remmende activiteit van het Ginkgo eiwit hydrolyzaat verkregen door hydrolyse van alcalase werden als de hoogste gerapporteerd. Het hydrolyseproces vond snel plaats tijdens de beginfase, wat resulteerde in hydrolyse van veel peptidebindingen, daarna werd de snelheid van hydrolyse vertraagd als gevolg van de geleidelijke vermindering van de beschikbaarheid van substraten voor hydrolyse (Ketnawa et al., 2017; Hu et al., 2018; Wei et al., 2018). Deze bevindingen waren consistent met het eerdere rapport van koolzaadproteïnehydrolyzaten met effectieve ACE-remmende werking wanneer gehydrolyseerd met alcalase (He et al., 2013).

Angiotensineconverterend enzym is een multifunctioneel extracellulair dipeptidase dat in verschillende weefsels aanwezig is. De remmende activiteit van ACE verlaagt de bloeddruk door de productie van angiotensine II te verminderen en de vernietiging van kinines te verminderen (Zheng et al., 2017). De ACE-remmende activiteit van het hydrolyzaat was gerelateerd aan de molecuulgewichtsverdeling. De ultrafiltratie werd gebruikt om het Ginkgo hydrolyzaat te scheiden in vijf componenten. Bij een molecuulgewicht <1 kDa, was de ACE remmende activiteit van Ginkgo hydrolyzaat het hoogst. Deze observatie was in overeenstemming met eerdere studies die de hogere ACE activiteit van lage MW polypeptiden rapporteerden (Wang et al., 2015; Ola et al., 2017). Bovendien bevestigden Silvestre et al. (2012) dat de ultrafiltratiebehandeling peptiden (AAA) op de C-terminale positie kan vasthouden om de ACE-remmende activiteit te bevorderen.

Om het zeer actieve ACE-remmende peptide verder te zuiveren, werd de Ginkgo-component (<1 kDa) gescheiden door gelfiltratiechromatografie, en werd de aminozuursequentie geïdentificeerd met behulp van LC-MS/MS. Aldus werden drie nieuwe ACE-remmende peptiden verkregen: TNLDWY (1,932 mM), RADFY (1,35 mM), en RVFDGAV (1,006 mM) die een sterke ACE-remmende activiteit vertoonden. Volgens het rapport van Hernández-Ledesma et al. (2011), waren de meeste ACE remmende peptiden korte sequenties bestaande uit 2-12 aminozuren. Bovendien was de activiteit van het ACE-remmende peptide sterk gerelateerd aan de aanwezigheid van het C-terminale aminozuur, het aromatische aminozuur, en het hydrofobe aminozuur. Zo versterkte de aanwezigheid van het aromatische aminozuur (Tyr, Phe, en Trp) de activiteit van het ACE-remmende peptide aanzienlijk. Bovendien is ook bekend dat Arg een belangrijke rol speelt in het remmende peptide. Toopcham et al. (2017) toonden aan dat de remmende activiteit van het polypeptide significant werd verminderd na verwijdering van Arg. Bovendien bewezen Liu et al. (2018) dat aminozuur zoals Leu in het peptide de ACE-remmende activiteit aanzienlijk beïnvloedde, ongeacht de positie ervan aan de C-terminus of de N-terminus. Soortgelijke resultaten werden ook gerapporteerd door Lee en Hur (2017). Deze studies rapporteerden de KPLL, VLAQYK, en DLP peptiden van verschillende eiwitten materialen met een merkbare ACE remmende activiteit in aanwezigheid van hydrofoob aminozuur (Leu). In onze studie bevond Tyr zich aan de C-terminus van TNLDWY en RADFY. Bovendien bevatten de twee peptiden van RADFY en RVFDGAV Arg aan de N-terminus, en het gehalte aan hydrofobe aminozuren in de drie peptiden was hoger. Bovenal kwamen de peptidefragmenten overeen met de structurele kenmerken van ACE-remmende peptiden.

De wijze van remming van ACE-remmende peptiden werd in het algemeen niet-competitief, competitief, en gemengd waargenomen. Voor korte peptiden (2-12 aminozuren), waren de meeste van hen competitieve remmers en zij hechtten zich aan het ACE enzym om de binding van het substraat HHL te verhinderen. Een soortgelijke studie van Lin et al. (2017) toonde aan dat de peptiden KYIPIQ en LPLPLLL uit Qula caseïne een competitieve remmingsmodus vertoonden. Bij niet-competitieve remmers binden ze zich echter aan andere plaatsen dan de substraatbindingsplaats van het enzym en beïnvloeden ze uiteindelijk de binding van het substraat aan het enzym. Vergelijkbare patronen werden waargenomen in het geval van voedingsgerelateerde remmende peptiden, zoals PFPGPIPN van Qula caseïne, en het hazelnootpeptide YLVR (Lin et al., 2017; Liu et al., 2018). In deze competitieve modus vormden ACE, substraat en peptide een enzym-substraat-remmer complex, dat verdere afgifte van het product verhinderde en resulteerde in een afname van de Vmax (Barbana en Boye, 2011).

Bestudering van het moleculaire interactiemechanisme tussen ACE en remmende peptiden is nuttig voor het screenen en ontwerpen van nieuwe ACE-remmende peptiden. Er is echter onvoldoende informatie beschikbaar over moleculaire interacties van remmende peptiden. Molecular docking is gebaseerd op het “slot en sleutel principe” van liganden en receptoren, waarbij de interactie tussen kleine molecule liganden en receptor biomacromoleculen wordt gesimuleerd. De wijze van binding en de affiniteit tussen beide maakt de virtuele screening van geneesmiddelen mogelijk. ACE is een Zn2+-afhankelijk carboxydipeptide enzym, waarbij Zn2+ een belangrijk deel uitmaakt van het ACE actieve centrum (Pina en Roque, 2009). Volgens eerder gerapporteerde gegevens (Pan et al., 2012), werden de belangrijkste interactieresiduen op de actieve site van ACE verdeeld in drie actieve pockets (S1, S2, en S1′). S1 (Ala354, Glu384 en Tyr523); S2 (Gln281, His353, Lys511, His513 en Tyr520); en S1′ (Glu162 residu). Op de actieve plaats van ACE vormden twee histidines (His383 en His387) samen met Glu 411 een Zn2+ ligand. Er is gerapporteerd dat de remming van peptide-geïnduceerde ACE-activiteit kan worden bereikt door de combinatie van waterstofbrugstabiele enzym-peptidecomplexen (Fu et al., 2017). Daarnaast kan de vorming van van der Waals krachten met aminozuur residuen zoals His353, Ala 354, Ser355, Glu384, His513, en Pro519, conjugaat interactie met Tyr360 en niet-covalente interacties met Glu384, Arg522 ook bijdragen aan de stabiliteit van enzym peptide complexen. De aanwezigheid van deze krachten zal de structuur van het enzym-peptide complex stabieler maken, meer bevorderlijk voor remming van ACE activiteit, wat de reden kan zijn van de sterke ACE remmende activiteit van TNLDWY, RADFY, en RVFDGAV.

Conclusie

In deze studie werden G. biloba zaden gebruikt om potentiële ACE remmende peptiden te bereiden. GPH’s bereid uit verschillende proteasen vertoonden verschillende ACE remmende activiteiten in vitro. De hoogste DH en in vitro ACE remmende activiteiten werden waargenomen in GPH’s bereid uit alcalase. De componenten verkregen door ultrafiltratie met alcalase toonden aan dat de kleinere MW peptiden de sterkere ACE inhibitoire activiteit gaven. Drie potentiële ACE remmende peptiden (TNLDWY, RADFY, en RVFDGAV) werden verkregen uit de peptidefractie (<1 kDa) door LC-MS/MS. RVFDGAV vertoonde de hoogste ACE remmende activiteit met een IC50 waarde van 1,006 mM en bleek een competitieve remmer te zijn. Moleculaire docking resultaten toonden aan dat de peptiden zich stevig konden binden aan ACE en verder interageerden met aminozuur residuen in de actieve ACE site. Onze resultaten gaven aan dat de peptiden verkregen door enzymatische hydrolyse van alcalase een effectieve ACE remmende activiteit vertoonden in vitro, waardoor ze potentiële kandidaten zijn voor de ontwikkeling van functionele voedingsmiddelen of anti-hypertensiva in de toekomst.

Bijdragen van auteurs

F-FM, HW, C-KW, en KT waren betrokken bij het ontwerp van het project, voerden de meeste experimenten uit, en stelden het manuscript op. Z-JW en LJ hebben bijgedragen aan het experimentele ontwerp, de manuscript voorbereiding, en het indienen. Alle auteurs namen deel aan het schrijven van het manuscript en/of reviseerden het kritisch op belangrijke intellectuele inhoud.

Funding

Deze studie werd ondersteund door de Grote Projecten van Wetenschap en Technologie in de provincie Anhui (17030701024, 17030701058, en 17030701028) en Key Research and Development Project van de provincie Anhui (1704g07020110 en 1804b06020347).

Conflict of Interest Statement

HW was werkzaam bij Anhui Habopharmqnceutical Co, Ltd. Z-JW was in dienst van Anhui Qiangwang Seasoning Food Co, Ltd.

De overige auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd in afwezigheid van enige commerciële of financiële relaties die zouden kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Aanvullend materiaal

Het aanvullend materiaal voor dit artikel is online te vinden op: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2018.01579/full#supplementary-material

Footnotes

1. ^ http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do