Het AP-3 adaptor complex medieert het sorteren van gist en zoogdier PQ-loop-familie basische aminozuurtransporters naar het vacuolaire/lysosomale membraanfamilie basische aminozuurtransporters naar het vacuolaire/lysosomale membraan
- Het Ypq1 eiwit kan het vacuolaire membraan bereiken via het ALP of endosomale pad
- Een zuur dileucinemotief bevordert de sortering van Ypq1 naar het ALP-pad
- Ypq2 en Ypq3 ook verkeer naar de vacuole via de ALP pathway, maar ondergaan verschillende lotgevallen wanneer de ALP pathway is niet functioneel
- PQLC2 geproduceerd in gist gebruikt de ALP pathway en zijn dileucine motief om het vacuolaire membraan te bereiken
- Depletie van een AP-3 subeenheid belemmert de levering van PQLC2 aan lysosomen
Het Ypq1 eiwit kan het vacuolaire membraan bereiken via het ALP of endosomale pad
Nadat we onlangs gemeld hebben dat een Ypq1-GFP fusie-eiwit lokaliseert naar het vacuolaire membraan6, probeerden we te bepalen via welke route Ypq1 dit compartiment bereikt. Vacuolaire membraaneiwitten kunnen de vacuole bereiken via twee verschillende routes: de ALP (alkalische fosfatase) en de CPY (carboxypeptidase Y) route, de laatste waarbij de eiwitten via endosomen passeren (Fig. 2A). Om te testen of Ypq1 de CPY route volgt, onderzochten we zijn intracellulaire distributie in een pep12Δ mutant die een t-SNARE mist die betrokken is bij de fusie van blaasjes met het late endosoom13. In deze mutant werd Ypq1-GFP uitsluitend gevonden in de vacuolaire membraan (Fig. 2B). In een vps27Δ mutant die een component van het endosomale ESCRT-0 complex mist, zijn membraaneiwitten die via endosomen worden getransporteerd typisch gestapeld in duidelijk zichtbare klasse E compartimenten die overeenkomen met abnormaal vergrote endosomen, maar het Ypq1-GFP-eiwit was normaal gericht op de vacuolaire membraan in deze mutant (gegevens niet weergegeven). Deze resultaten tonen aan dat Ypq1 geen functionele CPY-route nodig heeft om de vacuole te bereiken. Vervolgens hebben we getest of Ypq1 de vacuolaire membraan bereikt via de ALP pathway. Het is goed gedocumenteerd dat deze route het AP-3 adaptor complex vereist, waarvan wordt aangenomen dat het actief is in de trans Golgi om ladingseiwitten te sorteren in vesikels die vervolgens samensmelten met de endosomen. Dit complex is een heterotetrameer bestaande uit twee grote subeenheden (β3a en δ), een middelgrote subeenheid (μ3a) en een kleine subeenheid (σ3) en de afwezigheid van een van deze subeenheden resulteert in een gebrekkig AP-3 complex14. Daarom isoleerden wij twee AP-3-deficiënte stammen, apm3Δ (zonder subeenheid μ3a) en apl5Δ (zonder subeenheid δ). In deze mutanten werd Ypq1-GFP gevonden op de vacuolaire membraan en in kleine punctate structuren gemakkelijk gelabeld met FM4-64 en niet waargenomen in wild-type cellen (Fig. 2B). In amp3Δ en apl5Δ mutant cellen ook het tot expressie brengen van een functionele Sec7-mCherry naar de Golgi labelen, een hoog percentage van deze punctaten structuren waren versierd met Sec7-mCherry (Fig. 2C) (voor een kwantificering van de sublokalisatie patronen, zie Supplementary Fig. S1 online). Deze resultaten geven aan dat wanneer de ALP pathway deficiënt is, Ypq1 de neiging heeft te accumuleren in de Golgi terwijl een significante fractie van het eiwit het vacuolaire membraan bereikt via een andere pathway. Om te testen of dit laatste de CPY route is, bepaalden we de locatie van Ypq1-GFP in apm3Δ pep12Δ en apl5Δ pep12Δ dubbele mutanten (Fig. 2B). Interessant is dat de overdracht van Ypq1-GFP naar de vacuole grotendeels was verstoord in deze stammen en dat het eiwit meestal verspreid in het cytosol werd aangetroffen, alsook in punctaten gelabeld met Sec7-mCherry (Fig. 2B,C) (voor een kwantificering van de sublokalisatiepatronen, zie Supplementary Fig. S1 online). De vacuole in deze dubbele mutanten kon normaal gelabeld worden met FM4-64. Deze resultaten tonen aan dat Ypq1 kan worden gesorteerd op de vacuolaire membraan via zowel de ALP en de CPY paden. In wild-type cellen gebruikt het voornamelijk de ALP pathway, maar wanneer deze pathway deficiënt is, verblijft het eiwit langer in de Golgi maar kan het nog steeds efficiënt de vacuolaire membraan bereiken via de CPY pathway. Wanneer zowel de ALP als de CPY pathways deficiënt zijn, is een kleine fractie van Ypq1-GFP detecteerbaar aan het vacuolaire membraan, wat suggereert dat het eiwit nog een andere pathway kan gebruiken, maar één die veel minder efficiënt is in het juist richten van Ypq1 naar de vacuole.
Ypq1 kan het vacuolaire membraan bereiken via de ALP- of de CPY-route.
(A) De twee belangrijkste transportroutes van de trans-golgi naar de vacuole in de gist Saccharomyces cerevisiae. MVB: multivesicular body (B) Stammen 23344c (ura3), EN046 (pep12∆ ura3), LL057 (apm3∆ ura3), LL061 (apl5∆ ura3), LL088 (apm3∆ pep12∆ ura3) en LL041 (apl5∆ pep12∆ ura3), getransformeerd met het pLL063 (YPQ1-GFP URA3) plasmide, werden gekweekt op een glucose-ammonium medium. Cellen mochten FM4-64 internaliseren gedurende 15 min om de vacuole te labelen voor de beeldvorming. (C) Stammen GC004 (ura3 leu2), BOA003 (apm3∆ ura3 leu2), BOA005 (apl5∆ ura3 leu2), BOA007 (apm3∆ pep12∆ ura3 leu2), BOA008 (apl5∆ pep12∆ ura3) getransformeerd met de pLL063 (YPQ1-GFP URA3) of pBOA010 (SEC7-mCherry LEU2) plasmiden werden gekweekt op een glucose-ammonium medium. Cellen mochten CMAC internaliseren gedurende 30 min om het vacuolaire lumen te labelen voor de beeldvorming. Schaal bar: 10 pm. Een kwantificering van de sublokalisatie patronen van Ypq1-GFP (B) en Ypq1-GFP-Sec7-mCherry (C) is te vinden als Supplementary Figure S1 online.
Een zuur dileucinemotief bevordert de sortering van Ypq1 naar het ALP-pad
AP-3-afhankelijke sortering van transmembraaneiwitten wordt vaak gemedieerd door tyrosine-gebaseerde (YXXØ) of dileucine-gebaseerde (XXXL) signalen (waarbij Ø een volumineus hydrofoob residu is en X een willekeurig aminozuur)15. Ypq1 bevat een EQQPLL-sequentie in zijn tweede grote lus die naar het cytosol is gericht. De dileucine van dit motief wordt voorafgegaan door een proline, een kenmerk dat bij verscheidene ladingen via de ALP-keten is waargenomen16. Een dileucine-naar-dialanine substitutiemutant van Ypq1 (Ypq1LL>AA) bleek gericht te zijn op de vacuolaire membraan, maar ook op het versieren van punctaten (Fig. 3A). Dit fenotype lijkt op dat wat is waargenomen voor wild-type Ypq1 in AP-3-deficiënte cellen, wat suggereert dat Ypq1L>AA de vacuole bereikt via de alternatieve CPY-route. Ter ondersteuning van deze visie, Ypq1LL>AA geproduceerd in een pep12Δ mutant kon niet worden gericht op de vacuole en werd gemist in cytosolische punctate structuren zoals waargenomen voor Ypq1 in de apm3Δ pep12Δ en apl5Δ pep12Δ mutanten (Fig. 3A). Deze resultaten tonen aan dat het zure dileucinemotief van Ypq1 vereist is voor zijn AP-3-afhankelijke sortering naar de vacuole, maar niet voor zijn Pep12-afhankelijke aflevering aan de vacuole. Deze conclusies komen overeen met de resultaten van een recente studie van S. Emr en collega’s die tijdens de voorbereiding van dit manuscript is gepubliceerd17. Vervolgens hebben we in meer detail onderzocht hoe de Ypq1LL>AA-variant naar de vacuole wordt getransporteerd. Eerst dachten we dat dit mutante eiwit, omdat het de ALP route niet gebruikt, eerst naar de plasmamembraan zou kunnen worden gemissorteerd voordat het een snelle endocytose ondergaat en vervolgens door Pep12 naar de vacuole membraan wordt getransporteerd. Dit model werd niet ondersteund door onze waarnemingen: het Ypq1LL>AA accumuleerde niet aan het celoppervlak in een end3Δ mutant die defect is in endocytose, wat erop wijst dat het de vacuole bereikt via de CPY-route (Fig. 3B). We stelden vervolgens de hypothese dat levering van Ypq1LL>AA aan de vacuole zijn sortering van de Golgi naar endosomen zou kunnen inhouden dankzij alternatieve adaptors zoals het AP-1 complex of de monomere GGA-eiwitten. We brachten het Ypq1LL>AA mutant eiwit tot expressie in gga1Δ gga2Δ cellen, die de overbodige Gga1 en Gga2 adaptors missen en in amp1Δ, amp2Δ en apl4Δ cellen, die subunits van het AP-1 complex missen. In elk van deze mutanten bleek het eiwit nog steeds de vacuole te bereiken (Fig. 3B). Deze waarnemingen suggereren ofwel dat deze adapters redundant optreden om het sorteren van Ypq1LL>AA naar de vacuole via de CPY-route te bevorderen, ofwel dat andere adapters betrokken zijn.
Een zuur-dileucinemotief bevordert de sortering van Ypq1 naar de ALP-pathway.
(A) Stammen 23344c (ura3) en EN046 (pep12∆ ura3) getransformeerd met het pLL034 (YPQ1LL>AA-GFP URA3) plasmide werden gekweekt op een glucose-ammonium medium. Cellen werden toegestaan om FM4-64 internaliseren gedurende 15 min naar de vacuole label voor beeldvorming. (B) Stammen 23344c (ura3), LL115 (end3∆ ura3), JA445 (gga1∆ gga2∆ ura3), LL078 (apm1∆ ura3) en LL066 (apl4∆ ura3), getransformeerd met de pLL063 (YPQ1-GFP URA3) of pLL034 (YPQ1LL>AA-GFP URA3) plasmiden, werden gekweekt op een glucose-ammonium medium. Cellen werden toegestaan om FM4-64 internaliseren gedurende 15 min naar de vacuole label voor beeldvorming. Schaal bar: 10 pm.
Ypq2 en Ypq3 ook verkeer naar de vacuole via de ALP pathway, maar ondergaan verschillende lotgevallen wanneer de ALP pathway is niet functioneel
De Ypq2 en Ypq3 eiwitten, zeer vergelijkbaar in volgorde aan Ypq1, ook lokaliseren naar de vacuolaire membraan6 en zowel bevatten ook een zure dileucine in de tweede cytosolische lus. De resultaten van Fig. 4A laten zien dat Ypq2 zich normaal naar de vacuole verplaatst in een pep12Δ mutant. Dit bleek ook waar te zijn in apm3Δ en apl5Δ mutanten die defect zijn in de ALP pathway, waar het bovendien punctate structuren bleek te versieren, een fenotype dat niet werd waargenomen in wild-type cellen. Een groot deel van deze punctate structuren waren ook gelabeld met Sec7-mCherry (Fig. 4B), wat aangeeft dat Ypq2, net als Ypq1, de neiging heeft om te accumuleren in de Golgi wanneer de ALP pathway deficiënt is. In zowel apm3Δ pep12Δ en apl5Δ pep12Δ dubbelmutanten, mislokaliseerde Ypq2 grotendeels naar kleine gepuncteerde cytosolische structuren, waarvan vele waren versierd met Sec7-mCherry, hoewel een fractie van het eiwit goed leek afgeleverd aan de vacuole (Fig. 4A,B) (voor een kwantificering van de sublokalisatiepatronen, zie Supplementary Fig. S2 online). Deze resultaten geven aan dat Ypq2 zich gedraagt als Ypq1 in die zin dat het voornamelijk de ALP route gebruikt om de vacuole te bereiken. Ze tonen ook aan dat wanneer deze route defect is, Ypq2 langer in de Golgi verblijft maar toch aan het vacuolaire membraan kan worden afgeleverd, hoofdzakelijk via de CPY-route.
Ypq2 kan het vacuolaire membraan bereiken via de ALP- of de CPY-route.
(A) Stammen 23344c (ura3), EN046 (pep12∆ ura3), LL057 (apm3∆ ura3), LL061 (apl5∆ ura3), LL088 (apm3∆ pep12∆ ura3) en LL041 (apl5∆ pep12∆ ura3), getransformeerd met het pLL161 (YPQ2-GFP URA3) plasmide, werden gekweekt op een glucose-ammonium medium. Cellen mochten FM4-64 internaliseren gedurende 15 min om de vacuole te labelen voor de beeldvorming. (B) Stammen GC004 (ura3 leu2), BOA003 (apm3∆ ura3 leu2), BOA005 (apl5∆ ura3 leu2), BOA007 (apm3∆ pep12∆ ura3 leu2), BOA008 (apl5∆ pep12∆ ura3) getransformeerd met de pLL161 (YPQ2-GFP URA3) of pBOA010 (SEC7-mCherry LEU2) plasmiden werden gekweekt op een glucose-ammonium medium. Cellen mochten CMAC internaliseren gedurende 30 min om het vacuolaire lumen te labelen voor de beeldvorming. Schaal bar: 10 pm. Een kwantificering van de sublokalisatie patronen van Ypq2-GFP (A) en Ypq1-GFP-Sec7-mCherry (B) is te vinden als Supplementary Figure S2 online.
Als expressie van een YPQ3-GFP-gen onder de controle van de natuurlijke promotor van YPQ3 leverde een nauwelijks detecteerbaar niveau van Ypq3-GFP, hebben we het fusiegen uitgedrukt onder de controle van een galactose-induceerbare promotor. Om het risico van mislokalisatie als gevolg van Ypq3-GFP overproductie te verminderen, werden de cellen eerst gekweekt op raffinose, dan galactose werd toegevoegd gedurende 3 uur, en ten slotte glucose werd verstrekt voor twee uur om de transcriptie van het YPQ3-GFP-gen te onderdrukken. Deze tijdelijk geïnduceerde Ypq3-GFP, die geaccumuleerd in de cel op een niveau dicht bij het endogene niveau van Ypq1-GFP (zie Supplementary Fig. S3, online), bleek te lokaliseren naar de vacuolaire membraan (Fig. 5A), in overeenstemming met onze eerdere resultaten 6. Deze vacuolaire lokalisatie werd ook waargenomen in de pep12Δ mutant. In de apm3Δ en apl5Δ mutanten echter, werd Ypq3 voornamelijk naar het lumen van de vacuole gemissorteerd. Deze missortering was afhankelijk van Pep12, aangezien Ypq3 niet naar de vacuole werd gemikt in apm3Δ pep12Δ en apl5Δ pep12Δ dubbelmutanten (Fig. 5A) (voor een kwantificering van de sublokalisatiepatronen, zie Supplementary Fig. S4 online). Deze resultaten suggereren dat, net als Ypq1 en Ypq2, Ypq3 voornamelijk de ALP pathway gebruikt om de vacuolaire membraan te bereiken. Wanneer componenten van het AP-3 complex ontbreken, wordt Ypq3 op een Pep12-afhankelijke manier omgeleid naar endosomen, waar het wordt gesorteerd in de multivesicular body pathway (MVB), wat resulteert in de levering aan het vacuolaire lumen. Deze interpretatie werd verder onderzocht door een Ypq3LL>AA mutant te isoleren die niet herkend zou worden door het AP-3 adaptor complex. In wild-type cellen was de Ypq3LL>AA variant duidelijk gemissorteerd naar het vacuolaire lumen, maar in een pep12Δ mutant werd het omgeleid naar kleine cytosolische punctate structuren (Fig. 5B).
Ypq3 wordt via de ALP pathway aan het vacuolaire membraan afgegeven en wordt naar het vacuolaire lumen gericht als sortering via de ALP pathway defect is.
(A) Stammen 23344c (ura3), EN046 (pep12∆ ura3), LL057 (apm3∆ ura3), LL061 (apl5∆ ura3), LL088 (apm3∆ pep12∆ ura3) en LL041 (apl5∆ pep12∆ ura3) getransformeerd met het pLL106 (GAL1-YPQ3-GFP URA3) plasmide werden gekweekt op raffinose-ammonium medium, galactose (3%) werd gedurende 3 uur toegevoegd en glucose (3%) werd gedurende 2 uur aan de cellen toegediend. Cellen werden toegestaan om FM4-64 internaliseren gedurende 15 min naar de vacuole label voor beeldvorming. (B) Stam 23344c (ura3) getransformeerd met de pLL106 (GAL1-YPQ3-GFP URA3) en pLL168 (GAL1-YPQ3LL>AA-GFP URA3) plasmiden en stam EN046 (pep12∆ ura3) getransformeerd met de pLL168 (GAL1p-YPQ3LL>AA-GFP URA3) plasmide werden gekweekt en geanalyseerd als in (A). Schaal bar: 5 pm. Een kwantificering van de sublokalisatie patronen van Ypq3-GFP is te vinden als Supplementary Figure S4 online.
Wij waren van mening dat het verschillende gedrag van Ypq3 in vergelijking met Ypq1 en Ypq2 in AP-3 deficiënte stammen te wijten zou kunnen zijn aan het feit dat Ypq3-GFP werd gesynthetiseerd in cellen die groeien in de aanwezigheid van galactose, of omdat de transcriptie van het YPQ3-GFP-gen werd geïnduceerd met behulp van de sterke GAL-promotor. Dit lijkt echter onwaarschijnlijk omdat de Ypq1-GFP- en Ypq2-GFP-eiwitten die in wild-type en mutantstammen met dezelfde GAL-promotor tijdelijk werden geïnduceerd, zich in cellen lokaliseerden zoals wanneer ze tot expressie werden gebracht onder hun eigen genpromotors (zie Supplementary Fig. S5 online). Bovendien, hoewel het fluorescerende signaal was nauwelijks detecteerbaar, kregen we bewijs dat Ypq3-GFP uitgedrukt met behulp van de natuurlijke YPQ3-gen promotor gelabeld het membraan van vacuoles in de wild-type stam, maar niet in de apl5Δ mutant, een fenotype duidelijk verschillend van die verkregen met Ypq1-GFP en Ypq2-GFP. In deze mutant was Ypq3-GFP aanwezig in punctate structuren die waarschijnlijk overeenkomen met de Golgi, en zijn missorting naar de vacuolaire lumen was niet duidelijk zichtbaar, waarschijnlijk omdat de fluorescentie te zwak was (zie Supplementary Fig. S6 online).
Concluderend, zoals hierboven aangetoond voor Ypq1, gebruiken de Ypq2 en Ypq3 eiwitten voornamelijk de ALP pathway om de vacuolaire membraan te bereiken en worden ze naar endosomen afgeleid wanneer deze pathway defect is. Maar terwijl Ypq1 en Ypq2 die door endosomen gaan efficiënt het vacuolaire membraan bereiken, is Ypq3 meer geneigd om in de MVB route gesorteerd te worden, wat leidt tot zijn targeting naar het vacuolaire lumen.
PQLC2 geproduceerd in gist gebruikt de ALP pathway en zijn dileucine motief om het vacuolaire membraan te bereiken
In een eerdere studie bleek rat PQLC2 zich te lokaliseren naar lysosomen in HeLa cellen, maar zijn PQLC2L>AA mutant, waarin de C-terminale dileucine is vervangen door een dialanine, vertoonde een meer diffuse distributie door de cel en werd gedeeltelijk gemist naar het plasmamembraan6. Bovendien bleek PQLC2, geproduceerd in gist, zich te lokaliseren naar de vacuolaire membraan, waar het functioneel is, aangezien het gevonden werd als aanvulling op het groeifenotype van een ypq2Δ mutant6. De resultaten in Fig. 6A tonen aan dat PQLC2 juist naar de vacuole van de gist werd gericht in een pep12Δ mutant, maar afweek naar de vacuolaire lumen in apm3Δ en apl5Δ mutanten. Deze targeting naar de vacuolaire lumen was verminderd in apm3Δ pep12Δ en apl5Δ pep12Δ dubbelmutanten, waar PQLC2 werd gevonden om diffuus te worden verdeeld door het cytosol (voor een kwantificering van de sublokalisatie patronen, zie Supplementary Fig. S7 online). We brachten ook in wild-type en mutante giststammen de PQLC2LL>AA mutant tot expressie. In wild-type gist bleek PQLC2LL>AA zich te lokaliseren in het vacuolaire lumen, maar in de pep12Δ mutant werd het verdeeld over het cytosol aangetroffen (Fig. 6B). Het sorteren van ladingen naar het multivesiculaire lichaam is typisch verstoord in een vps27Δ mutant die een sleutelcomponent van het ESCRT-0 complex mist18. In de vps27Δ mutant werd PQLC2LL>AA gestapeld in een groot perivacuolair compartiment: het klasse E compartiment dat typisch wordt waargenomen in deze categorie mutanten (Fig. 6B). Deze resultaten tonen aan dat PQLC2 geproduceerd in gist zich gedraagt als het endogene Ypq3: het wordt naar de vacuole gesorteerd via de ALP pathway op een manier die afhankelijk is van de juiste herkenning van zijn dileucine motief door het AP-3 adaptor complex. Wanneer deze herkenning is verstoord omdat het dileucinemotief is gemuteerd of een component van het AP-3 complex ontbreekt, wordt PQLC2 naar endosomen gedirigeerd, waar het efficiënt in de MVB-route wordt gesorteerd en uiteindelijk het vacuolaire lumen bereikt.
PQLC2, tot expressie gebracht in gist, wordt via de ALP-route naar het vacuolaire membraan gesorteerd.
(A) Stammen 23344c (ura3), EN046 (pep12∆ ura3), LL057 (apm3∆ ura3), LL061 (apl5∆ ura3), LL088 (apm3∆ pep12∆ ura3) en LL041 (apl5∆ pep12∆ ura3) getransformeerd met het pCJ502 (GAL1-rPQLC2-GFP URA3) plasmide werden gekweekt en behandeld als in Fig. 5 vóór de beeldvorming. (B) Stammen 23344c (ura3), JA770 (vps27∆ ura3) en EN046 (pep12∆ ura3) getransformeerd met pBOA006 (GAL1-rPQLC2LL>AA-GFP URA3) plasmide werden gekweekt en behandeld als in Fig. 5 voor de beeldvorming. Schaal bar: 5 pm. Een kwantificering van de sublokalisatie patronen van PQLC2-GFP is te vinden als Supplementary Figure S7 online.
Depletie van een AP-3 subeenheid belemmert de levering van PQLC2 aan lysosomen
PQLC2-GFP geproduceerd in HeLa-cellen grotendeels colokaliseert met de LAMP1 lysosomale marker. Lokalisatie van PQLC2 aan de lysosomale membraan werd verder ondersteund door semikwantitatieve massaspectrometrie analyse van eiwitten in preparaten sterk verrijkt in lysosomale membranen van rat levercellen 6. Om te bepalen of de AP-3 adaptor bijdraagt aan het sorteren van PQLC2 naar de lysosomen, gebruikten we kleine interfererende RNA (siRNA) om de synthese van de μ3A subeenheid van AP-3 in HeLa cellen te remmen. Immunoblot analyse bevestigde dat de twee typische banden die overeenkomen met de μ3A subeenheden19 waren nauwelijks detecteerbaar in μ3A-siRNA-behandelde cellen, in tegenstelling tot controle cellen (Fig. 7A). Deze uitputting van p3A sterk verstoord de lokalisatie van PQLC2-GFP (Fig. 7B): het eiwit grotendeels gelokaliseerd in talrijke intracellulaire punctate structuren niet gelabeld door de Lyso Tracker kleurstof ophopen in lysosomen en werd ook gevonden op het celoppervlak, met inbegrip van de microvilli, wat aangeeft dat een deel van het eiwit was ook misrouted naar het plasmamembraan. Dit contrasteert met de lokalisatie van PQLC2 in met mock behandelde cellen, waar het eiwit aanwezig was in punctate structuren die ook sterk gelabeld waren met de Lyso Tracker kleurstof, zoals verwacht. Deze resultaten suggereren dat het AP-3 complex bijdraagt aan de juiste lokalisatie van PQLC2 naar lysosomen. We onderzochten ook de lokalisatie van de PQLC2LL>AA mutant (Fig. 7C). In controle HeLa cellen werd PQLC2LL>AA gedistribueerd aangetroffen in intracellulaire punctate structuren die niet of zeer slecht gelabeld waren met de Lyso Tracker kleurstof en het was ook duidelijk aanwezig aan het celoppervlak, in overeenstemming met eerdere waarnemingen6. Deze lokalisatie werd niet significant verstoord in μ3A-siRNA-behandelde cellen, ter ondersteuning van de opvatting dat de rol van de dileucine motief van PQLC2 is om te mediëren intracellulaire verkeer via het AP-3 complex. Vervolgens onderzochten we of PQLC2L>AA wordt omgeleid naar het lumen van endosomale/lysosomale compartimenten, zoals wanneer het in gist wordt geproduceerd. HeLa cellen die PQLC2-GFP tot expressie brengen werden gedurende twee uur behandeld met vacuolin-1, een verbinding die homotypische fusie van compartimenten van het endosomale/lysosomale systeem induceert, resulterend in de vorming van grote, gezwollen structuren (Fig. 8). PQLC2-EGFP bleek, zoals verwacht, te lokaliseren op het begrenzende membraan van deze vergrote endosomale/lysosomale compartimenten. Hetzelfde gold in cellen die PQLC2LL>AA produceren, wat suggereert dat het mutante eiwit niet efficiënt in de MVB-route wordt gesorteerd. Concluderend kan gesteld worden dat het AP-3 adaptor complex een belangrijke rol lijkt te spelen in de targeting van PQLC2 naar het lysosoom, waarschijnlijk via herkenning van zijn C-terminale dileucine. Wanneer deze herkenning verstoord is, wijkt het eiwit af naar het celoppervlak en naar de begrenzende membraan van interne compartimenten.
Het AP-3-adaptorcomplex is vereist voor de lokalisatie van PQLC2 naar het lysosoom in HeLa-cellen.
(A) HeLa-cellen werden driemaal getransfecteerd met siRNA’s gericht tegen de μ3A-subeenheid van het AP3-complex. 48 uur na de derde ronde van transfectie, werden gelijke hoeveelheden homogenaten van mock en siRNA behandelde cellen onderworpen aan SDS-PAGE en immunoblotting met een antilichaam tegen de μ3A subeenheid van het AP3 complex. Cijfers komen overeen met de relatieve niveaus van de μ3A subeenheid geschat met actine als referentie (B) Bij de derde ronde van transfectie met siRNAs, werden cellen cotransfecteerd met de rPQLC2-EGFP of rPQLC2L>AA-EGFP plasmiden. Na 48 uur werden de cellen gedurende 2 uur geïncubeerd met de Lysotracker-Red DND-99 en gefixeerd voor de beeldvorming. Schaal bar: 10 μm.
PQLC2 wordt niet afgeleverd aan het lumen van lysosomen wanneer sortering via het AP-3 complex verstoord is.
HeLa-cellen, getransfecteerd met de PQLC2-EGFP- of PQLC2L>AA-EGFP-plasmiden, werden gedurende 2 uur behandeld met vacuolin-1. De cellen werden gefixeerd en onderzocht met fluorescentiemicroscopie. Schaal bar: 10 μm.