Inhibitor van Apoptose Eiwitten: Translating Basic Knowledge into Clinical Practice

BY admin
|

The Inhibitor of Apoptosis Protein Family of Caspase Inhibitors

De IAP’s zijn een familie van caspaseremmers die specifiek de caspasen 3, 7, en 9 inhiberen en daardoor apoptose voorkomen. Crook e.a. (17) identificeerden het eerste lid van de IAP-familie bij toeval tijdens het bestuderen van vAcAnh-geïnduceerde apoptose in SF21 baculoviruscellen. Tijdens een screening voor baculovirusgenen die de acties van p35 nabootsten en vAcAnh-geïnduceerde apoptose remden, identificeerden zij een nieuw gen van 1,6 kb dat codeert voor een 31-kDa anti-apoptotisch eiwit met een zinkvingerachtig motief (17). Latere studies identificeerden IAPs in een verscheidenheid van soorten en ontdekten dat IAPs apoptose remmen door caspases te blokkeren (besproken in ref. 18).

The Inhibitor of Apoptosis Protein Family

Tot op heden zijn acht menselijke IAP-familieleden geïdentificeerd (Fig. 2)⇓, en IAP homologen zijn ook beschreven in insecten en gist. IAP-eiwitten worden in deze familie ingedeeld op basis van de aanwezigheid van één tot drie baculovirus IAP repeat (BIR) domeinen, een zinkbindende regio van ∼70 aminozuren. Hoewel het BIR-domein vereist is voor lidmaatschap van de IAP-familie, blijken niet alle BIR-bevattende eiwitten anti-apoptotische functies te hebben (19, 20, 21, 22), zodat de aanwezigheid van een BIR-domein wel noodzakelijk maar niet voldoende is voor opname in deze eiwitfamilie. IAP-eiwitten kunnen ook een RING- of caspase activation recruitment (CARD) domein bevatten (besproken in ref. 18). De IAP-eiwitten zijn onderverdeeld in drie klassen (klasse 1, 2 en 3) op basis van de aan- of afwezigheid van een RING-vinger en de homologie van hun BIR-domeinen (23).

Fig. 2.

De IAP-familie van eiwitten. Tot op heden zijn acht menselijke IAP-familieleden geïdentificeerd, gebaseerd op gedeelde BIR-domeinen. IAP-leden kunnen ook een CARD-domein en een RING-vingermotief bevatten. BRUCE heeft een E2 ubiquitinatie-enzym motief (Ubc), en NAIP heeft een nucleotide bindend domein (NB). Om de IAP-eiwitten te groeperen zijn ze in drie klassen ingedeeld (klassen 1-3), op basis van de aan- of afwezigheid van een RING-vinger en de homologie van hun BIR-domeinen.

Klasse 1 Inhibitor of Apoptosis Proteins.

Klasse 1 IAP’s bevatten homologe BIR-domeinen en een RING-vingermotief. X-gebonden IAP heeft drie BIR-domeinen en een RING-vinger. Het was de eerste IAP van deze klasse die werd geïdentificeerd en is nog steeds de best gekarakteriseerde. Duckett et al. (24) identificeerden XIAP in 1996 bij een zoektocht naar zoogdiergenen die homoloog zijn aan het baculovirus IAP. Het bindt en remt caspases 3, 7 en 9 met nanomolaire affiniteit, maar het bindt of remt caspase 8 niet (25, 26). cIAP1 (ook bekend als MIHB, hiap2, en BIRC2) en cIAP2 (ook bekend als MIHC, hiap2, en BIRC3) zijn structureel verwant aan XIAP met drie BIR-domeinen en een RING-vinger. Deze IAP’s werden geïdentificeerd door de biochemische zuivering van eiwitten die geassocieerd zijn met de doodsreceptor TNF-R2, maar hun rol bij deze receptor blijft onduidelijk (27). cIAP1 en cIAP2 komen in de meeste menselijke weefsels tot expressie, maar de expressie van cIAP1 is het hoogst in de thymus, de testis en de ovarium, en de expressie van cIAP2 is het hoogst in de milt en de thymus (27). cIAP1 en cIAP2 binden en remmen caspase 3 en 7, zij het minder sterk dan XIAP (25). Zij remmen de caspasen 1, 6 en 8 niet. ML-IAP (ook bekend als livin, KIAP en BIRC7) en ILP-2 hebben een RING-vinger en slechts één BIR-domein, maar hun BIR-domein is het meest homoloog met het BIR3-domein van XIAP, cIAP1 en cIAP2 (vandaar hun opname in deze klasse). ML-IAP komt tot expressie in normale foetale lever, nieren, en volwassen testis en thymus, alsook in melanoom- en lymfoomcellijnen. ML-IAP remt caspases 3 en 9 met een affiniteit die vergelijkbaar is met die van cIAP1, maar bindt of remt caspases 1, 2, 6 of 8 niet (28). ILP-2 expressie is normaal beperkt tot de volwassen testis maar is ook gedocumenteerd in een lymfoblastoïde cellijn. ILP-2 remt caspase 9, maar niet caspase 3, 7, of 8 (29). Of de verschillen in affiniteit voor caspasen tussen de verschillende IAP’s verband houden met hun endogene intracellulaire functies moet nog blijken.

Class 2 Inhibitor of Apoptosis Proteins.

Het klasse 2 IAP-familielid NAIP heeft drie BIR-domeinen maar geen RING-vingermotief. Zijn BIR-domeinen zijn verder verwant aan de BIR-domeinen van de klasse 1 IAP’s. NAIP werd in 1995 geïdentificeerd door Roy et al. (30), toen zij op zoek waren naar het gen op 5q13 dat verantwoordelijk is voor spinale musculaire atrofieën bij kinderen. NAIP komt tot expressie in de volwassen lever, placenta en het centrale zenuwstelsel. Het remt caspases 3 en 7, maar niet caspases 1, 4, 5, of 8 (31).

Klasse 3 Inhibitor of Apoptosis Proteins.

Klasse 3 IAP-leden, zoals survivin, bevatten slechts een enkel BIR-domein en geen RING-vinger. Survivin komt tot expressie in de foetale lever, nieren, longen, en maagdarmkanaal, maar het komt niet tot expressie in de meeste normale volwassen weefsel (32). De preferentiële expressie van survivin in foetaal weefsel suggereert dat het een rol speelt in de ontwikkeling. Survivin wordt vaak overgeëxpresseerd in een verscheidenheid van maligniteiten met inbegrip van adenocarcinomas van de long, pancreas, colon, borst, en prostaat (32, 33, 34, 35, 36).

De differentiële expressie tussen normale en kwaadaardige cellen kan worden benut voor therapeutische doeleinden. Bijvoorbeeld, zou de survivin promotor als tumor-specifieke promotor kunnen worden gebruikt waarin een gen van belang in kwaadaardige cellen, maar niet in normale cellen wordt aangezet. Deze transcriptionele targeting kan van waarde zijn in kanker gentherapie (37). Als alternatief, zou de uitdrukking van survivin als tumormerker voor de vroege identificatie van kwaadaardigheid kunnen worden gebruikt zoals in detail hieronder besproken.

Inhibitor of Apoptosis Proteins Inhibit Active Caspases

Caspase inhibition is het best begrepen mechanisme door welke IAPs apoptosis verhinderen. In enzymatische reacties remt recombinant XIAP caspase 3, 7, en 9, maar niet caspase 8. In vitro verhindert overexpressie van XIAP in 293T-cellen BAX- en FAS-geïnduceerde splitsing van procaspase 3 en apoptose (38). Het effect van XIAP op caspase-activatie is in kaart gebracht door zijn BIR-domeinen, waarbij het BIR2-domein de caspases 3 en 7 remt, en het BIR3 RING-domein caspase 9.

Structural Basis of Caspase Inhibition by X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein.

Gezien de cellulaire en enzymatische gegevens die erop wijzen dat IAPs caspases remmen, werden pogingen ondernomen om de fysische interacties tussen IAPs en caspases te onderzoeken. De meeste studies hebben zich geconcentreerd op XIAP, omdat dit in recombinante vorm kan worden geproduceerd en gekristalliseerd. XIAP remt caspasen 3 en 7 en caspase 9 via afzonderlijke domeinen. Zijn BIR2-domein (aminozuren 163-240) met zijn NH2-terminale extensie (aminozuren 124-162) remt caspasen 3 en 7, terwijl zijn BIR3-domein (aminozuren 241-356) caspase 9 remt (39). Deze studies vormden de basis voor de ontwikkeling van IAP-remmers die zich richten op de caspase-bindende pockets van het molecuul.

BIR2-domein remt X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein.

Een “hook, line, and sinker”-model is voorgesteld om te verklaren hoe XIAP caspase 3 remt (Fig. 3)⇓. De “haak” (residuen 138-146 van de NH2 terminus) remt capase 3 door dwars over de actieve plaats van de caspase te gaan liggen, waardoor de substraat-bindende zak van actieve caspase 3 wordt geblokkeerd. De “lijn” vertegenwoordigt twee peptide bindingen op Val147 die de haak met de zinker verbinden. De “sinker” (residuen 148-150) stabiliseert de interactie tussen XIAP en caspase 3 (40). In dit model remt XIAP caspase 3 door sterische belemmering. Als zodanig remt het caspasen 3 en 7 via een mechanisme dat verschilt van peptidyl-caspase-inhibitoren zoals benzyloxycarbonyl-VAD-fluormethylketon, die met het caspasesubstraat concurreren om de bindingszak.

Fig. 3.

Het haak, lijn, en zinker model voor caspase inhibitie door XIAP. Een hook, line, and sinker model kan verklaren hoe XIAP caspase 3 remt door sterische belemmering. De haak in de NH2-terminale extensie van het BIR2 domein van XIAP remt caspase 3 door dwars over de actieve plaats van het caspase te gaan liggen, waardoor de substraatbindingszak van actief caspase 3 wordt geblokkeerd. De lijn wordt gevormd door twee peptidebindingen die de haak met de zinker verbinden. De sinker stabiliseert de interactie tussen XIAP en caspase 3.

BIR3-domein remt X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein.

Eerdere studies stelden vast dat het BIR3-domein van XIAP caspase 9 kon remmen (26, 41), maar pas onlangs is het mechanisme opgehelderd. Het BIR3 domein van XIAP vormt een heterodimer met monomere caspase 9, waardoor dimeren en activeren van caspase 9 wordt verhinderd. Behalve dat het caspase 9 in een monomere vorm vasthoudt, houdt het ook de actieve plaats van caspase 9 in een inactieve conformatie (42). Het is dus interessant op te merken dat XIAP caspase 9 remt zonder fysiek de actieve site te raken.

In een uitbreiding op de structurele studies, zijn de effecten van mutaties in de BIR-domeinen op de anti-apoptotische effecten van XIAP onderzocht. Mutaties die de NH2-terminale extensie van BIR2 aantasten (b.v. D148A) elimineren de beschermende rol van XIAP bij het voorkomen van Fas-ligand (een stimulus van de extrinsieke route van caspase-activatie) of Bax-geïnduceerde apoptose (een stimulus van de intrinsieke route van caspase-activatie). Daarentegen verminderen mutaties die het BIR3-domein beïnvloeden (b.v. W310A) XIAP-gemedieerde remming van apoptose geïnduceerd door BAX, maar niet door CD95 (43). Deze mutaties ondersteunen dus de structurele studies die aantonen dat het BIR2 domein nodig is voor de remming van caspase 3 en dat het BIR3 domein caspase 9 remt.

Survivin.

Waar XIAP de caspases 3, 7 en 9 remt door directe interacties, is het mechanisme waarmee survivin de caspases remt minder duidelijk. Volgens sommige studies (44, 45), survivin bindt en remt actieve caspases 3 en 7, maar niet caspase 8. Anderen (46) daarentegen ontdekken geen interactie van survivin met caspase 3. Een studie van Marusawa et al. (47) gemeld dat survivin niet recombinant caspases 3, 7, of 9 in enzymatische reacties of in cytosolische extracten eerder gestimuleerd met cytochroom c en dATP remt. Echter, wanneer survivin wordt toegevoegd aan cytosol extracten vóór de activering van caspase 9 door toevoeging van cytochroom c en dATP, het voorkomt caspase 3/7 activering. Dus, deze resultaten suggereren dat survivin remt actieve caspase 9, maar niet actieve caspases 3 en 7, en dat de remming van caspase 9 vereist een cofactor. Om zo’n cofactor te identificeren, gebruikten Marusawa et al. (47) een twee-hybrid scherm om survivin-bindende proteïnen te identificeren en identificeerden HBXIP. In enzymatische reacties, survivin en HBXIP in combinatie (maar geen van beide eiwitten alleen) geremd caspase 9 activiteit. Aanvullende studies zullen nodig zijn om deze discrepante studies op te lossen en het mechanisme waarmee survivin caspases remt te ontcijferen. Bovendien, om het belang van HBXIP als een noodzakelijke cofactor voor survivin generaliseren, zal het moeten worden geëvalueerd in andere celsystemen. Dergelijk werk zal een belangrijke stap in de richting van de ontwikkeling van chemische survivin inhibitors.

Bey beyond Caspase Inhibition

De meeste aandacht heeft zich gericht op IAPs als caspase inhibitors, maar meerdere lijnen van bewijs geven aan dat IAPs apoptose kan remmen door effecten op celcyclus progressie, celdeling, en signaaltransductie.

Inhibitor of Apoptosis Proteins Regulate Cell Division.

De IAP-eiwitten spelen waarschijnlijk een rol bij de celdeling. Bijvoorbeeld, gist ontbreekt caspases, maar hebben IAP homologen die een BIR domein bevatten. Schrapping van het IAP van gist leidt tot inefficiënte sporenvorming, wat erop wijst dat IAP, althans in gist, een rol speelt in meiose (20, 21, 22). In zoogdiercellen, survivin colocaliseert met het mitotische apparaat met inbegrip van B tubuline, microtubuli, centrosomes, en kinetochores (48, 49, 50). Remming van survivin met anti-survivin antilichaam resulteert in vertraagde metafase en produceert mitotische cellen met kortere en minder dichte mitotische spindels (48, 50).

Inhibitor of Apoptosis Proteins Regulate Cell Cycle Progression.

Evidence impliceert ook IAPs als regelaars van de celcyclus. Bijvoorbeeld, overexpressie van XIAP arresteert cellen in de G0-G1-fase van de celcyclus, en deze groeistilstand gaat gepaard met down-regulatie van cycline A en D1 en inductie van de cycline-afhankelijke kinase-remmers p21 en p27 (51). Bovendien bindt XIAP de celcyclusregulatoren MAGE-D1 en NRAGE, maar het belang van deze interactie is onduidelijk (52). Survivin is ook betrokken bij de regulatie van de celcyclus. In HeLa cellen, survivin is vrijwel niet detecteerbaar in G1 cellen en stijgt ∼5- en 40-voudig in S-fase en G2-M cellen, respectievelijk (50). Veranderingen in survivin mRNA niveaus correleren ook met verhogingen van survivin eiwit en promotor activiteit.

Inhibitor of Apoptosis Proteins Regulate Cell Signaling.

De IAP familie van eiwitten speelt ook een rol in cel signalering door het activeren van nucleaire factor (NF)-κB. XIAP en NAIP, bijvoorbeeld, vormen een complex met het TAK1-kinase en zijn cofactor, TAB1, dat leidt tot activering van c-Jun-NH2-terminal kinase 1 (53). Geactiveerd c-Jun-NH2-terminal kinase 1 activeert vervolgens NF-κB via de mitogeen-geactiveerde proteïnekinase-fosforylatiecascade (54). Bovendien bevordert XIAP de translocatie van de p65-subeenheid van NF-κB naar de kern, wat een voorwaarde is voor NF-κB-activiteit (55). Tenslotte bevordert XIAP de afbraak van de NF-κB remmer Iκβ (51).

Naarmate de rol van IAPs bij de regulering van celdeling, celcyclus en signaaltransductie wordt opgehelderd, zal het van belang zijn de IAP-domeinen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor deze activiteiten. Als het mogelijk wordt afzonderlijke domeinen van de eiwitten te identificeren die de caspases, de celcyclus en de signaaltransductie remmen, dan zouden mutanten van de IAP’s kunnen worden gemaakt die deze functies loskoppelen. Dit werk zou kunnen leiden tot de ontwikkeling van IAP-remmers die specifiek de remming van caspases door IAPs blokkeren, terwijl IAPs hun rol als regulatoren van de celcyclus en signaaltransductie behouden.

Regulatie van de functie van Inhibitor of Apoptosis Protein door Endogene Inhibitory Proteins

IAP-familieleden worden gereguleerd op het niveau van het gen, de boodschap en het eiwit, maar de details van deze regulatie vallen buiten het bestek van dit overzicht. In plaats daarvan zal dit overzicht zich richten op de regulatie van IAP’s door endogene remmende eiwitten, omdat zij als prototypes dienen voor therapeutische chemische IAP-remmers.

Regulerende IAP-bindende eiwitten werden voor het eerst geïdentificeerd in Drosophila. Van de eiwitten Reaper, Hid, Grim (56), en Sickle (57) werd aangetoond dat zij het Drosophila IAP, DIAP1, binden en remmen. Later werden menselijke versies van Reaper (Rpr), Hid, Grim (Grm), en Sickle (Skl) geïdentificeerd en SMAC/DIABLO en HTRA2 genoemd. Deze IAP-remmers delen een homologe sequentie in hun NH2 terminus die verantwoordelijk is voor binding en remming van IAP’s (Fig. 4)⇓.

Fig. 4.

De SMAC-familie van IAP-remmers. Leden van de SMAC familie van IAP remmers delen een homologe NH2-terminale regio. De NH2-terminus is voldoende voor binding aan het BIR3-domein van XIAP.

SMAC en HTRA2.

Humane SMAC en HTRA2 zijn mitochondriale eiwitten die samen met cytochroom c vrijkomen bij de ontregeling van de mitochondriën. Wanneer ze vrijkomen, worden ze gesplitst tot een actieve vorm. In hun actieve toestand binden SMAC en HTRA2 IAP’s, waardoor hun associatie met caspasen wordt verhinderd (58, 59, 60, 61). De IAP-remmende functies van de SMAC familie van eiwitten zijn gecodeerd in hun NH2 terminus. Peptiden die overeenkomen met de zeven NH2-terminale aminozuren zijn in staat XIAP te binden (62). Mutatie van het NH2-terminale alanine in glycine schakelt het vermogen van het SMAC peptide om IAP’s te binden en zijn proapoptotische functie uit te oefenen uit (63). Wanneer geïnternaliseerd in cellen, zijn peptiden die overeenkomen met de zeven NH2-terminale aminozuren van SMAC in staat om H460 longkankercellen te sensibiliseren voor cisplatine en Taxol (64) en neuroblastoomcellen voor tumor necrose factor-gerelateerd apoptose-inducerend ligand. Vergelijkbare resultaten zijn waargenomen met HTRA2 en de IAP-remmers bij Drosophila. De antitumoreigenschappen van SMAC-peptiden zijn uitgebreid tot xenograften, waar cel-permeabele versies van deze peptiden tumoren doen krimpen in combinatie met cisplatine (64) of TRAIL (65) in respectievelijk longcarcinoom- en glioomxenograften. Deze SMAC-peptiden dienen dus als prototypes voor kleine moleculen die de werking van SMAC nabootsen en IAP’s remmen en die therapeutisch bruikbaar zouden zijn voor een verscheidenheid aan maligniteiten.

Structurele studies.

Gezien de potentiële klinische bruikbaarheid van SMAC-achtige moleculen, zijn pogingen ondernomen om de fysische interacties tussen SMAC en IAP’s te begrijpen. Structurele studies hebben aangetoond dat SMAC XIAP op twee verschillende plaatsen bindt. De NH2 terminus van actieve SMAC (residuen 56-59) bindt aan de BIR3 pocket van XIAP en remt competitief het BIR3 domein van binding aan caspase 9. Mutaties in het BIR3 domein die de binding aan caspase 9 verhinderen (b.v. W310) verhinderen ook dat het BIR3 domein SMAC bindt, wat suggereert dat de bindingsplaatsen van SMAC en caspase 9 elkaar overlappen. De bindingsplaatsen zijn echter niet identiek, omdat sommige mutaties in BIR3 (b.v. H343A) de binding van BIR3 aan caspase 9 opheffen, maar niet die aan SMAC (63, 66).

SMAC full-length eiwit en NH2-terminale peptiden binden ook aan het BIR2-domein van XIAP, maar met een affiniteit ∼5- tot 10-voudiger dan die voor BIR3. Het mechanisme waarmee SMAC de associatie van BIR2 met caspase 3 verstoort is onduidelijk, maar het zou meer te maken kunnen hebben met sterische belemmering dan met competitieve binding (63).

HTRA2 bindt aan het BIR3-domein van XIAP, maar met zwakkere affiniteit dan SMAC (67). In zijn actieve toestand bestaat HTRA2 als een trimeer, en mutaties die de vorming van een trimeer verhinderen, maken HTRA2 inactief. Naast het remmen van IAP’s door binding aan de BIR3-pocket, kan HTRA2 ook meerdere IAP’s splijten en inactiveren, waaronder XIAP, cIAP1, en cIAP2, maar niet survivin (68).

SMAC β.

SMAC en HTRA2 kunnen hun proapoptotische activiteit ook uitoefenen door effecten die onafhankelijk zijn van IAP-binding. Een studie door Roberts et al. (69) beschreef een natuurlijk voorkomende alternatieve splitsvorm van SMAC, SMAC β genoemd, die de mitochondriale-doelsequentie miste. SMAC β had geen interactie met XIAP, cIAP1, of cIAP2, waarschijnlijk door het verlies van zijn NH2 terminus. Hoewel niet in staat om IAP’s te binden, versterkte SMAC β TRAIL- en VP-16-gemedieerde apoptose in 293 cellen. Mutant-versies van HTRA2 (67) die niet in staat zijn IAP’s te binden, zijn nog steeds in staat apoptose te induceren wanneer ze worden overgeëxpresseerd in MCF7 borstkankercellen. Het is onduidelijk uit deze studie hoe deze alternatieve splitsvormen toch apoptose kunnen induceren. Misschien behouden ze hun vermogen om IAP’s te ubiquitineren, waardoor ze de vernietiging van IAP’s bevorderen. Een andere mogelijkheid is dat SMAC en HTRA2 aanvullende bindingspartners hebben die niet gerelateerd zijn aan de IAP’s, waardoor zij een pro-apoptotische invloed uitoefenen. In het geval van HTRA2 heeft het protease-activiteit onafhankelijk van zijn rol in het binden van IAP’s, en deze protease-activiteit kan in sommige systemen apoptose reguleren (68).

XAF1.

XAF1 is een andere IAP-remmer. XAF1 is een nucleair eiwit dat XIAP bindt en in de kern sekwestreert. In biochemische reacties bindt XAF1 en remt het XIAP. In cellen blokkeert overexpressie van XAF1 XIAP-gemedieerde remming van apoptose. Het blijft echter onduidelijk of de sekwestratie van XIAP in de celkern het XIAP eenvoudigweg scheidt van cytosolische caspases, of dat er extra effecten zijn van XIAP dat zich in de celkern bevindt (70). Moleculen die XAF1 nabootsen zouden waarschijnlijk anders werken dan SMAC en een alternatieve strategie zijn voor de ontwikkeling van een XIAP-remmer.