Integrative genomic analyses of APOBEC-mutational signature, expression and germline deletion of APOBEC3 genes, and immunogenicity in multiple cancer types

Distinctive patterns of the APOBEC3 genes, geassocieerd met APOBEC-mutatie signatuur in meerdere kankertypes

In navolging van de eerdere analyse van APOBEC-mutatie signatuur, maten we de mutaties aan de hand van het aantal deaminase C die binnen de TCW trinucleotide motief verandering in T of G mutaties waren per elk monster over 10 kankertypes (zie Methoden). We voerden univariate analyses uit om de associaties van de APOBEC-mutatie signatuur met de algemene genexpressieniveaus van APOBEC3A en APOBEC3B te evalueren. We zagen dat het expressieniveau van APOBEC3A positief geassocieerd was met het APOBEC-mutatiepatroon in in totaal zes kankertypes – blaas, borst, baarmoederhals, longadenocarcinoom, hoofd en nek, en schildklier. In de overige kankertypes werden geen significante associaties waargenomen, hoewel dezelfde associatierichtingen werden waargenomen (Additional file 1: Tabel S1). Interessant genoeg zagen we dat APOBEC3B expressieniveau positief geassocieerd was met APOBEC-mutatie signatuur in alle kankertypes, behalve in long squameus carcinoom (Additional file 1: Tabel S1). In vergelijking met de associaties van APOBEC3A, was APOBEC3B specifiek geassocieerd met APOBEC-mutatie signatuur in maag-, pancreas- en nierkanker, met een P = 5.2 × 10- 11, P = 2.0 × 10- 3, en P = 1.1 × 10- 4, respectievelijk (Additional file 1: Tabel S1). Deze bevindingen waren in overeenstemming met eerdere studies. Bovendien evalueerden we ook de associaties van APOBEC-mutatie signatuur met de genexpressie van andere APOBEC3 genen: APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3F, APOBEC3G, en APOBEC3H. Onze resultaten toonden aan dat de expressie van deze genen geassocieerd met APOBEC-mutatie signatuur varieerde in verschillende kankertypes (Additional file 1: Tabel S2). Zo werd de expressie van APOBEC3C geassocieerd met een verhoogde APOBEC-mutatie in baarmoederhals- en hoofd-halskanker, terwijl de expressie van APOBEC3C werd geassocieerd met een verlaagde APOBEC-mutatie in maagkanker. Ons resultaat toonde ook aan dat de expressie van APOBEC3D, APOBEC3F, en APOBEC3G geassocieerd was met een verhoogd APOBEC-mutatiepatroon, terwijl het resultaat van de associatie van APOBEC3G in overeenstemming was met de eerdere bevinding. Interessant genoeg zagen we dat expressie APOBEC3H geassocieerd was met verhoogde APOBEC-mutatie handtekening in baarmoederhalskanker, maar niet waargenomen in borstkanker.

Distinctieve patronen van de isovormen van APOBEC3A en APOBEC3B, geassocieerd met APOBEC-mutatie handtekening in meerdere kankertypes

We evalueerden verder associaties tussen APOBEC-mutatie handtekening en expressieniveaus van elk van de isovormen getranscribeerd uit APOBEC3A en APOBEC3B. In totaal werden zes isovormen geanalyseerd, waaronder uc003awn en uc011aob getranscribeerd uit APOBEC3A, uc003awo, uc003awp en uc003awq getranscribeerd uit APOBEC3B, en een andere isovorm, uc011aoc, afgeleid van een fusie-gebeurtenis betrokken bij een regio die de laatste intronic van APOBEC3A tot het laatste exon van APOBEC3B omvat (Fig. 1a, b). Wij bevestigden dat de isovormen uc003awn en uc003awo primair getranscribeerd werden van APOBEC3A en APOBEC3B, respectievelijk (Additional file 1: Figuur S1) . Zoals verwacht, de associatie richting van zowel de uc003awn en uc003awo expressieniveaus en APOBEC-mutatie handtekening waren consistent met de waarnemingen van de totale gen expressie niveaus over alle kankertypes (Fig. 1c, d; Additional file 1: Tabel S3). Verrassend genoeg was het expressieniveau van uc011aoc (APOBEC3A/B) alleen in borstkanker positief geassocieerd met de APOBEC-mutatie signatuur (P = 5.0 × 10- 10) (Fig. 1e; Additioneel bestand 1: Tabel S3). Voor de overige isovormen werden echter voor geen enkel type kanker associaties waargenomen, met uitzondering van een zwakke associatie voor uc011aob (APOBEC3A) met hoofd-halskanker (P = 0,02; aanvullend bestand 1: tabel S3).

Met behulp van meervoudige regressie analyses die alle isovormen van zowel APOBEC3A als APOBEC3B omvatte, vonden we dat de expressieniveaus van uc003awn (APOBEC3A) en uc003awo (APOBEC3B) onafhankelijk en algemeen geassocieerd waren met geëvalueerde APOBEC-mutatie handtekening in meerdere kankertypes: blaas (een marginale associatie voor uc003awn), borst, baarmoederhals, long adenocarcinoom, en hoofd en nek (tabel 1). Evenzo werd een bijkomende associatie voor uc011awn (APOBEC3A) waargenomen in de schildklier, terwijl associaties voor uc003awo (APOBEC3B) werden waargenomen in maag-, pancreas- en nierkanker. In overeenstemming met de univariate analyse werd een opvallende associatie voor uc011aoc (APOBEC3A/B) met APOBEC-mutatie signatuur waargenomen bij borstkanker (P = 5,3 × 10- 11), en een bijkomende associatie werd ook waargenomen bij longadenocarcinoom (P = 0,01) (Tabel 1). Deze bevindingen suggereren dat uc011aoc een weefsel-specifieke rol speelt in het beïnvloeden van APOBEC-mutatie handtekening voornamelijk in borstkanker, terwijl uc003awn en uc003awo een ubiquitaire maar verschillende rol spelen in het gehele spectrum van humane kanker. In het bijzonder toonde onze aanvullende analyse de positieve expressiecorrelatie aan tussen de isovorm uc011aoc en APOBEC3A in een groot aantal kankertypes, vooral in borstkanker (Additional file 1: Tabel S4).

Daarnaast voerden we een associatieanalyse uit gestratificeerd naar klinische subtypen bij borstkanker. Wij stelden vast dat de associaties van de isovormen van uc003awn (APOBEC3A) en uc011aoc (APOBEC3A/B) met de APOBEC-mutatiesignatuur verschilden tussen de verschillende klinische subtypen, waarbij de meest significante associatie werd waargenomen in het LumA-subtype (Additional file 1: tabel S5).

Germline APOBEC3A/B deletie die expressieniveaus van isovormen van de APOBEC3A en APOBEC3B genen beïnvloedt

Om te onderzoeken hoe germline APOBEC3A/B deletie expressie van de isovormen van APOBEC3A en APOBEC3B beïnvloedt, identificeerden we eerst 30 monsters waarvan werd voorspeld dat ze homozygote deletie hadden, 239 monsters waarvan werd voorspeld dat ze heterozygote deletie hadden en 2287 monsters waarvan werd voorspeld dat ze geen deletie hadden (Additional file 1: Tabel S6, zie Methoden). Vervolgens evalueerden we de associaties tussen de kiembaan APOBEC3A/B deletie en de expressieniveaus van elke isovorm met behulp van univariate analyse (zie Methoden). Zoals verwacht, zagen we dat kiembaan APOBEC3A/B deletie significant geassocieerd was met verlaagde expressieniveaus van de isovorm uc003awo (APOBEC3B) voor alle kankertypes met P < 0,05, behalve voor pancreaskanker met een P = 0,14. Significante associaties met verlaagde expressieniveaus van uc003awn (APOBEC3A) werden ook waargenomen in drie kankertypes – blaas, borst en schildklier (Fig. 2; Tabel 2). Onze resultaten toonden daarentegen aan dat kiembaan APOBEC3A/B deletie significant geassocieerd was met een verhoogd expressieniveau van uc011aoc (APOBEC3A/B) voor alle kankertypes, behalve voor maag-, pancreas- en nierkanker. Voor deze was er geen statistische significantie, maar hadden de associaties dezelfde richtingen (Fig. 2; Tabel 2). Met name hoofd-halskanker vertoonde de meest significante associatie met P = 3,8 × 10- 65, en borst- en blaaskanker vertoonden een significante associatie met respectievelijk P = 3,0 × 10- 8, en P = 2,9 × 10- 7. Bovendien voerden we dezelfde analyse uit, gestratificeerd naar populatie, en een vergelijkbare trend werd waargenomen in deze kankertypes (gegevens niet weergegeven). Onze bevindingen suggereren dat, in bijna alle onderzochte kankertypes, de kiembaan APOBEC3A/B deletie significant geassocieerd was met verlaagde expressieniveaus van uc003awn en uc003awo, maar er was een verhoogd expressieniveau van uc011aoc.

Kiembaan APOBEC3A/B deletie beïnvloedt APOBEC-mutational signature, neoantigenbelasting en relatieve immuuncelsamenstelling, specifiek bij borstkanker

Een eerdere studie toonde aan dat kiembaan APOBEC3A/B deletie geassocieerd is met een verhoogde APOBEC-mutatie signatuur bij borstkanker, terwijl een vergelijkbaar patroon, maar zonder statistische significantie, werd waargenomen bij vele andere kankertypes, zoals blaas. Met behulp van univariate analyse om de algemene effecten van germline APOBEC3A/B deletie op APOBEC-mutatie handtekening te evalueren, vonden we dat de deletie alleen in borstkanker significant geassocieerd was met een verhoogde APOBEC-mutatie handtekening (P = 5,6 × 10- 3; Tabel 3; Fig. 3a). Echter, een tegengestelde trend werd waargenomen in de meeste andere kankertypes, hoewel de meeste associaties niet statistisch significant waren (Tabel 3). Specifiek bij blaaskanker zagen we dat kiembaan APOBEC3A/B deletie significant geassocieerd was met een verminderde APOBEC-mutatie signatuur (P = 1.7 × 10- 3; Tabel 3). Om verder te verduidelijken of de invloed van de kiembaan APOBEC3A/B deletie op de APOBEC-mutatie signatuur te wijten is aan het effect op de genexpressie, evalueerden we verder de associaties tussen de APOBEC-mutatie signatuur en de deletie met een correctie voor de expressie van isovormen (zie Methoden). Onze resultaten toonden aan dat een kiembaan APOBEC3A/B deletie alleen bij borstkanker significant geassocieerd was met een verhoogde APOBEC-mutatie signatuur (P = 2.8 × 10- 6; Tabel 3; Fig. 3b). Een hogere effectgrootte (Beta = – 0,620) van de deletie met een aangepaste isovorm expressie werd waargenomen in vergelijking met de aanvankelijke waarneming van het totale effect (Beta = – 0,281; Tabel 3). Om te evalueren of de kiembaan deletie kan bijdragen aan de proportie van APOBEC-mutatie signatuur, analyseerden we ook een proportie van APOBEC-mutatie signatuur ten opzichte van het totaal aantal mutaties voor elk monster (zie Methoden). In overeenstemming met de eerste waarneming van APOBEC-mutatie handtekening, zagen we dat de kiembaan deletie alleen in borstkanker significant geassocieerd was met een verhoogd aandeel van APOBEC-mutatie handtekening (Beta = – 0,287, P = 4,8 × 10- 3 en Beta = – 0,5, P = 1,4 × 10- 4 voor het totale effect en effecten met aangepaste genexpressie; zie Tabel 3). Deze resultaten geven aan dat germline APOBEC3A/B deletie, die leidt tot verhoogde APOBEC-mutatie signatuur, waarschijnlijk te wijten is aan de aparte functie van uc011aoc getranscribeerd uit de deletie, afgezien van het effect op verhoogde expressie van uc011aoc. Het is gemeld dat APOBEC3H haplotype I (APOBEC3H-I) in belangrijke mate kan bijdragen aan APOBEC-mutatie signatuur voor monsters die kiemlijn APOBEC3A/B deleties in borstkanker dragen. We analyseerden verder het APOBEC3H-I haplotype voor een totaal van 76 monsters waarvan werd voorspeld dat ze kiembaan APOBEC3A/B deleties droegen (zie Methoden). Onze resultaten toonden aan dat de APOBEC-mutatie signatuur niet significant gecorreleerd was met het APOBEC3H-I haplotype, ongeacht de monsters waarvan voorspeld was dat ze homozygote of heterozygote kiembaan APOBEC3A/B deleties droegen (Gegevens niet weergegeven). Onze bevindingen komen echter overeen met de eerdere bevinding dat het APOBEC3A/B-eiwit, dat door de deletie wordt gegenereerd, een hoger expressieniveau heeft dan het APOBEC3A-eiwit, gebaseerd op het onderzoek van in vitro functionele assays .

Om de verschillende functie en potentiële pathways waarbij de isovorm uc011aoc expressie (getranscribeerd vanuit de APOBEC3A/B deletie) betrokken kan zijn, verder te onderzoeken, analyseerden we genen die co-geëxpresseerd werden met de isovorm uc011aoc in de monsters waarvan voorspeld werd dat ze germline APOBEC3A/B deleties droegen (zie Methoden). Een verrijkingsanalyse in canonieke signaalwegen met IPA toonde aan dat deze gecoëxpresseerde genen significant verrijkt waren in verschillende canonieke paden, variërend over kankertypes. In het bijzonder zagen we dat de hoogst verrijkte paden HIPPO signalering voor blaas waren, PTEN signalering voor borst, iNOS en Interferon signalering voor long adenocarcinoom, Acyl-CoA hydrolyse voor maag, en DNA Dubbel-Strand Breuk Reparatie en Vetzuur α-oxidatie voor pancreas, EIF2 signalering voor schildklier en GPCR-Gemedieerde Integratie voor nier (P < 0.01 voor alle; Additional file 1: Tabel S7). Bovendien werd een functionele verrijking in celdood en overleving algemeen waargenomen in meerdere kankertypen, waaronder blaas-, borst-, baarmoederhals-, longadenocarcinoom en longcarcinoom (P < 0,05 voor alle).

We evalueerden verder de associatie tussen kiembaan APOBEC3A/B deletie en neoantigeen ladingen. In overeenstemming met de waarneming van APOBEC-mutatie signatuur, toonden onze resultaten aan dat kiembaan APOBEC3A/B deletie alleen in borstkanker significant geassocieerd was met verhoogde neoantigen belastingen (P = 6,5 × 10- 3; Fig. 3c), terwijl een tegenovergestelde trend werd waargenomen in veel andere kankertypes (Additional file 1: Tabel S8). Op dezelfde manier vonden wij dat de kiembaangetaste deletie marginaal geassocieerd was met de relatieve abundantie van de samenstelling van T cellen (CD8+) in TILs, maar alleen in borstkanker (P = 0,08; Fig. 3d). De significante associatie werd ontdekt wanneer we monsters met zowel homozygote als heterozygote deleties kamden en vergeleken met de monsters zonder dragende deleties (een Wilcoxon signed-rank test, P < 0,05). Er werd echter geen associatie waargenomen voor andere immuuncellen. Onze bevindingen toonden aan dat germline APOBEC3A/B deletie een weefselspecifieke rol speelt in het beïnvloeden van APOBEC-mutatie signatuur en immunogeniciteit in borstkanker, waarschijnlijk een versterking van de bevindingen in eerdere genoomwijde associatiestudies van potentiële mechanismen voor hun associatie met verhoogd borstkankerrisico.

APOBEC-mutatie signatuur draagt significant bij aan neoantigenen

Om te onderzoeken in hoeverre APOBEC-mutatie signatuur bijdraagt aan neoantigenen, analyseerden we voorspelde neoantigen ladingen voor elk monster verzameld uit een eerdere studie (zie Methoden). Met behulp van univariate analyse evalueerden we de associaties tussen APOBEC-mutatie signatuur en neoantigen belasting voor elk type kanker. Zoals verwacht was de APOBEC-mutatie signatuur positief geassocieerd met neoantigeen ladingen in alle kankertypes (P < 1.0 × 10- 4 voor alle vergelijkingen), terwijl de meest significante associaties werden waargenomen in borst en blaastypes met P = 5.1 × 10- 125, en P = 1.5 × 10- 90, respectievelijk (Additional file 1: Tabel S9). Evenzo werd een algemene positieve associatietrend waargenomen tussen voorspelde neoantigeen ladingen en proportie van APOBEC-mutatie signatuur, met uitzondering van maagkanker (Fig. 4; Additional file 1: Tabel S10). Specifiek werden significante associaties waargenomen bij meerdere kankertypes, waaronder blaas-, borst-, baarmoederhals-, longadenocarcinoom, hoofd-hals-, en schildklierkanker. Met name borst- en blaaskanker vertoonden de beste associaties met respectievelijk P = 8,9 × 10- 29, en P = 2,8 × 10- 27 (Additional file 1: Table S10). Onze bevindingen suggereren dat APOBEC-mutaties een belangrijke rol spelen bij de biogenese van neoantigenen in kanker bij mensen.

Associaties tussen relatieve abundantie van immuuncelsamenstellingen in TILs met neoantigeenbelasting en APOBEC-mutatiesignatuur

Om de relatie tussen neoantigeenbelasting en TILs te onderzoeken, gebruikten we genexpressiegegevens in tumorweefsels om de abundantie van relatieve celsamenstellingen van elk immuun celtype te meten, inclusief B cel naïef, B cel geheugen, T cel CD8 en T cellen CD4 geheugen-geactiveerd in TILs (zie Methoden). Met behulp van univariate analyse evalueerden wij de associatie tussen neoantigenbelasting en de relatieve abundantie van immuuncelsamenstellingen voor elk kankertype. Wij stelden vast dat er een positieve associatietendens was tussen de neoantigenbelasting en zowel T cel CD8+ als CD4+ geheugengeactiveerde types in alle kankertypes behalve schildklier en nier (binomiale test P = 0,11 en P = 0,02 voor T cel CD8+ en CD4+ geheugengeactiveerde types, respectievelijk). Een tegengesteld patroon werd waargenomen voor zowel B cel naïeve als geheugen types in alle kankertypes, met uitzondering van long adenocarcinoom (Binomiale test P = 0.02 en P = 2.2 × 10- 16 voor B cel naïeve en geheugen types, respectievelijk). In het bijzonder toonden onze resultaten aan dat neoantigeen ladingen een associatie hadden met de relatieve abundanties van zowel T cel CD8+ en CD4+ geheugen-geactiveerde, en B cel naïeve en geheugen types in blaaskanker. Er was een associatie voor zowel B cel naïeve als geheugen types in borstkanker, en T cel CD4 geheugen-geactiveerde celtypes in long adenocarcinoom, hoofd en nek, en pancreas kanker (Additional file 1: Tabel S11). Aangezien APOBEC-mutatie signatuur significant bijdroeg tot neoantigenen, evalueerden we bijkomend de associatie tussen de relatieve abundanties van de immuun celsamenstellingen in TILs en APOBEC-mutatie signatuur. In overeenstemming met de observatie van de associatie analyse van naeoantigenen, werd een vergelijkbaar patroon ook gevonden voor APOBEC-mutatie signatuur (Additional file 1: Tabel S12). Onze bevindingen suggereren dat APOBEC-mutatie signatuur een invloed heeft op de immunogene capaciteiten van kanker, zoals het aantrekken van bepaalde immuuncellen in TILs, mogelijk gemedieerd door de verhoogde neoantigenbelasting.