Isolation, characterization and toxicological potential of Alternaria-mycotoxins (TeA, AOH en AME) in verschillende Alternaria soorten uit verschillende regio’s van India

Verzameling en isolatie van Alternaria soorten

De geïnfecteerde delen zoals bladeren, vruchten en stengels van zieke planten uit verschillende regio’s in India, werden verzameld en naar het laboratorium gebracht. De bladmonsters werden aan de oppervlakte gesteriliseerd met 0,5% natriumhypochlorietoplossing, verschillende keren grondig gewassen met steriel gedestilleerd water (SDW) en gedurende 3-4 dagen in petrischalen op een aardappel dextrose agar (PDA) kweekmedium gelegd. De PDA-platen met geïnfecteerde bladstukken werden gedurende 6-10 dagen geïncubeerd bij 28 °C bij een licht-donker fotoperiode van 12 uur57. Om bacteriële besmetting te voorkomen, werd streptomycine aan het medium toegevoegd. De conidia werden enkel gesporuleerd om zuivere kolonies te bekomen, die op gesteriliseerd filtreerpapier werden geplaatst.

Pathogeniciteitstest

Om de formae specials te bepalen, werd virulentieanalyse van de isolaten uitgevoerd op tomatencultivars die gevoelig zijn voor Alternaria. In totaal werden 60 isolaten van Alternaria getest op pathogeniteit. Tomatenzaden werden gechloreerd in natriumhypochloriet, gespoeld in leidingwater, en vervolgens aan de lucht gedroogd. De planten werden apart opgekweekt in potten. Fysiologische omstandigheden zoals temperatuur en vochtigheid voor de plantengroei werden gehandhaafd op 28 °C tot 32 °C en 40 tot 60% relatieve vochtigheid, respectievelijk. De optimale concentratie inoculums werd gehandhaafd (2 × 106 sporen/ml) en op het bladoppervlak gesproeid. De planten in het experiment werden gedurende 8 uur bij 25 °C in dauwkamers gehouden. Deze planten werden gedurende 2-3 dagen regelmatig gecontroleerd op de ernst van de infectie en de ontwikkeling van de ziekte in vergelijking met het controleblad dat niet was geïnoculeerd. Symptomen begonnen zichtbaar te worden 1 dag na het spuiten van de sporeninoculaties. De ernst van de ziekte werd beoordeeld vanaf 1 dag van inoculatie tot 6 dagen. De gegevens werden statistisch geanalyseerd met behulp van variantieanalyse (ANOVA) en Duncan’s test (P ≤ 0,05).

DNA-extractie en identificatie van de ziekteverwekker

De ziekteverwekker werd aanvankelijk geïdentificeerd op basis van morfologische kenmerken zoals grootte en vorm en structuur van conidia, en verder bevestigd door ITS amplificatie met behulp van universele primers ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) en ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) die ITS regio’s amplificeren en 5.8S-genen die coderen voor schimmelsoorten. De DNA-extractie werd uitgevoerd volgens de door Doyle en Doyle voorgestelde methode58. Gelyofiliseerde mycelaire mat van 0,5 g werd fijngemalen in een mortier en stamper met 10 ml CTAB-extractiebuffer en vervolgens gedurende 30 min. bij 65 °C in een waterbad geïncubeerd. Het monster werd vervolgens gemengd met een gelijk volume gekoelde chloroform/isoamylalcohol en voorzichtig gemengd, gevolgd door centrifugatie bij 10.000 rpm gedurende 10 min bij 4 °C. Het aldus verkregen supernatans werd gemengd met een gelijk volume isopropanol en gedurende 2 uur bij 4 °C bewaard. Het monster werd opnieuw gecentrifugeerd bij 10000 rpm gedurende 10 min bij 4 °C. De pellet werd vervolgens gespoeld met 70% ethanol en gedurende 4 uur aan de lucht gedroogd om de sporen alcohol te verwijderen. Amplificatie ITS rDNA reactie werden uitgevoerd in 25 pl reactiemengsel met 2,5 pl 10X reactiebuffer, 5 pl van elk deoxyribonucleotide trifosfaat (dNTP), en 1,0 pl elk van ITS en 5,8 S regio universele forward primer (ITS1) en reverse primer (ITS4), 0,3 pl Taq DNA-polymerase, 10-100 ng DNA, en 2,5 pl MgCl2. Het geoptimaliseerde thermische profiel van de PCR was initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 3 min, denaturatie bij 95 °C gedurende 30 sec, annealing bij 70 °C gedurende 30 sec en uiteindelijke extensie bij 72 °C gedurende 1 min met nog eens 40 cycli. De amplificatie werd bevestigd op 1% agarose gels in 0.5X TBE buffer, parallel gerund met standaard DNA molecuulgewicht marker en gevisualiseerd onder UV-transilluminator.

ITS Sequence analysis

De verkregen ITS rDNA regio’s van geselecteerde isolaten werden verder verknipt en gezuiverd met behulp van QIAquick PCR purificatie kit (QIAGEN, Duitsland), volgens de instructies van de fabrikant. De gezuiverde producten werden ten slotte naar SciGenome Cochin, Kerala, India gestuurd voor sequentiebepaling. De sequenties werden vergeleken met die in GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) met behulp van NCBI BLAST. De BLAST-analyse werd uitgevoerd met ITS-sequenties over de volledige lengte als query’s om verwantschap met gepubliceerde sequenties aan het licht te brengen. De hoogste homologie en de totale score werden genoteerd voor verdere analyse. De in deze studie verkregen sequenties werden ingediend bij de GenBank. De ITS sequenties van Alternaria stammen uit andere speciale formae werden gedownload uit de NCBI GenBank database en werden gebruikt in de fylogenetische analyses als referentie sequenties. Alle DNA-sequenties werden uitgelijnd met het programma Clustal W, opgenomen in BioEdit sequentie-uitlijningseditor59, 60. Het resulterende multiple-alignment bestand werd gebruikt voor fylogenetische analyses die werden uitgevoerd met behulp van MEGA 5.0 met Neighbor-Joining methode die 500 bootstrap replicaten toelaat.61

Extractie van de toxinen van Alternaria species

Extracties van de toxische metabolieten werden uitgevoerd volgens de methode van Andersen et al.62 met enkele modificaties. De extracties van deze fytotoxinen werden uitgevoerd op Potato Dextrose Broth (PDB) medium met behulp van 20-dagen oude culturen. Drie agarpluggen (3 mm) werden uit het midden van elke Alternaria-kolonie gesneden en in 200 ml PDB-medium geïnoculeerd. Kolonies van de ziekteverwekker werden doorgesneden met behulp van een kurkboor (5 mm) en vervolgens werden kolonies in het PDB medium geïnoculeerd. Twintig dagen oude culturen werden met behulp van de vacuümfiltermachine door filtreerpapier gefiltreerd. Een gelijk volume methanol werd aan de cultuurfiltraten toegevoegd, goed gemengd en gedurende 24 uur bij 4 °C bewaard. Daarna werd het filtraat neergeslagen en werd de methanol tot droogte verdampt in een roterende vacuümconcentrator (IKA® RV 10) bij 43 °C. Een gelijk volume ethylacetaat werd toegevoegd aan het geëxtraheerde filtraat en goed gemengd in een scheitrechter. Er werden twee fasen verkregen, een organische fase en een waterige fase. De waterige laag werd gescheiden en geëxtraheerd met ethylacetaat. Het ethylacetaatextract werd geconcentreerd bij 44 °C in een vacuümverdamper en opgelost in methanol.

Zuivering en scheiding van Alternaria fytotoxine via kolomchromatografie

Zuivering en scheiding van verbindingen werden uitgevoerd volgens de methodologie van Devi et al.63 met kleine wijzigingen. Kolomchromatografie (CC) werd uitgevoerd in een glazen kolom (700 mm × 30 mm) en silicagel (100-120 mesh grootte Merk) werd gekozen als stationaire fase. De mobiele fase bestond uit zuiver oplosmiddel of verschillende oplosmiddelen, afhankelijk van de eisen van de omstandigheden. De kolom werd geladen met ruw complex dat geëxtraheerd was uit isolaten van Alternaria-soorten. Voor de scheiding van toxische metabolieten werd gebruik gemaakt van chloroform: methanol (80:20 en 95:05), benzeen: aceton: azijnzuur (60:35:05) voor de scheiding van verbindingen en werd een gradiënt-elutie gevolgd. Verschillende fracties geëlueerd uit CC werden gescheiden door dunne laag chromatografie (TLC) en bevestigd door de HPLC-analyse.

Dunne laag chromatografie (TLC) analyse van de fytotoxinen

Dunne laag chromatografie (TLC) werd gebruikt om de verschillende fytotoxinen geproduceerd door grote en kleine sporen van geïdentificeerde Alternaria soorten te identificeren. TLC werd uitgevoerd volgens de methode van Andersen et al.64. Bij deze methode werd 4,5 g silicagel G254 (13% CaSO4 ½ H2O als bindmiddel) toegevoegd aan 25 ml dubbel gedestilleerd water en geroerd met een glazen staaf totdat een slurry van silicagel was gevormd. Daarna werd de slurry voorzichtig op een glasplaat aangebracht en op een veilige plaats aan de lucht te drogen gelegd. Voor de scheiding van verschillende fytotoxinen werden verschillende mobiele fasen gebruikt in de verhouding chloroform: methanol (80:20; v/v), benzeen: aceton: azijnzuur (60:35:5; v/v), chloroform: methanol (95:5; v/v), ethylacetaat: benzeen (95:5; v/v). Deze oplosmiddelmengsels werden vervolgens in exsiccatoren geplaatst en bleven daar 30 min staan om de omgeving binnenin te verzadigen. Voordat de TLC werd uitgevoerd, werden de met silicagel gecoate glasplaten opgeladen door ze gedurende 10 minuten in een oven van 60 °C te plaatsen. Na het laden werden 5 µl monsters gespot op verschillende punten op 2 cm afstand van de basis. Nadat de monsters gespot waren, werden de TLC-platen gedurende enkele minuten in een exsicator gedroogd. De vlekken werden ontwikkeld door de TLC-platen bloot te stellen aan 0,2% ethanolisch ferrichloride en/of gevisualiseerd onder UV-licht van 365 nm. De TLC-platen werden vervolgens een nacht aan de lucht gedroogd, waarna de Rf-waarden werden berekend. De vlekken van verschillende metabolieten waarvan de Rf-waarden vergelijkbaar werden bevonden met de Rf-waarden van de standaarden, werden weggekrast, opgelost in HPLC-kwaliteit methanol en gebruikt voor HPLC-analyse.

HPLC-UV-analyse

Bereiding van de standaard

TeA (cat No: T1952), AOH (cat No: A4675) en AME (cat No: A4678) werden gekocht bij Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, India) en in gekristalliseerde vorm gebruikt om de standaard te bereiden. De stockoplossing (1000 µg ml-1) en een aparte werkoplossing van (10 µg ml-1) van de toxines werden bereid in methanol van HPLC-kwaliteit en bij -20 °C bewaard voor verder gebruik. Deze toxines werden gebruikt als standaarden voor HPLC-kalibratie en voor andere aanvullende experimenten door de bereide werkoplossingen te verdunnen.

HPLC-UV-analysecondities

Voor HPLC-analyse werden de monsters chromatografisch gescheiden met behulp van een gedeactiveerde (250 mm lange × 4.6 mm, 5,0 µm deeltjesgrootte) C18 Waters Spherisorb, ODS2 kolom (productnr.: PSS831915, USA) die was verbonden met de guard kolom, Waters series systeem (Waters, Waters Corporation, Milford, USA) met UV-VIS detector (2998 PDA) en Waters 600E systeemcontroller. De 2998 PDA-detector was ingesteld op 254 nm als integratiegolflengte. De monsters werden geïnjecteerd met een lus van 10 μl van Waters 717plus autosampler (Waters Corporation, Milford, USA). De kolom en de guard-kolom werden thermostatisch geregeld op 28 °C. De stroomsnelheid was 0,70 ml/min en de mobiele fase bestond uit 75% methanol van HPLC-kwaliteit (oplosmiddel A), 25% van een waterige oplossing (oplosmiddel B) van 0,1 M fosfaatbuffer, toegevoegd 900 ml DW voor 1 liter en pH 5,8 gehandhaafd door fosforzuur. Het instrument werd uitgevoerd in een lineaire isocratische modus en de detectie werd bewaakt in het bereik van 200-400 nm. De betrouwbaarheid van de HPLC-methode voor de analyse van AME, TeA en AOH werd gevalideerd aan de hand van de aantoonbaarheidsgrens (LOD) en de bepaalbaarheidsgrens (LOQ).

LC-MS/MS analyse

Voor een verdere bevestiging van de Alternaria toxinen (AME, AOH en TeA) werd een chromatografie – tandem massaspectrometrische (LC-MS/MS) methode uitgevoerd met lichte aanpassingen van Tölgyesi et al.65. De methode omvat een vast-vloeistofextractie met methanol en een daaropvolgende derivatisering voor TeA, AOH en AME. Vervolgens werden de monsters gezuiverd door extractie in vaste fase op polymere cartridges, en ten slotte werden de toxines gescheiden door LC-MS/MS. Voor de LC-MS/MS-analyse werden de monsters stapsgewijs bereid.

Hulpmiddelen, oplosmiddelen en bereiding van de standaard

Gedroogde analytische kalibratiemiddelen van AME, AOH en TeA werden gekocht bij Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, India). De standaarden werden gereconstitueerd met 1,0 ml methanol om voorraadoplossingen van 0,1 mg ml-1 te verkrijgen. Alle stamoplossingen werden bij 4 °C bewaard. 2,4-dinitrofenylhydrazine (DNPH) en undecanal werden gekocht bij Sigma-Aldrich. Het derivatisatiereagens (0,58% DNPH in HCl-oplossing) werd bereid zoals beschreven door Siegel et al.7. Het stopreagens was 5% (v/v) undecanal in methanol. De gederivatiseerde TeA-, AOH- en AME-standaardoplossingen (respectievelijk 1,91 μg/ml, 2,54 μg/ml en 2,71 μg/ml methanol) werden bereid door 1 ml van de 10 μg/ml methanolische TeA-, AOH- en AME-oplossingen te mengen met 1 ml DNPH-oplossing. Het mengsel liet men een nacht staan en werd verwerkt zoals beschreven in de paragrafen over monsterextractie en SPE-opzuivering. Het uiteindelijke volume werd met methanol op 10 ml gebracht. Deze oplossingen werden gebruikt om de LC-MS/MS-condities voor de analyse te optimaliseren. Een buffer van 50 mM ammoniumformiaat werd bereid in water en de pH werd met mierenzuur op 3,0 gebracht. Methanol en acetonitril waren van LC-MS-kwaliteit, verkregen van Sigma-Aldrich. Ethylacetaat, n-hexaan, dichloormethaan, mierenzuur en ammoniumformiaat waren van HPLC-kwaliteit en aangekocht bij Merck (Darmstadt, Duitsland). De Kinetex C-18 UPLC LG 500-kolom (3 × 100 mm, 2,6 μm), Strata SPE-patronen (6 ml, 200 mg) en spuitfilters van geregenereerde cellulose (RC) (15 mm, 0,45 μm) werden verkregen van Phenomenex (Utrecht, Nederland). De Supelco Ascentis Express C-18, cyaan (ES-CN) en fenyl-hexyl HPLC-kolommen (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) werden gekocht bij Sigma Aldrich. De voor de ontwikkeling van de methode gebruikte toxinemonsters werden aangekocht bij Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, India). De monsters werden bewaard bij -20 °C tot ze werden geanalyseerd.

Bemonsterextractie

De ruwe metabolietextractiestalen werden gezuiverd door kolomchromatografiemethode en de fractie werd geëlueerd en opgelost in methanol. 50 ml monster van elke fractie werd gemengd in polypropyleen (PP) centrifugebuizen van 50 ml, die vervolgens werden verzegeld. De monsters werden gedurende 5 seconden vortex-gemengd en gedurende 45 minuten horizontaal geschud op een CAT S50-schudapparaat bij een snelheid van 600 min-1 bij omgevingstemperatuur. Vervolgens werden de buisjes bij 5 000 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten bij 20 °C gecentrifugeerd en werd de bovenste laag opgevangen in een nieuwe 50 ml PP-centrifugebuis. 100 μl derivatatiereagens (0,596% DNPH in 2 mol/liter HCl) werd aan het monster toegevoegd en gedurende 5 seconden vortex-gemengd. Het monster werd gedurende 1 uur bij omgevingstemperatuur gederivatiseerd. Daarna werd 500 μl stopreagens 5% (v/v) undecanal in methanol toegevoegd en vortex-gemengd gedurende 5 seconden. Het monster liet men gedurende 30 min staan en vervolgens werd het in de PP-buis tot 35 ml verdund met 50 mM ammoniumformiaatbuffer (pH 4, aangepast met mierenzuur). Het monster is gecentrifugeerd bij 5.000 rpm gedurende 10 min bij 20 °C en onderworpen aan een clean-up met vaste-fase-extractie.

Solid-phase extraction (SPE) clean-up

Strata-XL (200 mg, 6 ml, 100 μm) patronen werden geconditioneerd met 6 ml methanol, gevolgd door 6 ml water en 6 ml 50 mM formiaatbuffer. Op de patronen werden reservoirs van 75 ml aangesloten en de monsters werden in de reservoirs geladen. Vervolgens werden de monsters druppelsgewijs gepasseerd. Daarna werden de SPE-kolommen gewassen met 6 ml methanol/water (15/85, v/v) en vervolgens met 6 ml n-hexaan. De patronen werden gedurende 5 minuten vacuüm gedroogd alvorens de monsters in glazen buizen te elueren met 5 ml methanol. De monsters werden bij 45 °C onder een zachte stikstofstroom ingedampt en door vortexmenging gedurende 20 sec. weer opgelost in 250 μl methanol. Als laatste stap werden de monsters door geregenereerde cellulosefilters in HPLC-flacons gefiltreerd.

Instrumentatie en apparatuur

De methodeontwikkeling werd uitgevoerd met een Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2.7 μm) UPLC LG 500 nm systeem (Accucore RP-MS 100 × 3.0 MM, 2.6UM, ACQ-TQD-QBB1152, Waters acuity PDA detector, Waters Corporation, Milford, MA, USA) gekoppeld aan een MassLynx triple quadrupole MS detector (Waters, Milford, MA, USA). De gegevensverzameling en -evaluatie werden uitgevoerd met MassLynx versie 4.0. De uiteindelijke methode werd ook overgebracht naar een Thermo ACQ-TQD Quantum Ultra LC-MS/MS-systeem (Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA) dat bestond uit een Waters acquity QSM binaire pomp (SN- L10QSM943A), een Waters acquity fin autosampler (SN-M10SDI443M), een kolomthermostaat en een TQD Quantum Ultra triple quadrupool MS-detector. De beoogde kolomtemperatuur en de beoogde monstertemperatuur waren respectievelijk 30 °C en 10 °C. De gegevensverzameling en -evaluatie werden uitgevoerd met Xcalibur software 2.0.7. SP1. Beide systemen waren uitgerust met een elektrospray-interface (ESI) waarbij tijdens de acquisitie uitsluitend gebruik werd gemaakt van negatieve ionisatie. Als droog- en botsingsgas werd stikstof gebruikt. De parameters van de ionenbron zijn samengevat in aanvullende tabel S2. Verder werd de overdraagbaarheid van de methode onderzocht met een LC-MS/MS systeem dat bestond uit een Agilent 1100 HPLC gekoppeld aan een AB Sciex 4000 triple quadrupole MS (Framingham, MA, USA).

Instrument condities

De Alternaria toxines worden gescheiden op een Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) UPLC kolom uitgerust met een 2,1 mm C-18 pre-kolom met behulp van lineaire gradiënt elutie. Vier oplosmiddelen (oplosmiddelen A, B, C en D) werden door de binaire pomp gemengd. Oplosmiddel A bevatte: acetonitril (ACN) + water (5:95), oplosmiddel B bevatte: ACN: 5% isopropylalcohol (IPA), oplosmiddel C bevatte: 100% methanol en oplosmiddel D bevatte: zuiver ammoniumacetaat. De stroomsnelheid was 0,5 ml/min. De mobiele fase van de oplosmiddelen in de begintijd was 0,0% A, 30% B, 30% C en 40% D. In de eindtijd (5 min) waren de oplosmiddelen 0,0% A, 30% B, 30% C en 40% D. Een voldoende wasstap in het gradiëntprogramma was nodig om de opgehoopte lipofiele matrixoplosmiddelen te verwijderen. De totale analysetijd bedroeg 5 min. De kolomthermostaat hield de temperatuur op 30 °C en het injectievolume bedroeg 1,0 μl. Het automatische monsternameapparaat werkte bij 20 °C.

Het UPLC LG 500 nm-systeem was gekoppeld aan een MS/MS-detector (Micromass Quattro Ultima PT) via een elektrospray-interface (ESI) die in negatieve modus werkt. De geoptimaliseerde ESI-instellingen waren als volgt: brontemperatuur 120 °C, desolvatietemperatuur 350 °C, drooggasdebiet 650 L/Hr, conusgasdebiet 30 L/Hr en capillaire spanning 3,50 kV. Als droog- en botsingsgas wordt stikstof gebruikt (2,67 × 10-6 bar). Tijdens de detectie werd de multimonitoringreactie (MRM)-modus toegepast in de MS en werden voor elk doeltoxine twee ionovergangen gescand. De MRM-modus werd toegepast in de MS/MS-detector en voor elke doelverbinding werden twee ionovergangen (kwantor en kwalificator) geregistreerd. De geselecteerde ionovergangen met de geoptimaliseerde spanningen (kegel of buislens), botsingsenergieën (CE) en verblijftijden zijn samengevat in tabel (Supplementary Table S2).

Beoordeling van toxicologisch potentieel van verschillende Alternaria mycotoxinen (TeA, AOH en AME)

Meting van de mate van celdood zoals geïnduceerd door verschillende mycotoxinen werden bepaald door losgemaakt blad inoculatie methode. Hiervoor werden verse bladmonsters losgemaakt van de in de kas geteelde planten en gedurende 3-4 min naar behoren gewassen in stromend leidingwater, gesteriliseerd in 1,0% (0,01 g/ml) natriumhypochloriet gedurende ongeveer 1 min en vervolgens aan het oppervlak afgeveegd met 70% ethanol, en tenslotte aseptisch grondig gespoeld met steriel gedestilleerd water. Ten slotte werden de bladeren op bevochtigd filtreerpapier gelegd en met een steriele naald aan het onderste oppervlak doorgeprikt. De toxines werden opgelost in steriel gedeïoniseerd water in een concentratie van 100 μg/ml. Druppels (100 µl) van elk van de drie toxines werden met een fijne naald (Dispovan, 1 ml) op de gewonde bladeren geïnjecteerd. Een controlemonster werd aangepast door injectie met steriel gedestilleerd water. De behandelde bladmonsters werden bewaard in een vochtige kamer (27 ± 0,5 °C temp. en 60% relatieve vochtigheid) onder kasomstandigheden (14 uur licht en 10 uur donkercyclus bij 27 °C). Een regelmatige observatie (om de 24 uur gedurende 6 dagen) werd uitgevoerd om eventuele veranderingen te ontdekken die relevant waren voor de toxicologische effecten die zich ontwikkelden in de geïnjecteerde monsters ten opzichte van de controlemonsters. De proefopstelling werd in drievoud uitgevoerd en het percentage aangetaste bladoppervlakte als gevolg van door toxiciteit veroorzaakte celdood werd gemeten met (Systronic bladoppervlakte meter 211) en berekend met de onderstaande formule.