Miniature bioreactors: current practices and future opportunities

Introduction

De komst van moleculaire biologie en genetische manipulatietechnologie in de laatste kwart eeuw heeft een dramatisch effect gehad op de farmaceutische/gezondheidszorgindustrie, waarbij een groot aantal van de vele toepassingen van deze technologie is gebaseerd op de mogelijkheid om recombinante cellijnen te creëren voor therapeutisch gebruik bij de mens. Naast de ontwikkeling van deze genetisch gemodificeerde organismen blijft er een behoefte bestaan om de wild-type produktiviteit te verbeteren, de screening van nieuw ontdekte microben te versnellen en de voortgang van verwante taken zoals de verbetering van groeimedium en procesoptimalisatie voort te zetten. Traditioneel vereist de ontwikkeling van celcultuurprocessen het screenen van grote aantallen cellijnen in schudkolfculturen, en van daaruit het verder testen van succesvolle kandidaten in bench-top bioreactoren voorafgaand aan studies op pilotschaal. De noodzaak om een groot aantal ontwikkelingsculturen uit te voeren heeft geleid tot de opmars en steeds wijder verbreide toepassing van kleinschalige bioreactorsystemen die een geminiaturiseerde, HT-oplossing voor procesontwikkeling bieden.

De belangrijkste celtypes die worden gebruikt om therapeutische producten te produceren zijn bacteriële en zoogdiercellen, die elk unieke voordelen en beperkingen bezitten die van invloed zijn op het type bioreactor dat voor procesontwikkeling wordt gebruikt. Bacteriële cellen zijn over het algemeen robuust en niet gevoelig voor beschadiging door afschuiving, wat betekent dat sterk schurende radiale waaiersystemen (bv. Rushton-turbines) en hoge agitatiesnelheden kunnen worden gebruikt. Hierdoor krijgen dergelijke bioreactoren een hoog massatransportvermogen, waardoor snel metaboliserende microbiële celkweek met hoge celdichtheid kan worden ondersteund en de hoeveelheid product die dergelijke bioprocessen kunnen opleveren, kan worden vergroot. Hoewel zoogdiercellen geen beschermende celwand hebben en dus meestal gevoeliger zijn voor afschuiving en een zachtere behandeling vereisen dan hun bacteriële tegenhangers, kunnen de meeste commercieel gebruikte cellijnen in geroerde tankbioreactoren worden gekweekt, zij het met aanpassingen aan het ontwerp. Bijvoorbeeld, lage-shear, mariene type axiale waaiers kunnen worden gebruikt in plaats van Rushton turbines om zachtjes circuleren de cellen en voedingsstoffen in een baffle-vrije omgeving; en shear beschermingsmiddelen zoals serum of Pluronic F-68 kan worden toegevoegd aan celkweekmedia .

Naast de ontwikkeling van therapeutische geneesmiddelen kunnen MBR’s worden gebruikt voor de ontwikkeling van groeimediums; stamverbetering door metabolic engineering of gerichte evolutie; en de zogenaamde bioprospectie van natuurlijke producten – allemaal processen die een grote bioreactorbelasting met zich meebrengen die kan worden verlicht door het gebruik van HT-miniatuurapparaten. MBR’s kunnen met name de arbeidsintensiteit en de materiaalkosten verminderen van het grote aantal celkweekjes dat nodig is bij de ontwikkeling van bioprocessen, waardoor het bereikbare niveau van parallellisme en verwerkingscapaciteit wordt verhoogd, en zijn als zodanig van toenemend belang. Het is belangrijk dat dergelijke apparaten, wanneer gebruikt voor procesontwikkeling, kunnen worden vertrouwd op het nauwkeurig nabootsen van bioreactoren op laboratorium- en proefschaal, zodat verwacht kan worden dat groeikinetiek en productexpressie – geoptimaliseerd op miniatuurschaal – kwantitatief kunnen worden opgeschaald.

Hoewel MBR’s ongetwijfeld beter in staat zijn HT te bedienen dan conventionele bioreactoren op laboratoriumschaal, zijn ze momenteel minder goed geïnstrumenteerd en hebben ze ook beperkte mogelijkheden voor off-line bemonstering vanwege de kleine volumes die worden gebruikt (variërend van ca. 0,1 ml tot ca. 100 ml); dit betekent dat er momenteel een wisselwerking bestaat tussen de informatie-inhoud in termen van gegevenskwaliteit en -kwantiteit die uit de bioreactor kan worden verkregen door zowel on-line als off-line metingen, en de experimentele doorvoer, zoals geïllustreerd in figuur 1. Aangezien nog geen enkel toestel alle uitdagingen van de miniaturisatie heeft opgelost, d.w.z. het nauwkeurig nabootsen van grootschalige procesomstandigheden en toch de volledige functionaliteit van conventionele bioreactoren behouden, is het de bedoeling van de auteurs de huidige ontwikkelingen te evalueren en vervolgens aan te geven waar de technologie in de toekomst waarschijnlijk zal evolueren, zodat de huidige HT-voordelen kunnen worden uitgebreid en de informatiekloof die momenteel bestaat tussen miniatuur- en laboschaalbioreactorplatforms kan worden verkleind. In dit overzicht zijn de verschillende beschreven MBR’s gegroepeerd op basis van hun agitatiemethode (d.w.z. schudden, roeren of gas spuiten) met verwijzing naar het type conventionele bioreactor dat zij nabootsen of waarvan zij zijn afgeleid; de belangrijkste specificaties en kenmerken van prototype- en gecommercialiseerde miniatuur celkweekapparatuur die parallel kan werken, zijn samengevat in tabel 1.

Miniatuur geschudde bioreactorsystemen

Geschudde systemen zijn in de bioprocessing gebruikt vanaf de allereerste pogingen om antibiotica-producerende microbiële culturen te kweken in de jaren veertig van de vorige eeuw. Zij worden nog steeds op grote schaal gebruikt in de industrie en de academische wereld als een instrument voor de ontdekking van geneesmiddelen, de optimalisering van media, stammen en producten, en procesontwikkeling. Er bestaan veel verschillende ontwerpen en volumes, gaande van shake-flacons van honderden milliliters tot microtiterplaten (MTP’s) met een volume van enkele microliters.

Shake flasks

De afgelopen vijftig jaar hebben wetenschappers celkweek in shake-flacons gebruikt als een middel voor procesontwikkeling op kleine schaal, met volumes gaande van ca. 10 ml tot 500 ml . Schudkolven zijn er in verschillende vormen, ze kunnen gemaakt zijn van glas of plastic en sommige hebben schotten om de beluchting en het mengen te bevorderen. Ze kunnen worden geschud met behulp van orbitaal of lineair schudden en kunnen worden ondergebracht in een kast met temperatuurregeling. Factoren die van invloed zijn op het kweken met schudkolven zijn de grootte van het vat, het vulvolume, het constructiemateriaal, de geometrie van de schotten, de schudfrequentie en het type stop dat wordt gebruikt om het vat af te sluiten. Volgens Büchs worden schudkolven naar schatting gebruikt voor meer dan 90% van alle kweekexperimenten in de industrie en de academische wereld, waarbij een breed scala van micro-organismen wordt gekweekt, bv. bacteriën, schimmels en gisten, alsook cellen van zoogdieren. Het is gemakkelijk te begrijpen waarom zij zo veel worden gebruikt: zij zijn een goedkope en doeltreffende manier om vele soorten industrieel-relevante celculturen voor procesontwikkeling reproduceerbaar uit te voeren. Bovendien zijn zij gemakkelijk te bedienen en grotendeels ongevoelig voor mechanische complicaties. Gedurende het grootste deel van de lange periode waarin zij zijn gebruikt, zijn er weinig significante wijzigingen in de technologie aangebracht, zonder online monitoring van de culturen en handmatige toevoegingen en bemonstering. Pas onlangs zijn er shake flasks met instrumenten geïntroduceerd, ontworpen om de pH- en DOT-niveaus online te meten en mogelijk te controleren. pH en opgeloste zuurstof kunnen worden gemeten met behulp van een rutheniumoxidekleurstof die kwantificeerbaar fluoresceert in de aanwezigheid van waterstofionen respectievelijk zuurstof wanneer zij met een LED-lamp wordt geëxciteerd. Deze kleurstof kan ofwel in een patch worden ingebouwd en in een kolf worden geplakt, ofwel op de tip van een optische vezelsonde worden gecoat en in de betrokken cultuur worden ondergedompeld. Andere parameters die nu online kunnen worden gemeten zijn de zuurstofoverdrachtssnelheid (OTR) en de koolstofdioxide-evolutiesnelheid (CER) – en daaruit kan het ademhalingsquotiënt (RQ) worden afgeleid. Wanneer dergelijke parameters online kunnen worden gevolgd, kunnen meer verfijnde celcultuurstrategieën worden uitgevoerd, zoals substraattoevoer op basis van veranderingen in de pH van de kweekbouillon ten gevolge van celmetabolisme. Bovendien hebben Akgün et al. onlangs een nieuw schudkolfsysteem ontwikkeld dat in staat is om continu te werken en daardoor de reikwijdte van parallelle bioprocesontwikkeling met behulp van schudsystemen vergroot.

Een belangrijke beperking van schudkolven is echter hun afhankelijkheid van oppervlaktebeluchting, wat leidt tot verminderde zuurstofoverdracht in vergelijking met geroerde tankreactoren (STR’s). Wittmann et al. rapporteerden totale volumetrische massaoverdrachtscoëfficiënt (kLa) waarden tot 150 h-1 in schudkolven. kLa waarden van 151 h-1 (600 ml, 200 rpm) tot 277 h-1 (100 ml, 200 rpm) zijn geregistreerd in een nieuw, doosvormig, schudkolfsysteem ontwikkeld door Kato en Tanaka , die voldoende hoog zijn om de meeste batch celcultivaties uit te voeren zonder de microbiële groei te remmen. Deze onderzoekers integreerden gasdoorlatende membranen in de bovenhoeken van hun prototypekolven, waardoor een effectievere gasstroom in het vat mogelijk werd tijdens het schudden, waardoor het probleem van de introductie van meer lucht in het systeem op een steriele manier, zoals bij conventionele schudkolven, werd ondervangen. Voor kweekdoeleinden waarbij de zuurstofbehoefte hoog is, kan de invoering van keerschotten de OTR bij lagere schudfrequenties verhogen; hoge snelheden kunnen echter leiden tot overmatig spatten, waardoor de gasdoorlatende stop (vaak gemaakt van watten) bovenaan de kolf verstopt kan raken door verzadiging van de vloeistof. Gebleken is dat een dergelijke obstructie het vermogen van het systeem om zuurstof over te brengen sterk vermindert, hetgeen problemen kan opleveren als een snel reagerende aerobe wordt gekweekt. Zuurstofgebrek zou de groeisnelheid kunnen vertragen, de productievormingssnelheid kunnen veranderen en/of ongewenste toxische bijproducten kunnen genereren, b.v. acetaatvorming door Escherichia coli.

Microtitreplaten

MTP’s (ook wel microwellplaten genoemd) werden voor het eerst geïntroduceerd in 1951 als een platform voor diagnostische tests en worden nog steeds op grote schaal gebruikt in de biowetenschappen. Zij verwerken diagnostische tests zoals enzyme-linked immunosorbent assays die gebruik maken van de mogelijkheid om vele identieke reacties parallel en op zeer kleine schaal uit te voeren. Het is dit voordeel dat ertoe heeft geleid dat MTP’s worden gebruikt als miniatuur geschudde bioreactoren in de screeningfase van de procesontwikkeling voor de evaluatie van cellijnen. De platen zijn meestal gemaakt van plastic, hoewel er ook glazen en metalen versies bestaan. Voor het mengen kan gebruik worden gemaakt van pipetaspiratie of magnetisch geagiteerde roerstaven; orbitaal schudden van de gehele plaat op een verwarmd blok waarmee de kweektemperatuur kan worden geregeld is echter veruit de meest gebruikelijke methode. Het aantal putjes in MTP’s is gewoonlijk 6, 12, 24, 96 en 384, en er zijn nu tot 1536 en 3456 putjes beschikbaar voor ultra high-throughput screening (UHTS) . De putjes kunnen rechthoekig of cilindrisch zijn, waarbij de vierkante geometrie het mengen en de zuurstofoverdracht bevordert door de werking van baffles na te bootsen. Platen met vierkante bodem werken op een soortgelijke manier door het wervelen van de vloeistof in de put te beperken en zo de turbulentie van het systeem te verhogen. Door de toename in oppervlakte veroorzaakt door een grotere vloeistofdissipatie langs de zijkanten van elke microwell en de verhoogde drijvende kracht voor zuurstof veroorzaakt door een betere menging, is OTR evenredig met de schudamplitude en frequentie, daarom kan het verhogen van deze parameters gunstig zijn. Bovendien hebben Hermann et al. gerapporteerd dat OTR omgekeerd evenredig is met het vulvolume, vooral bij hogere schudfrequenties. Er is echter een punt waarboven een toename van de agitatie resulteert in het morsen van procesvloeistof (tenzij de put is afgedekt – wat zijn eigen problemen heeft, met verminderde zuurstofoverdracht in de put). Evenals bij schudkolven is de relatief lage zuurstofoverdrachtscapaciteit van MTP’s (kLa-waarden tot 200 h-1 in 96 wells) het gevolg van het feit dat zij worden geschud en voor de massaoverdracht afhankelijk zijn van oppervlaktebeluchting. Kensey et al. rapporteerden daarentegen kLa-waarden met gebruikmaking van de sulfietoxidatiemethode tot 1600 h-1 in een MTP met 48 putjes en standaardgeometrie met een orbitale worp van 3 mm bij 1400 omwentelingen per minuut met een vulvolume van 300 μl, hetgeen vergelijkbaar is met conventionele STR’s. Door gebruik te maken van een berekende evenredigheidsconstante kon dit team de met een chemische methode verkregen zuurstofoverdrachtscapaciteit relateren aan biologische media.

Er zijn ook methoden beschikbaar voor de bepaling van kLa op kleine schaal die gegevens opleveren die rechtstreeks vergelijkbaar zijn met onder procesomstandigheden verkregen waarden. Zo hebben Duetz et al. en Doig et al. de kLa geschat door massabalans onder omstandigheden van zuurstofbeperking op basis van de lineaire groei van respectievelijk Pseudomonas putida in een MTP en Bacillus subtilis in een prototype miniatuur bubble column reactor (MBCR). Bovendien is de dynamische methode van uitgassing vaak te verkiezen boven de sulfietoxidatiemethode voor de bepaling van kLa-waarden, aangezien deze meestal in water wordt uitgevoerd . Bijgevolg is dit systeem coalescent en, hoewel het niet identiek is aan biologische media, is het representatiever voor celkweekomstandigheden dan de totaal niet-coalescente omstandigheden van de natriumsulfietmethode. Deze techniek is echter moeilijk te gebruiken in MTP’s omdat het schudden vaak moet worden gestopt vóór de DOT-meting om nauwkeurige meetwaarden te verkrijgen, waardoor het massatransportmilieu op een kritiek moment wordt gewijzigd. Wegens de problemen in verband met het gebruik van gevestigde methoden voor de bepaling van kLa in MTP’s hebben wij onlangs een nieuwe methode ontwikkeld die gebaseerd is op de bio-oxidatie van catechol door het enzym catechol-2,3-dioxygenase . Deze methode leverde vergelijkbare kLa waarden op als de dynamische vergassingsmethode en aangezien zij snel is en geen veronderstellingen over de kinetiek vereist, menen wij dat deze methode zeer geschikt is voor kLa evaluatie in MTP’s en andere kleinschalige apparaten.

MTP’s hebben ook in zekere mate te lijden onder het kenmerk dat hen juist aantrekkelijk maakt als een high-throughput apparaat – kleine volumes – omdat verdamping een aanzienlijk deel van de vloeistof in de put kan verwijderen . Er kunnen ademende membranen bovenop de platen worden geplaatst om deze verdamping te beperken, maar dan wordt het vermogen tot zuurstofoverdracht beperkt. Zimmermann et al. rapporteerden over een membraan dat een matige mate van waterretentie en zuurstofoverdracht bereikte; de kLa-waarden werden echter met een factor vijf verlaagd, waardoor het probleem van het geringe vermogen tot zuurstofoverdracht, dat inherent is aan schudsystemen, nog verergerd werd. Hoewel verdamping een potentieel probleem is in alle MBR’s, lijken MTP’s hier vatbaarder voor te zijn omdat zij doorgaans de kleinste procesvolumes gebruiken. MTP’s met 3456 putjes bieden de hoogste verwerkingscapaciteit van alle beschikbare miniatuur celkweekapparatuur, en er is aangetoond dat ze de groei van Chinese hamster-ovary (CHO)-cellen kwantitatief ondersteunen, hoewel zo’n minuscuul procesvolume (1 – 2,2 μl) betekent dat dit apparaat waarschijnlijk niet in staat zou zijn de mechanismen na te bootsen waarmee grotere geschudde vaten werken; zo zouden bijvoorbeeld oppervlaktespanningseffecten zich over het hele putje uitstrekken, waardoor de mengcapaciteit ernstig zou worden beperkt. Bovendien zou geen verwijdering van medium voor off-line bemonstering mogelijk zijn.

Hoewel MTP’s op grote schaal worden gebruikt in discovery onderzoek hebben zij geleden onder een gebrek aan instrumentatie op een vergelijkbare manier als shake flasks, waardoor het bereik van de gegevens die kunnen worden verzameld beperkt is. Recentelijk zijn er echter technieken ontwikkeld om pH en DOT in dergelijke systemen te meten. Lye en collega’s hebben bijvoorbeeld het effect van pH-regeling op de opbrengst van biomassa en de groeikinetiek van een filamenteuze bacterie in een MTP bestudeerd. Ondanks enkele van de inherente beperkingen van MTP’s bij het uitvoeren van celkweek, is vooruitgang geboekt bij de karakterisering van het mengen, de massaoverdracht en de instrumentatie van deze vaten, wat betekent dat de unieke voordelen van deze apparaten in termen van automatiseringspotentieel en intrinsieke HT-capaciteit leiden tot hun toenemend gebruik als MBR’s in een vroeg stadium.

Spinbuizen

De ontwikkeling van kleinschalige zoogdiercelcultuurprocessen in een vroeg stadium is traditioneel uitgevoerd in T-flessen en kleinschalige bioreactoren (vaak spinnerflessen, meestal met een volume van 500 ml) . Hoewel de apparaten aanvankelijk grotendeels ongedefinieerd waren, is er werk verricht om de technische omgeving in spinnerflessen te karakteriseren, waardoor ze gemakkelijker als schaalvaten kunnen worden gebruikt. Toch blijft het een feit dat hun relatief grote volume hen niet-levensvatbaar maakt als HT-technologie, hetgeen betekent dat er een reële behoefte bestaat aan miniatuurbioreactoren die samen met zoogdiercellen kunnen worden gebruikt voor parallelle celkweek. Recentelijk zijn spinbuizen ontwikkeld en gebruikt als een kleinschalig procesontwikkelingsinstrument voor de kweek van zoogdiercellen. De spinbuizen die voor het eerst werden beschreven door De Jesus et al. blijken verschillende voordelen te bieden ten opzichte van spinnerflessen, zoals een kleiner procesvolume. Zij zijn sindsdien gecommercialiseerd door ExcellGene SA (Valais, Zwitserland) onder de naam TubeSpin Satellites. Deze kweekvaten bestaan uit gemodificeerde centrifugatiebuizen van 50 ml die zijn gemonteerd op een roterend orbitaal schudapparaat dat in een incubator is geplaatst. De kweekvolumes bedragen 5 ml tot 35 ml per reactor en de off-line-analyse wordt uitgevoerd met gebruikmaking van volledige buizen op offerbasis. Dit systeem beschikt niet over de nodige instrumenten om volledig gekarakteriseerde zoogdiercelculturen uit te voeren; het is echter een nuttig instrument voor media-optimalisering en productiviteitsverhoging en geeft de ontwikkeling van celculturen een high-throughput aspect, waarbij de ontwikkelaars van dit systeem melding maken van de mogelijkheid om 1000 verschillende culturen per week te verwerken. Het relatief grote volume en de lage verdampingssnelheden die in dit apparaat worden aangetroffen, zijn activa bij de behandeling van langzaam groeiende zoogdiercellen, waarbij de culturen vele dagen kunnen duren, maar er moet op worden gewezen dat er geen technische karakterisering van vermenging en massaoverdracht in dit systeem is uitgevoerd en dus worden spinbuizen grotendeels gebruikt voor screeningstoepassingen.

Miniatuur geroerde bioreactorsystemen

Miniatuur geroerde bioreactoren (MSBRs) op basis van conventionele STRs zijn ontwikkeld als alternatief voor geschudde MBR-systemen voor procesontwikkeling in een vroeg stadium en celkarakterisering. Gewoonlijk zijn deze toestellen sterk gemodelleerd naar bioreactoren op laboratoriumschaal en bieden zij dus meer mogelijkheden voor monitoring en controle dan andere miniatuurbioreactorplatforms. Zij hebben gewoonlijk een procesvolume dat het midden houdt tussen dat van MTP’s en shake flasks en de constructiematerialen variëren sterk, waarbij perspex, Pyrex, poly-methylmethacrylaat (PMMA) en roestvrij staal alle worden gebruikt. Figuur 2 illustreert ons prototype MSBR met een werkvolume van 18 ml, dat is vervaardigd van roestvrij staal en Pyrex en uitgerust met optische sondes om pH en DOT online te meten. Dit vat is gekarakteriseerd wat betreft zijn mengefficiëntie en vermogen tot zuurstofoverdracht. Er is aangetoond dat het in staat is conventionele STR’s na te bootsen in celkweken met variërende reologie, afschuifgevoeligheid en zuurstofbehoefte (d.w.z. de filamenteuze bacterie Saccharopolyspora erythraea die erytromycine produceert en recombinant E. coli die respectievelijk plasmide-DNA en antilichaamfragment produceert). Het toestel kon met succes een reeks organismen kweken dankzij de relatief hoge kLa-waarden (480 h-1 bij 7000 omwentelingen per minuut volgens de dynamische uitgassingsmethode) en de korte mengtijden (4,8 s bij 7000 omwentelingen per minuut – meer dan tweemaal zo snel als een 7 L vat op basis van een gelijke specifieke vermogensinput). Hoge zuurstofoverdrachtssnelheden ondersteunden de groei van snel respirerende organismen (E. coli), terwijl effectieve menging het vat in staat stelde homogene omstandigheden te handhaven bij het werken met viskeuze fermentatiebouillons – vaak aangetroffen bij het kweken van filamenteuze organismen. De roersnelheid kon ook zeer nauwkeurig worden geregeld, wat hielp om schade aan sheargevoelige myceliumorganismen door overmatige stroomtoevoer te voorkomen. Bovendien is het gasverbruik van het vat gemeten, wat heeft geleid tot de berekening van het vermogensgetal van de waaier over een breed scala van bedrijfsomstandigheden, zodat celkweken op betrouwbare wijze kunnen worden teruggeschaald op basis van een gelijk specifiek opgenomen vermogen . Hoewel deze MSBR een prototype is, zou het mogelijk zijn een dergelijk apparaat te multiplexen om een hogere verwerkingscapaciteit te verkrijgen.

Door het vat te roeren en actief te beluchten, zijn in de literatuur voor andere MSBR’s massa-overdrachtssnelheden gerapporteerd die in de buurt komen van een conventionele STR op laboratoriumschaal. Lamping et al. meldden bijvoorbeeld kLa-waarden van 360 h-1 bij 1 VVM en 3000 omwentelingen per minuut met behulp van de dynamische uitgassingsmethode in een prototype van een MSBR waarvan het ontwerp vergelijkbaar is met dat in figuur 2. Bovendien heeft hetzelfde team met succes de zuurstofoverdracht in een prototype van een miniatuurbioreactor gemodelleerd met behulp van computationele vloeistofdynamica (CFD), die was gebaseerd op de relevante technische parameters van het snelheidsveld, de belgrootte, de gasophoping en de energiedissipatiesnelheden binnen de MBR.

Puskeiler et al. hebben onlangs kLa-waarden van meer dan 700 h-1 (12 ml volume) en zelfs 1600 h-1 (8 ml volume) gerapporteerd voor een MSBR die bij 2300 omwentelingen per minuut wordt geagiteerd. Dit systeem maakt gebruik van een nieuwe gasinducerende waaier die resulteert in een zeer hoog zuurstofoverdrachtscapaciteit. In die studie werd de dynamische uitgassingsmethode gebruikt om kLa te meten, hoewel er niet-coalescente omstandigheden werden gebruikt, waardoor een directe vergelijking met waarden uit celcultivatiemedia of coalescente vloeistoffen moeilijk is. In hetzelfde document werd het vermogen van het systeem om fed-batch celkweek te ondersteunen beschreven, wat het potentieel illustreert van miniatuur bioreactor technologieën om dergelijke industrieel belangrijke strategieën te ondersteunen. Bovendien werd de haalbaarheid van online monitoring en controle aangetoond. Het in dat verslag beschreven apparaat, ontworpen in samenwerking met H+P Labortechnik AG (Oberschleissheim, Duitsland), is een geïntegreerde eenheid (“Bioreactor Block”) die tot 48 celcultivaties tegelijk kan ondersteunen. Een geïntegreerd vloeistofbehandelingssysteem maakte het mogelijk de pH-line te meten met een frequentie van één uur door monsters van 20 μl te dispenseren in in de handel verkrijgbare MTP’s met aangebrachte pH-patches. Acht minuten later werd met hetzelfde vloeistofbemonsteringssysteem de pH aangepast met 4 M NaOH. Hoewel het gebruik van geautomatiseerde vloeistofverwerking om de pH te controleren een nette oplossing is, erkenden de auteurs dat dit onpraktisch kan zijn bij gebruik met gevoelige organismen die een meer responsieve pH-aanpassing vereisen. In het verslag wordt echter gesteld dat samen met industriële partners een verbeterd bewakingssysteem wordt ontwikkeld om frequenter toezicht mogelijk te maken, waardoor het aantal gelijktijdige fermentaties dat effectief kan worden bewaakt, kan worden verhoogd. DOT werd in het systeem gemeten met behulp van een prototype van een sensorblok met optische sondes, hoewel slechts 8 reactoren van de 48 kweekvaten gelijktijdig werden bewaakt . Een dergelijk apparaat kan ook worden geïntegreerd met standaard robotapparatuur voor het uitvoeren van vloeistofbehandelingstaken zoals inoculatie, voeding en bemonstering.

Vanuit een andere benadering heeft Fluorometrix Corporation (Stow, Massachusetts, VS) een MSBR-constructie met meerdere vaten ontwikkeld, Cellstation® genaamd. Deze MBR maakt gebruik van optische technologie om in situ on-line controle mogelijk te maken van maximaal 12 parallelle culturen voor pH , DOT en optische dichtheid (OD) en de agitatie wordt verzorgd door dubbele schoepvormige waaiers. Elk vat heeft een werkvolume tot 35 ml en is bevestigd aan een carrousel die roteert zodat alle vaten sequentieel kunnen worden bemonsterd en gecontroleerd. Het optische sensorsysteem is gevalideerd door de consistentie aan te tonen van de pH- en DO-sensoren over een periode van 70 uur in een zoogdiercelkweekproces. Bovendien heeft Rao’s onderzoeksgroep aan de Universiteit van Maryland, die nauwe banden heeft met het bedrijf, onlangs details gepubliceerd van twee prototype 24-wells MSBR-systemen die de doorvoer van deze technologie verder verbeteren .

Parallel aan deze MSBR-ontwikkelingen heeft Dasgip AG (Jülich, Duitsland) de Stirrer-Pro Flask geïntroduceerd, die deel uitmaakt van hun Fedbatch-Pro® celcultivatieserie, die tot 16 kweekvaten (werkvolume 200-275 ml) omvat en een agitatie-gedreven zuurstofoverdrachtscapaciteit en een fed-batch mogelijkheid biedt. pH en DOT kunnen worden gecontroleerd met standaard steriliseerbare sondes en onafhankelijk voor elk vat worden geregeld door respectievelijk automatische toevoeging van zuur/base-vloeistof en variatie in luchtstroomsnelheid/agitatie. Substraattoevoeging kan worden gekoppeld aan DOT- of pH-triggermomenten, waardoor een volledig geautomatiseerde feed-batch mogelijk is. De combinatie van mechanische agitatie (tussen 10 – 1000 omwentelingen per minuut) en het spuiten van gas geeft aan dat dit systeem in staat is snelgroeiende bacterieculturen te ondersteunen tot een hoge celdichtheid en daarom nuttig zou zijn bij de ontwikkeling van dergelijke bioprocessen. Het gebruikte werkvolume is echter relatief groot in vergelijking met de meeste andere besproken systemen en de opstelling wordt bemoeilijkt door de aanwezigheid van een groot aantal buizen en draden voor toevoegingen en metingen. Een variant van dit systeem met maximaal 16 shake flasks uitgerust met pH-sondes is ook ontwikkeld om intermitterende voeding en parallelle pH-regeling mogelijk te maken.

Als een kleiner alternatief voor lab-scale STR’s die parallel kunnen werken, zoals het Sixfors® systeem ontwikkeld door Infors AG (Bottmingen, Zwitserland), hebben onderzoekers van het University College London, in samenwerking met BioXplore biactor business van HEL Group (Barnet, UK) een 4 – 16 kamer MBR-systeem ontwikkeld en gekarakteriseerd met volledig geïntegreerde en geautomatiseerde regeling van DOT en pH. Hoewel elk vat een maximaal werkvolume van 100 ml heeft en dus aan de bovengrens van de MSBR-technologie zit, is de ontwikkeling van autonome software om dergelijke bioreactoren te controleren een stap in de richting van het geven van MBR’s met dezelfde mate van controle en automatisering als conventionele bioreactoren.

Miniatuur-bellenkolomreactoren

Bellenkolommen maken gebruik van gasspatting in plaats van agitatie als middel om vermenging en zuurstofmassaoverdracht voor celkweek te bevorderen. Als alternatief voor geroerde of geschudde apparaten hebben we een miniatuur bubble kolom reactor (MBCR) die is gebaseerd op een MTP met poreuze membranen (fritten) fungeren als de gehele basis om elke individuele put . De lucht dringt door de frits en stroomt door elke well, waardoor zuurstof wordt geleverd voor elke groeiende cultuur. Op voorwaarde dat elke frit vervaardigd is volgens een hoge specificatie en een identieke mate van porositeit heeft, is het debiet naar elke kolom gelijk en kan het worden berekend. Dit voorkomt dat variaties in de luchtstroomsnelheid de resultaten kunstmatig beïnvloeden.

Doig et al. beschrijven de constructie en karakterisering van een prototype MBCR met 12 putjes dat geschikt is voor de aërobe kweek van Bacillus subtilis-culturen met elke kolom een werkvolume van 2 ml. kLa-waarden werden gerapporteerd tot 220 h-1 met gebruikmaking van de dynamische uitgassingsmethode bij een oppervlakkige gassnelheid van 0,02 ms-1. Een van de voordelen van dit type toestel is dat, in tegenstelling tot een MTP, de beluchting gebeurt via direct sparging. Dit heeft tot gevolg dat het vermogen van het systeem om zuurstofmassa over te brengen wordt vergroot ten opzichte van een MTP, omdat door het spargen het oppervlak dat beschikbaar is voor de massaoverdracht van gas naar vloeistof groter wordt dan bij beluchting aan de oppervlakte alleen. Hoewel sommige kLa-gegevens voor MTP’s in dit overzicht aanzienlijk hoger zijn dan de gemeten MBCR-waarden, moet erop worden gewezen dat veel van de MTP-waarden zijn afgeleid onder tamelijk kunstmatige omstandigheden die zijn ontworpen om de zuurstofoverdracht te maximaliseren, terwijl de kLa-waarden voor de MBCR die hierboven zijn weergegeven, reproduceerbaar zouden zijn onder celkweekomstandigheden.

Naast een groot oppervlak dat beschikbaar is voor zuurstofoverdracht, betekent het ontbreken van agitatie in MBCR’s dat de vermogensinput, en dus de zuurstofoverdracht, gemakkelijker te modelleren is dan in STR’s, omdat er minder parameters zijn om rekening mee te houden, waarbij de oppervlakkige gassnelheid en de grootteverdeling van de bellen belangrijke parameters zijn bij het opschalen/afschalen van bubble-kolommen . Bovendien is het apparaat stationair, in tegenstelling tot schudden, wat de instrumentatie vergemakkelijkt, aangezien de agitatie van de meeste MTP-systemen moet worden gestopt voordat meting in een plaatlezer kan plaatsvinden. De mechanische eenvoud in combinatie met een potentieel hoge zuurstofoverdracht en het gemak van bemonstering maakt MBCR’s geschikt voor parallelle celkweek. Dit zou onder meer kunnen gebeuren met het oog op de verbetering van medium of stam en de ontwikkeling van processen in een vroeg stadium. MBCR’s zouden ook kunnen worden gebruikt om de prestaties van grootschalige reactoren na te bootsen en te voorspellen. In dit verband hebben wij onlangs een goede correlatie aangetoond van de zuurstofoverdrachtssnelheid met het volumetrisch opgenomen vermogen (P/V) voor miniatuur- (2 ml) en laboratorium-schaal (100 ml) bubbelkolommen met gasdiffusors met dezelfde poriegrootte, waardoor kLa kan worden voorspeld als functie van P/V . In hetzelfde werk toonden we ook een vergelijkbare celkweekprestatie aan met de MBCR in vergelijking met een STR op laboratoriumschaal op basis van gelijke kLa-waarden. Deze resultaten wijzen op het potentieel van de MBCR als een scale-down apparaat. Dit prototype MBCR-apparaat was niet geïnstrumenteerd, hoewel wij in latere werkzaamheden dit apparaat hebben uitgerust met optische fluorescentiepatches en het hebben gebruikt om de DOT tijdens de celkweek te meten. De temperatuur kon worden geregeld door het apparaat aan een waterbad te koppelen en temperatuurgeregeld water door de ingesloten ruimte tussen de kolommen te laten circuleren (zie figuur 3). Soortgelijke MBCR’s zijn eerder door anderen ontwikkeld; deze vaten gebruiken echter volumes van ca. 200 ml en zijn dus twee orden van grootte groter dan het door Doig e.a. beschreven apparaat, waardoor de mate van parallelle werking die kan worden bereikt, wordt beperkt.

Andere miniatuurapparaten

Met gebruikmaking van het concept van een geïntegreerde sensorplaat heeft MicroReactor Technologies (Mountain View, CA, VS) een hybride celkweeksysteem ontwikkeld op basis van een geschudde MTP met 24 putjes en een configuratie van de putjes die een uniforme warmteoverdracht over de plaat mogelijk maakt. Het voorgestelde werkvolume van elke well varieert van 3 tot 5 ml en lucht wordt in de vloeistoffase gebracht door sparging via sinters onderaan elke well, waardoor het vermogen tot zuurstofoverdracht wordt vergroot in vergelijking met gelijkaardig ontworpen schudsystemen. Dit onlangs gecommercialiseerde kweekapparaat (in Europa in licentie gegeven door Applikon Biotechnology AB, Nederland) is uitgerust met glasvezelsondes om de DOT en de pH in alle wells tegelijk online te controleren. Het toestel maakt ook onafhankelijke regeling van temperatuur, DOT, pH (via gas sparging) en luchtdebiet voor alle 24 wells mogelijk. Het toestel overwint een van de fundamentele problemen bij op MTP gebaseerde HT-toestellen – namelijk hoe instrumentatie aan te brengen in alle wells van de plaat – door alle sensorpatches aan de basis van elke well te bevestigen en vervolgens de volledige plaat op een schuddend incubatorplatform te plaatsen dat over geïntegreerde instrumentatiecircuits beschikt, waardoor elke well onafhankelijk kan worden gemonitord. De belangrijkste toepassing is waarschijnlijk in de eerste fasen van de procesontwikkeling (b.v. selectie van stammen en optimalisering van mediums). Er zijn nog geen gegevens openbaar beschikbaar over de technische karakterisering van de menging en de zuurstofoverdracht en de vergelijking van de kweekprestaties met gegevens van bioreactoren op laboratoriumschaal.

Er zijn recente ontwikkelingen geweest om de schaal van MBR’s te verkleinen tot submiliter procesvolumes. Hoewel deze miniatuursystemen de grootste mogelijkheden bieden voor HT-toepassingen, is er een praktische grens aan hoe klein de kweekvolumes kunnen worden. Apparaten die een te klein procesvolume gebruiken, kunnen het ondoenlijk vinden om kweken uit te voeren met voldoende monitoring en bemonstering. Hoewel OD, DOT en pH online kunnen worden gecontroleerd, zijn andere kritische parameters zoals substraatconcentratie en productopbrengst dat vaak niet; het kan echter mogelijk zijn dit probleem voor bepaalde processen te omzeilen door markers zoals groen fluorescerend eiwit in het product op te nemen. Verdamping kan een belangrijk probleem worden in zulke extreem kleine kweekvolumes als gewerkt wordt met lange kweekprocessen van bacteriële en zoogdiercellen; ook zou het, gezien het extreem kleine procesvolume, technisch een uitdaging zijn om de pH nauwkeurig te regelen door vloeistoftoevoeging. Desondanks betekent de schaalgrootte een radicale vooruitgang in het ontwerp van MBR’s en verhoogt hun potentieel gebruik voor HT parallelle celkweek aanzienlijk.

In dit verband heeft Jensen’s onderzoeksgroep aan het MIT een sub-milliliter MBR prototype ontwikkeld dat is aangepast en uitgebreid tot een multiplexed systeem dat in staat is om acht geïnstrumenteerde micro-cel cultivaties uit te voeren met werkvolumes van 150 μl . Met gebruikmaking van standaard microfabricagemethoden worden de kweekputjes van PMMA en poly(dimethylsiloxaan) (PDMS) geïmmobiliseerd op een aluminium basis die alle sensorelementen bevat en wordt zuurstofoverdracht mogelijk gemaakt via diffusie door een gasdoorlatend membraan en magneetroerders waarmee de agitatie voor elke reactor afzonderlijk kan worden geregeld. DOT, pH en OD kunnen online worden gecontroleerd met optische sondes. De groep rapporteerde dat het apparaat batchculturen van E. coli kan ondersteunen, maar dat de DOT na 2-3 uur daalde tot 0%, mogelijk als gevolg van zuurstofbeperking. Dit is waarschijnlijk aangezien de max. kLa waarde gemeten in deze MBR slechts 75 h-1 bedroeg. Niettemin toonden de auteurs aan dat het groeigedrag vergelijkbaar was met dat verkregen met een reeks grotere celcultuurtoestellen. Dezelfde onderzoeksgroep detailleerde ook DNA microarray genexpressieanalyse van E. coli gekweekt in een 50 μl MBR . Dit werk betekent een echte stap voorwaarts in de ontwikkeling van MBR’s, aangezien het niet alleen het principe bewijst, maar ook een zeer parallelle analyse van genexpressie mogelijk maakt en kan worden gebruikt om het begrip van de celfysiologie tijdens de kweek te verbeteren door middel van een benadering op systeemniveau. Maharbiz et al. meldden de ontwikkeling van een array-gebaseerd toestel dat microwell reactoren combineert met silicium microfabricage technologie en dat in staat is de E. coli kweek in acht putjes van 250 μl gelijktijdig te ondersteunen. Vergelijkbaar met de MIT-reactor (hierboven beschreven) waren de putjes gesitueerd op een basisplaat met sensoren voor pH- en OD-metingen (DOT werd niet gemeten, maar de auteurs verklaren dat dit haalbaar zou zijn). Zuurstof werd elektrochemisch gegenereerd in elke cultuur en de agitatie werd verzorgd door een roestvrij stalen kraal die de cultuur mengde, zuurstof verspreidde en oppervlakteschuim opbrak. Dit onderzoeksteam verstrekte echter geen vergelijkende gegevens op bankschaal aan de hand waarvan kon worden bepaald of schaalvergroting met een dergelijk apparaat haalbaar zou zijn.

Een ander commercieel systeem voor HT-werking is ontwikkeld door Bioprocessors Corp. (Woburn, MA, VS) ontwikkeld. Dit celkweekapparaat (SimCell® genaamd) kan tot 1500 culturen bedienen en onafhankelijk regelen, waardoor het gebruik van full factorial experimentele ontwerpmethoden voor procesoptimalisatie mogelijk wordt. Dit “reactor-op-een-chip”-apparaat is gebaseerd op een microfluïdisch ontwerp met een gasdoorlatend membraan dat zuurstofoverdracht mogelijk maakt en menging wordt verkregen door de micro-bioreactor-array-chips in milieugecontroleerde incubatoren te laten roteren met gebruikmaking van bevochtigde lucht om verdamping tot een minimum te beperken. Dit systeem kan in hoge mate worden geautomatiseerd en is geïntegreerd met een robot voor het overbrengen van platen uit een incubator naar een meetstation voor het meten van pH, DOT en celdichtheid en een vloeistofstation waar toevoegingen van media voor fed-batch werking en zuur/base voor pH-regeling kunnen worden gedaan. De volumes in elke reactor variëren van ca. 300 μl tot ca. 700 μl, afhankelijk van de toepassing (microbiële of zoogdiercellen) en elke reactor kan worden gebruikt in batch-, fed-batch- of perfusiemodus. Aangetoond is dat met het apparaat E. coli en gist kunnen worden gekweekt, waarbij de groeikinetiek vergelijkbaar is met die van conventionele STR’s. Het bedrijf heeft ook de groei beschreven van CHO-cellen zonder zuurstofbeperking bij hoge celdichtheid en heeft computationele vloeistofdynamica (CFD)-simulaties gebruikt om aan te tonen hoe de fysieke omgeving die in grootschalige bioreactoren met schuine bladen wordt gezien, opnieuw is gecreëerd. kLa in het systeem is gemodelleerd door CFD en geschat op tussen 60 en 500 h-1, waarden die vergelijkbaar zijn met die welke in shake-flacons en suboptimale STR’s worden aangetroffen .

MBRs als een scale-down tool

Opgemerkt moet worden dat niet alle miniatuur cel-cultivatie systemen zijn ontworpen voor het opschalen/afschalen van bestaande bioprocessen; het is in deze review vermeld hoe dergelijke apparaten kunnen worden gebruikt voor vele toepassingen, zoals in een vroeg stadium recombinant/wild-type organismen beoordelen, stam verbetering en groeimedium ontwikkeling. De miniatuursystemen die in de latere stadia van de procesontwikkeling worden gebruikt, b.v. voor de optimalisering van de werking en de kweekomstandigheden, moeten echter schaalbaar zijn. Daarom is het van vitaal belang dat de gevestigde “vuistregel”-methoden die vaak in de industrie worden gebruikt om processen op te schalen van werkbanken naar productievaten, worden onderzocht om na te gaan of zij kunnen worden gebruikt om MBR’s op te schalen. Deze beproefde methodes omvatten schaalvergroting op basis van gasvermogen per volume-eenheid, snelheid van de roertip, constante DOT, zuurstofmassaoverdrachtscapaciteit (kLa) of mengtijd. Er bestaat echter geen “one size fits all”-benadering en daarom moet worden benadrukt dat geen enkele basis voor gelijkwaardigheid universeel kan worden toegepast op alle MBR’s. Geen van de systemen die in dit overzicht worden besproken, kan gebruik maken van alle hierboven beschreven gevestigde methodes voor opschaling/afschaling. Een constante DOT-waarde is bijvoorbeeld moeilijk te bereiken in geschudde systemen in vergelijking met conventionele STR’s, aangezien het ontbreken van mechanische agitatie (en sparging – in het geval van op MTP gebaseerde systemen) betekent dat de controle van DOT-niveaus boven een kritisch niveau in deze apparaten technisch zeer moeilijk is. Dit specifieke kenmerk is op zichzelf geen probleem zolang de gekweekte cellen voldoende traag groeien (hetzij van nature of door het gebruik van een zwak groeimedium en/of het werken bij een temperatuur die niet bevorderlijk is voor een maximale groeisnelheid), maar het beperkt wel het gebruik van dergelijke systemen voor het uitvoeren van veel processen met hoge celdichtheid waarbij snelgroeiende micro-organismen met een hoge zuurstofbehoefte betrokken zijn.

Een indicatie van welk schaalverkleiningcriterium moet worden gebruikt voor een bepaald bioproces (en derhalve een indicatie van welk miniaturisatieplatform voor dat proces de voorkeur verdient) kan worden verkregen door de celkarakteristieken en de procesomstandigheden van het bioproces in kwestie te bestuderen. Voor een snelgroeiend organisme zoals E. coli of Bacillus subtilis is het meestal de zuurstofoverdracht die limiterend wordt, terwijl schuifspanning waarschijnlijk geen groot probleem zal vormen; daarom kan de schaalverkleining van een dergelijke celkweek worden ontworpen op basis van een gelijk specifiek opgenomen vermogen, of op basis van een gelijke kLa. Een vereiste voor het kiezen van gelijke kLa is echter dat het vermogen dat in de miniatuurbioreactor wordt ingebracht, nauwkeurig kan worden geraamd. Werk uitgevoerd aan de UCL in een 10 ml MBR bevestigt eerder werk van Bujalski et al. dat aantoonde dat het vermogen van de waaier afneemt naarmate de vaartuigdiameter toeneemt. Daarom is het belangrijk om geen impeller-vermogensgetallen op conventionele schaal te gebruiken voor het schatten van het opgenomen vermogen in MBR’s, omdat dit kan leiden tot zuurstofbeperking van snel reagerende microben door overschatting van het vermogen dat naar het systeem wordt overgebracht.

Een bijzondere uitdaging is de groei van filamenteuze organismen vanwege hun complexe morfologie. Fermentatiebouillons die dergelijke organismen bevatten, hebben een relatief hoge viscositeit en vereisen extra vermogensinbreng om een adequate menging en massaoverdracht te handhaven. Bovendien zijn filamenteuze organismen veel groter dan eencellige bacteriën en kunnen zij gevoeliger zijn voor beschadiging door afschuiving. Heydarian et al. meldden bijvoorbeeld dat de gemiddelde hyphaallengte van de erytromycineproducerende bacterie Saccharopolyspora erythraea groter was dan de Kolmogorov-microschaal van turbulentie in een standaardbioreactor van 7 liter over een groot bereik van werkingsomstandigheden. In het geval van S. erythraea is aangetoond dat de vorming van erytromycineproducten kan worden beïnvloed indien de mycelia overmatig worden geschoren, wat resulteert in een te korte hyphaallengte. Om deze reden kan het raadzaam zijn om bij het gebruik van filamenteuze organismen de snelheid van de tip als basis voor de schaalverkleining te kiezen. Hoewel de mechanismen die ten grondslag liggen aan pelletvorming in filamenteuze culturen niet goed worden begrepen, hebben Vecht et al. een correlatie gerapporteerd tussen afnemende OTR en een afname van de gemiddelde pelletgrootte in Streptomyces tendae . Zij concludeerden dat pelletvorming in dat organisme voornamelijk te wijten is aan hydrofobe interacties die door DOT worden gecontroleerd. Gezien het nadelige effect dat pelletvorming kan hebben op de productie van secundaire metabolieten in veel filamenteuze organismen – als gevolg van de remming van de zuurstofopname in het midden van de pellet, die toeneemt met de diameter van de pellet – is het duidelijk dat voor de schaalverkleining van processen voor de kweek van filamenteuze cellen, MBR’s de opgeloste zuurstofniveaus moeten handhaven die voorkomen in het grootschalige proces waarop de schaalverkleining is gebaseerd, om de productopbrengst te handhaven. Een gelijkwaardig kLa is moeilijk te gebruiken voor schaalverkleining, aangezien het gewoonlijk berekend wordt in modelsystemen die weinig gelijkenis vertonen met reële fermentatiebouillons. Bovendien wordt kLa beïnvloed door veranderingen in de coalescentie en reologie van de kweekbouillon in de loop van een kweekproces – veranderingen die zeer moeilijk te meten en te verantwoorden zijn. De sleutel bij het kiezen van een basis voor bioreactor scale-down is om de cellen niet bloot te stellen aan spanningen boven die op grote schaal.

Van de miniatuur apparaten besproken in dit overzicht, is het duidelijk dat sommige proberen grootschalige bioreactoren repliceren in hun geometrie. Zo zijn de meeste MSBR’s en MBCR’s geometrische facsimile’s van grootschalige bioreactoren. Het behoud van de geometrische gelijkenis heeft voordelen voor een doeltreffende schaalvergelijking omdat bepaalde belangrijke veronderstellingen geldig kunnen blijven; zo helpt het behoud van een gelijke aspectverhouding om de hydrostatische druk en bijgevolg de zuurstofoplosbaarheid op verschillende werkingsschalen te voorspellen. Dit biedt dergelijke apparaten het voordeel dat hun mechanismen voor het tot stand brengen van zuurstofoverdracht en menging en voor het berekenen van het opgenomen vermogen kunnen worden gebaseerd op dezelfde principes die op grote schaal zijn vastgesteld. De vloeistofdynamica zal vergelijkbaar zijn, hoewel het belangrijk is op te merken dat sommige dimensieloze getallen die de vloeistofdynamica beschrijven, bijvoorbeeld het getal van Reynolds in roervaten, minder invloed lijken te hebben op dergelijke kleine schalen. Fundamenteler is de vraag hoe doeltreffend MBR’s kunnen zijn wanneer zij zo klein worden dat hun stromingseigenschappen en mechanismen voor massaoverdracht en menging verschillen van die in de grootschalige bioreactoren die zij trachten na te bootsen. MTP’s zijn in dit opzicht bijzonder kwetsbaar omdat ze niet mechanisch worden bewogen, zodat oppervlaktespanningseffecten belangrijker zijn dan in MSBR’s, waar schoepen dit effect kunnen verminderen en kunnen helpen om een effectieve vloeistofmenging te handhaven. Bovendien bestaat bij extreme omstandigheden met MBR’s (wat betreft schudfrequentie en vulvolume) het gevaar dat alle procesvloeistof een dunne film vormt langs het inwendige oppervlak van de put, waardoor de vermenging ernstig wordt beperkt en het nadelige effect van oppervlaktespanning nog wordt verergerd. Verschillende stromingsregimes in MBR’s als gevolg van verschillende agitatiemethoden kunnen van invloed zijn op het vermogen van dergelijke systemen om op reproduceerbare wijze celkweken uit te voeren; als de omstandigheden op kleine en grote schaal qua menging en gas-vloeistof-massaoverdracht verschillen, kan dit tot problemen leiden, bijvoorbeeld de selectie van klonen die niet geschikt zijn voor productie of verschillen in de kwaliteit van het product, vooral bij recombinante eiwitten. Anderzijds blijkt uit het werk van Micheletti et al. dat schaalvergroting van geschudde naar geroerde systemen haalbaar is indien de schaalvergrotingscriteria zorgvuldig worden gekozen. Met behulp van een recent geïntroduceerde correlatie voor kLa voorspellingen in MTP’s waren zij in staat om met succes de kweek van E. coli waarin een transketolase-enzym wordt overgeëxpresseerd van een microwellsysteem (volume 1 mL) naar een STR van 1,4 L op basis van een constante kLa. Dezelfde groep verstrekt ook de eerste gegevens over een bevredigende opschaling van een zoogdiercelkweekproces met gebruikmaking van een constante gemiddelde energiedissipatiesnelheid.

Automatisering van MBR’s

De automatisering van MBR’s is de sleutel tot de uitbreiding van de HT-capaciteit. Verscheidene van de miniatuursystemen die onlangs zijn ontwikkeld, maken gebruik van een aangepaste MTP als uitgangspunt (b.v. en de Applikon MicroReactor®). Deze systemen lijken momenteel veelbelovend omdat zij gemakkelijk kunnen worden geïntegreerd in bestaande platforms voor robotautomatisering. MTP’s waarop dergelijke systemen zijn ontworpen, zijn gebaseerd op een standaard voetafdruk, zijn mechanisch eenvoudig en juist de standaardisatie van hun ontwerp maakt hen ideaal om te worden ingebouwd in geautomatiseerde robotplatforms die dergelijke technologieën echt naar het HT-domein brengen, waardoor zij de mogelijkheid krijgen om honderden celcultivaties parallel uit te voeren, met een voetafdruk die niet veel groter is dan die van een conventionele bioreactor op proefschaal. Het alternatief is de ontwikkeling van een miniatuurbioreactorsysteem dat zelf kan worden geautomatiseerd. De technologieën die de groep van Weuster-Botz in samenwerking met H + P Labortechnik en Bioprocessors Corp. heeft ontwikkeld, zijn voorbeelden van deze aanpak. Dergelijke apparaten bieden een zekere mate van HT-mogelijkheden, alsmede geavanceerde ingebouwde robotica in het geval van Bioprocessors Corp’s SimCell ®-systeem.

Robotica gebruikt in combinatie met MBR’s meestal voorzien van meerdere-pipeteerkoppen gemonteerd op armen die in staat zijn om te bewegen in drie dimensies over het gehele werkgebied. De pipetteerkoppen kunnen ook omgaan met verschillende MBR-geometrieën en afzonderlijke robotarmen kunnen hulpapparatuur overal in de werkruimte oppakken en plaatsen. Deze pick-and-place-mogelijkheid betekent dat één robot kan enten, pH-controleren, bemonsteren en toevoegingen doen aan een MBR, wat een echt geïntegreerde oplossing biedt. Bovendien kunnen robots celcultuurplatforms koppelen aan analytische instrumenten (bv. HPLC-systemen) en complexe assays uitvoeren, zoals ELISA voor antilichaamproducten met gebruik van real-time monsters – assays die gebruik maken van het vermogen van de robot om in korte tijd duizenden vloeistofbewerkingen uit te voeren. Aseptische celcultivatie-omstandigheden kunnen worden gehandhaafd door de robot te huisvesten in een speciaal gebouwde bioveiligheidskast.