Nieuwe inzichten in de structuur en functie van apoptosomen

Eerst vroege structurele informatie was van cruciaal belang bij het onthullen van de domeinorganisatie van het apoptosoom. Het menselijke apoptosoom bevat zeven Apaf-1 moleculen symmetrisch gerangschikt in een wielvormige structuur om een centrale hub te vormen die bestaat uit NODs met zeven verlengde HD2 armen, elk eindigend in een V-vormige regio die wordt gevormd door de twee β-propellers . De α/β-voud van de NBD en HD1 binden ADP/dATP tussen hen in, terwijl de WD40 herhalingen de 7- en 8-bladige β-propellers vormen . In tegenstelling tot eerdere suggesties bleek dat laterale interacties tussen de α/β-voud van aangrenzende Apaf-1 moleculen worden gebruikt om de centrale hub te organiseren, terwijl N-terminale CARDs boven deze ring zitten, en ongeordend zijn in de afwezigheid van pc-9 (PDB 3J2T) . Recente bijna atomaire structuren hebben echter aangetoond dat Apaf-1 CARDs een schijf-achtige eigenschap vormen op het oppervlak van het actieve apoptosoom in de aanwezigheid van pc-9 CARDs, en deze rangschikking verschilt van die gevonden in CED-4 en Dark (Figs. 1 en 2) . De stabiliteit van de centrale hub wordt gehandhaafd door een complex netwerk van α-helicale interacties, waterstofbruggen en zoutbruggen tussen aangrenzende NBD en HD1 modules van naburige Apaf-1 moleculen . De WHD/HD1 contacten op aangrenzende protomeren lijken apoptosoom assemblage te ondersteunen met WHD domeinen die aangrenzende NBD en HD1 domeinen overbruggen. Net als in Dark wordt de ISM helix in Apaf-1 (α12) gekoppeld aan helix α13 door middel van uitgebreide hydrofobe interacties om een helix-lus-helix motief in elke subeenheid te vormen, die op hun beurt lateraal interageren met aangrenzende subeenheden om een spiraalvormig hek te vormen dat de centrale porie in de ring afbakent.

In gezonde cellen, Apaf-1 monomeren bestaan in een gesloten, inactieve conformatie met ADP ingebed in een spleet in de interface van de NBD-HD1 (PDB 1Z6T, 3SFZ) . Deze gesloten conformatie wijst op de noodzaak van uitgebreide conformatieveranderingen van het monomeer om apoptosoom-assemblage te vergemakkelijken. In tegenstelling tot apoptosoomvorming in C. elegans en Drosophila bindt cytochroom c, dat vrijkomt uit mitochondriën tijdens apoptose-signalering, aan monomere Apaf-1, wat conformatieveranderingen teweegbrengt die leiden tot nucleotide-uitwisseling (ATP of dATP kan ADP vervangen), en daaropvolgende oligomerisatie van een verlengde Apaf-1 om het apoptosoom te vormen (Fig. 3). Om de optredende conformatieveranderingen te begrijpen zijn nauwkeurige modellen nodig van de inactieve en verlengde toestand van Apaf-1. Twee kristalstructuren van inactieve Apaf-1 monomeren met gebonden ADP zijn bepaald, waarbij in de ene de β-propellers ontbreken en in de tweede de N-terminale CARD domeinen ontbreken om de kristallisatie te vergemakkelijken. De NOD in deze twee kristalvormen is echter vrijwel identiek en dit heeft het mogelijk gemaakt een consensusmodel te construeren voor het gehele Apaf-1 monomeer met gebonden ADP. Bijna atomaire structuren van het menselijke apoptosoom zijn nu bereikt door verschillende groepen met behulp van single particle cryo-EM, om inzicht te geven in de verlengde conformatie van Apaf-1 in de afwezigheid en aanwezigheid van pc-9 (PDB 3JBT, 5JUY, 5WVE; Fig. 3) . Zoals voorspeld, is de conformatie van Apaf-1 in de centrale hub, HD2 armen en regulerende regio in wezen identiek in zowel inactieve als actieve apoptosomen. Deze studies hebben belangrijke details opgeleverd van specifieke residuen die betrokken zijn bij interdomein van der Waals contacten binnen afzonderlijke Apaf-1 moleculen, onthulden residuen die van cruciaal belang zijn voor domeininteracties die het actieve apoptosoom stabiliseren, en toonden interacties binnen het V-vormige sensordomein van de tandem 7- en 8-bladige β-propellers, die het cytochroom c bindende oppervlak vormen

In het Apaf-1 apoptosoom bevindt de dATP-bindingsplaats zich op het raakvlak NBD-HD1, en wordt gedeeltelijk gevormd door de Walker A-lus en de lus tussen HD1 en WHD. Hoewel Apaf-1 ADP kan binden in de inactieve toestand, is er een kleine voorkeur om dATP te gebruiken voor apoptosoom-assemblage in vitro (besproken in ref. ), terwijl ATP veel overvloediger aanwezig is in vivo (~ 2 mM voor ATP vs. 10 μM voor dATP). . Enige stabilisatie treedt op door interacties tussen een arginine residu (Arg265) in het NBD, samen met Ser325 en Tyr359 in het HD1 en het gebonden ATP/dATP molecuul. Een rotatie van het NBD-HD1 paar rond α-helix 20 in de WHD, positioneert de HD1-WHD lus aan de onderkant van de nucleotide pocket , waardoor het NBD-HD1 paar circumferentiële interacties kan vormen binnen de centrale hub tijdens assemblage. Dit verbreekt ook interacties met de WHD die normaal een gesloten configuratie stabiliseren .

Sensor β-propellers en cytochroom c binding

De “spaken” van het apoptosoom wiel steken door de HD2 domeinen naar buiten uit de hub en elke arm vormt de basis van de V-vormige regio die de twee β-propeller sensor domeinen bevat. In de langste Apaf-1 isovorm, (Apaf-1XL) die in de meeste weefsels tot expressie komt, vormen de vijftien WD40 herhalingen tandem 7 en 8-bladige β-propellers en een recente cryo-EM studie wees uit dat dit een nieuw sluitingsmechanisme heeft. Deze topologie van de β-propellers is vergelijkbaar met die van actine-interagerende proteïne (Aip1p), waarbij de linker van HD2 de d-streng vormt van het laatste blad in de 8-bladige β-propeller (aangegeven door het kleine blauwe gebied aan het begin van de 7-bladige propeller in Fig. 1a), alvorens over te steken om de 7-bladige β-propeller te vormen. Deze topologie werd geverifieerd door een kristalstructuur van murine Apaf-1 bij 3,0 Å resolutie en blijkt te worden geconserveerd in de donkere β-propellers.

In het Apaf-1 apoptosoom vormen de V-vormige β-propellers de cytochroom c bindingszak, en de interactie met cytochroom c lijkt te worden gestabiliseerd door waterstofbruggen en zoutbruggen. Zowel gereduceerde als geoxideerde vormen van cytochroom c kunnen met het apoptosoom interageren om de activering ervan te bewerkstelligen. Interessant is dat cytochroom c bij voorkeur lijkt te interageren met de 8-bladige β-propeller, terwijl een meer beperkt contactoppervlak wordt gevormd met de 7-bladige β-propeller . Cytochroom c is opgelost op ~ 6 Å resolutie in de nieuwe kaarten, als gevolg van lokale beweging en het molecuul is ~ 90 ° gedraaid, ten opzichte van een eerder model op basis van moleculaire docking in een kaart waar heli’s niet werden opgelost . Gerichte mutagenese onthulde kritische residuen in cytochroom c die nodig zijn voor een stabiele associatie met Apaf-1 β-propellers, en sommige van deze residuen (G56, P76, I81) zijn belangrijk voor apoptosoomvorming en daaropvolgende caspase-activering.

Gekorte Apaf-1 moleculen zonder WD-40 herhaalde regio’s kunnen ook samenkomen om apoptosomen te vormen die constitutief actief zijn, maar na verloop van tijd weer uit elkaar vallen. Dit heeft gesuggereerd dat β-propellers enigszins remmend kunnen zijn voor de assemblage, terwijl ze ook het Apaf-1 apoptosoom stabiliseren. Echter, β-propellers in het Apaf-1 apoptosoom bevinden zich op een hoge radius en hebben geen interactie met aangrenzende subeenheden, noch met andere domeinen in het monomeer, met uitzondering van HD2. Vandaar dat het destabilisatiemechanisme mysterieus blijft. Hoewel speculatief, zou het ontbreken van β-propellers in afgeknotte apoptosomen de HD2-interacties met de centrale hub kunnen verzwakken, wat leidt tot een tijdsafhankelijke disassemblage.

Het is nu duidelijk dat binding van cytochroom c een opwaartse rotatie van de β-propeller regio veroorzaakt, die de verbinding tussen de 7-bladige β-propeller en het NBD-HD1 paar in het inactieve Apaf-1 monomeer verbreekt, terwijl de 7-bladige β-propeller naar de 8-bladige β-propeller toe roteert in een klembeweging. Deze gebeurtenissen destabiliseren de auto-geïnhibeerde Apaf-1-conformatie en vergemakkelijken de uitwisseling van nucleotiden door conformatieveranderingen te bevorderen die de ADP-bindingszak blootleggen om ATP/dATP-binding mogelijk te maken. Dit stabiliseert het Apaf-1 monomeer in een verlengde conformatie, zodat het kan interageren met naburige protomeren. Bandverschuivingsexperimenten suggereren dat nucleotide-uitwisseling en bijbehorende conformatieveranderingen in Apaf-1 kunnen optreden als reactie op binding aan cytochroom c, omdat er geen significante veranderingen in conformatie van Apaf-1 werden waargenomen met toegevoegd dATP in afwezigheid van cytochroom c . Alles bij elkaar ondersteunen deze gegevens een sequentieel model waarin binding van cytochroom c plaatsvindt vóór uitwisseling van nucleotiden, om de overgang van een gesloten naar een verlengde conformatie van Apaf-1 te vergemakkelijken. Bovendien geven deze bevindingen aan dat WD40 herhalingen fungeren als sensoren die initiële apoptosoom-assemblage in gang zetten door cytochroom c te binden.

Mogelijke mechanismen van procaspase-9 activering

Procaspase-9 wordt gerekruteerd door het apoptosoom om een holoenzym te vormen dat zijn katalytische activiteit verhoogt . In oplossing is pc-9 een constitutieve monomeer wanneer niet gebonden aan Apaf-1, terwijl actieve caspases in het algemeen dimers zijn. Opmerkelijk is dat een dimere interactie tussen twee pc-9 monomeren in een kristalrooster de vorming van een actieve site op één katalytische subeenheid bevordert, terwijl de tweede subeenheid in een inactieve configuratie blijft (PDB 1JXQ) en een soortgelijk fenomeen treedt op in CED-3 dimers bij hoge concentratie . De N-terminale CARD in pc-9 interageert met Apaf-1 CARD(s) om het apicale procaspase naar het apoptosoom te recruteren en dit bevordert de activatie van het katalytische domein, dat van de CARD gescheiden is door een lange linker (Fig. 2a) . Bovendien zijn de p20 en p10 subeenheden van het katalytisch domein ook verbonden door een linker die onderhevig is aan zelf-cleavage. Om te begrijpen hoe pc-9 wordt geactiveerd moeten we dus de rol van CARDs en pc-9 linkers in het holo-apoptosoom begrijpen.

Er zijn verschillende modellen voorgesteld die de mechanismen van pc-9 activering door het apoptosoom verklaren. Het “proximity-induced dimerization model” voorspelt dat rekrutering van pc-9 moleculen aan het Apaf-1 apoptosoom homodimerisatie kan vergemakkelijken, waarvan gedacht wordt dat het leidt tot pc-9 auto-activatie. Echter, tot voor kort was er geen structureel of biochemisch bewijs dat pc-9 homodimerisch is wanneer het gebonden is aan het apoptosoom (zie onder). Het “geïnduceerde conformatie model” stelde voor dat het Apaf-1 apoptosoom een platform is dat pc-9 bindt om zijn actieve conformatie te vergemakkelijken. Recente modellen suggereren dat de activering van pc-9 voornamelijk gemedieerd wordt via allosterische regulatie door het apoptosoom platform. In al deze modellen is een primaire functie van het apoptosoom het samenstellen van een multimeer complex tussen Apaf-1 en pc-9 CARDs om pc-9 activatie te vergemakkelijken door het verhogen van de lokale concentratie van het zymogeen. Bovendien suggereren gegevens over een gemanipuleerde pc-9 die een constitutief dimeer is in oplossing dat de CARD en zijn linker de katalytische domeinen kunnen inhiberen. Daarom kan de vorming van een CARD heterodimer op het apoptosoom deze remming opheffen, maar dit idee moet nog worden getest.

Hoewel dimerisatie een sleutelrol kan spelen in activering, hoe dit gebeurt op het apoptosoom is onverklaard gebleven, en in feite hebben recente gegevens de mogelijkheid gesuggereerd van een meer gecompliceerd activeringsmechanisme dat zowel homodimerisatie van pc-9 moleculen inhoudt als heterodimer vorming van een enkel pc-9 katalytisch domein met de NBD van Apaf-1 . Intrigerend is dat een inactieve conformatie van het Apaf-1 monomeer pc-9 binding via CARD-CARD interacties niet uitsluit, zoals blijkt uit bandverschuivingsexperimenten. Dus, pc-9/Apaf-1 heterodimeren kunnen gerekruteerd worden aan het assemblerende apoptosoom als onderdeel van zijn activering (Fig. 3). Het blijft een open vraag of de assemblage van Apaf-1 in aanwezigheid van pc-9 geleid wordt door additionele interacties tussen CARDs in de nascente schijf.

Een eerste kristalstructuur onthulde een stabiel 1:1 complex tussen de CARD domeinen van Apaf-1 en pc-9 met een complementaire interface (bekend als Type I), die onmisbaar is voor pc-9 activering . Later werd echter aangetoond dat dit stabiele 1:1 complex onvoldoende is om pc-9 te activeren. In plaats daarvan vormen Apaf-1 en pc-9 CARDs oligomere complexen van een hogere orde, voornamelijk gestabiliseerd door twee van de drie mogelijke interfaces (bekend als TypeI, II en III), die ook gevonden worden in andere Death Domain complexen. Vergelijking van de interacties betrokken bij de CARD-CARD schijf in de CED-4, Dark en Apaf-1 apoptosomen, benadrukt enige instandhouding van Type II en III interfaces, met Type I CARD interacties alleen gevonden in het humane apoptosoom . Een recente kristalstructuur met een resolutie van 2.1 Å onthulde een heterotrimeer complex dat bestaat uit twee Apaf-1 CARDs met een pc-9 CARD ertussen ingeklemd. Type II interacties waarbij residuen in pc-9 (Arg36/ Arg65) en Apaf-1 (Glu78) CARDs betrokken zijn, bleken kritisch te zijn voor pc-9 activering, samen met type I interacties die eerder beschreven zijn. Bovendien kan een enkel residu (Glu41 in de Apaf-1 CARD) een bifurcated interactie vormen met een pc-9 CARD in een minimale Type III interface . Bijkomende interacties met Lys58 en Lys62 op de Apaf-1 CARD bleken ook vereist te zijn voor pc-9 activering en kunnen helpen bij de positionering van Apaf-1 CARDs op het platform . Aldus biedt de vorming van een heterotrimeer CARD complex een middel om meerdere pc-9 katalytische domeinen aan het apoptosoom platform te binden.

Twee bijna atomaire resolutie structuren van het actieve Apaf-1 apoptosoom hebben de algehele architectuur van de Apaf-1 en pc-9 CARD schijf opstelling onthuld die een gekantelde schijf creëert die in een boven de centrale hub zit (Figs. 2 en 3) . De symmetrie mismatch tussen de schijf en het platform resulteert in een acentrische positionering van de CARD schijf van bovenaf gezien (Fig. 3) . De schijf kan worden beschreven als een spiraal van Apaf-1 en pc-9 CARD paren met vier Apaf-1 CARDs die een onderste “laag” vormen terwijl drie of vier pc-9 CARDs aanwezig zijn op het bovenste oppervlak (Fig. 2b-d). Bovendien bewegen de Apaf-1 CARDs zich verder van het oppervlak van de centrale hub, als ze spiraalsgewijs omhoog gaan op een linkshandige manier en hebben dus verschillende linker conformatie en verschillende interacties met hun cognate NBDs in de centrale hub. De Apaf-1 en pc-9 CARD paren interageren via Type II interfaces, en verbinden zich lateraal rond de spiraal voornamelijk via Type I interacties. Opmerkelijk is dat slechts vier van de zeven Apaf-1 CARDs een interactie hebben met pc-9 CARDs in de schijf. Dit komt omdat de resterende drie Apaf-1 CARD moleculen niet gemakkelijk in het subunit bindingspatroon van de spiraal passen en de spiraal niet kunnen voortzetten omdat hun CARD-NBD linkers te kort zijn. Apaf-1 CARDs van aangrenzende subeenheden in het apoptosoom bevinden zich op een naad (tussen posities 1a en 7a), waar de spiraal stopt met zich verticaal uit te strekken (Fig. 2c, d) . Vorming van de Apaf-1/pc-9 CARD schijf is vereist voor activering van het apoptosoom en pc-9 katalytische domeinen zijn flexibel gebonden aan de CARDs door middel van een linker (Fig. 2a) . In één structuur werd een schijf met vier Apaf-1 CARDs en drie pc-9 CARDs gevisualiseerd, met een zwakke dichtheid die aangeeft dat een vierde pc-9 CARD zich zou kunnen binden aan de top van de spiraalvormige spiraal met een lagere bezetting. In een tweede structuur, de overheersende configuratie van de schijf bevatte 8 CARDs met de conformatie van de CARDs in de spiraal die zeer vergelijkbaar tussen de twee onafhankelijk van elkaar opgeloste structuren (zie overlay, Fig. 2d). Variaties in pH en zoutconcentratie kunnen de verklaring zijn voor de verschillende bezetting op de achtste positie. De assemblage van apoptosomen bevordert dus de rekrutering en lokale concentratie van pc-9 CARDs, wat de vorming van een nieuw spiraalvormig oligomeer met 7 of 8 CARDs mogelijk maakt.

Een recente analyse (met MALS en SAXS) toonde aan dat de vorming van CARD complexen concentratie-afhankelijk is en dat gelijke hoeveelheden Apaf-1 en pc-9 CARDs als paren associëren door het sterkere Type I grensvlak, met een overheersend 3:3 complex gevormd bij hoge concentratie in oplossing. Dit CARD complex werd gekristalliseerd en de structuur werd bepaald op 3.0 Å resolutie om een linkshandige spiraal van drie Apaf-1/pc-9 CARD paren te onthullen met een conformatie vergelijkbaar met wat wordt waargenomen in het apoptosoom, maar met enkele verschillen (PDB 5WVC; Fig. 2e) . De omgeving in het kristal is echter heel anders dan die in het assemblerende apoptosoom, deels als gevolg van roostercontacten en het ontbreken van een nucleerend oppervlak met beperkingen opgelegd door CARD-NBD linkers. Dit kan de waargenomen verschillen tussen de spiraalvormige CARD-structuren verklaren. Dit omvat de toevoeging van een of twee extra CARDs aan de schijfachtige spiraal in het holo-apoptosoom en het hebben van vier Apaf-1 CARDs die de basis van de schijf vormen, in plaats van drie zoals gevonden in oplossing en in het kristal. Na optimale uitlijning van de 8 CARD-schijf met de 6 CARD-spiraal uit de kristalstructuur is er een goede congruentie tussen de CARDs op de posities 2p, 3a, en 4p, met enige divergentie in de laatste helft van de 6 CARD-spiraal (Fig. 2f, g). In het bijzonder is de Apaf-1 CARD op positie 7a verticaal misplaatst op een tussenliggende positie, in afwezigheid van de Apaf-1 CARD op positie 1a (Fig. 2g). Interacties tussen het platform en de CARD-schijf zijn dus cruciaal voor de nucleatie van de grotere 7 en 8 CARD-spiralen die op het apoptosoom worden aangetroffen.

Tijdens de assemblage van de schijf kan de nucleatie van de spiraal op verschillende manieren plaatsvinden, waaronder de vorming van een CARD heterotrimeer dat bestaat uit twee Apaf-1 CARDs en één pc-9 CARD, met een Apaf-1 CARD aan de basis van de spiraal (op positie 1a). Vervolgens kunnen twee Apaf-1/pc-9 CARD-paren worden toegevoegd die via hun type I-interfaces op elkaar inwerken, waarbij in sommige gevallen de spiraal uiteindelijk wordt afgesloten met een pc-9 CARD op positie 8p. Gezien de flexibele aard van de Apaf-1 CARD-NBD-linker zijn echter ook andere combinaties mogelijk, zodat drie Apaf-1/pc-9 CARD “Type I”-paren achtereenvolgens vanuit de centrale hub kunnen worden gecentreerd, met toevoeging van een Apaf-1 CARD aan de basis van de spiraal (op positie 1a), tijdens de vroege stadia van assemblage. Belangrijk is dat de assemblage van de schijf coöperatief kan zijn om de juiste afstand van de vier Apaf-1 CARDs op het apoptosoom te handhaven, die de basis van de spiraal vormen.

Voor het actieve apoptosoom is één belangrijk verschil duidelijk op de centrale hub, bij vergelijking van de gepubliceerde structuren (Fig. 3 en 4) . In het kort, dichtheid geïdentificeerd als een katalytisch domein van pc-9 (p20/p10) is gelegen op de centrale hub in een recente 3D-kaart, en dit kenmerk bleek aanwezig te zijn in ongeveer 50% van de complexen . Bovendien werd een soortgelijke dichtheid gevisualiseerd in een eerdere lagere resolutiekaart van het holo-apoptosoom, die een redelijke, zij het voorlopige, koppeling van de p20/p10 subeenheden mogelijk maakte ; het waargenomen kenmerk is dus reproduceerbaar. Deze nieuwe dichtheid is echter alleen gevisualiseerd bij lage resolutie, wat kan duiden op enige flexibiliteit in de hechting van de p20/p10 subeenheden aan de centrale hub. In een bijna atomaire resolutie kaart bepaald door Yigong Shi’s groep, werd een extra sikkelvormige dichtheid opgelost op ~ 7 Å resolutie op de centrale hub, grenzend aan de CARD schijf. Deze dichtheid bevat duidelijk een extra pc-9 CARD in het centrum, die interageert met twee Apaf-1 CARDs aan weerszijden, op een manier die vergelijkbaar is met die waargenomen in twee kristalstructuren. Echter, deze heterotrimerische configuratie kon slechts worden opgelost in ~ 10% van de deeltjes . Het lijkt er dus op dat experimentele condities tijdens monstervoorbereiding en invriezen van het rooster invloed kunnen hebben op hoe pc-9 interageert met potentiële bindingsplaatsen op de centrale hub, inclusief de vorming van een schijf-achtige spiraal met variabele aantallen pc-9 CARDs en in het gebruik van bindingsplaatsen die zich naast de acentrische schijf bevinden. Wanneer de twee recente asymmetrische structuren van het holo-apoptosoom worden uitgelijnd op basis van hun CARD schijven, liggen de nieuwe dichtheidspieken op de centrale hub op zeer verschillende plaatsen (Fig. 4). Terwijl het pc-9 katalytische domein (p20/p10) zich op twee posities kan bevinden (met de meest waarschijnlijke getoond in Fig. 4c), is de drie CARD dichtheid gedraaid en heeft een ander profiel van opzij gezien (niet getoond), in vergelijking met die voor pc-9 katalytisch domein (Fig. 4b, d). Het patroon van Apaf-1 CARD-NBD linker dichtheden maakt een nauwkeurige mapping van alle relevante CARD-NBD linkers in de drie CARD holo-apoptosoom met zes geordende Apaf-1 CARDs (Fig. 4d) . Van cruciaal belang is dat de linkerlengte (~ 25-30 Å) en de relatieve posities van de linkers de binding van een drie CARD module aan positie 1 of 2 op de centrale hub kunnen uitsluiten. Het lijkt er dus op dat er meerdere plaatsen op de centrale hub zijn die op verschillende manieren kunnen worden gebruikt om een pc-9 CARD of een katalytisch domein te binden.

Procaspase-9 bindt zich naar schatting aan het apoptosoom met verhoudingen tussen 2-5 zymogens per 7 Apaf-1 moleculen, dus het lijkt erop dat het exacte aantal pc-9 moleculen dat zich aan het apoptosoom bindt kan variëren afhankelijk van de omstandigheden tijdens de assemblage, wat de dynamische aard van deze proteolytische machine kan weerspiegelen. Bij uitbreiding lijkt het duidelijk dat een zesde of een zevende pc-9 CARD niet gebonden is door hun Apaf-1 tegenhangers, ten opzichte van de reeds gedocumenteerde plaatsen op het apoptosoom, wat kan wijzen op een sterische beperking of de noodzaak voor een groter oligomeer om de gebonden pc-9 CARDs te stabiliseren. Belangrijk is dat sommige pc-9 katalytische domeinen niet te zien zijn in de huidige cryo-EM dichtheidskaarten, vanwege hun flexibele binding door lange CARD-p20 linkers, wat het moeilijk maakt om de precieze mechanismen van activering te ontcijferen en te begrijpen, terwijl het de noodzaak benadrukt voor verdere single molecule studies.

De primaire functie van het apoptosoom is het activeren van pc-9 zodat het apoptose kan uitvoeren. Terwijl structurele studies inzicht hebben verschaft in de rekrutering en vereisten voor pc-9 activering, heeft een reeks biochemische testen nu aangetoond dat zowel proximity-geïnduceerde dimerisatie als allosterische regulatie van monomere pc-9 kritisch zijn om apoptosoom functie te reguleren en ook de duur van apoptosoom activiteit kunnen bepalen. Ten eerste verhoogt de rekrutering van pc-9 door het apoptosoom zijn lokale concentratie om homodimerisatie mogelijk te maken, wat zijn affiniteit voor het complex verhoogt. Interessant is dat een niet-afbreekbare pc-9 een hogere neiging heeft tot homodimerisatie en een verhoogde protease activiteit vertoont (caspase-3 splitsing) binnen het apoptosoom, dan gekloofde caspase-9. Als gevolg hiervan vermindert de splitsing van de inter-subeenheid p20/p10 link van het katalytische domein de affiniteit van pc-9 voor het apoptosoom en eenmaal verwerkt, komt caspase-9 vrij en bindt niet opnieuw aan het apoptosoom. Belangrijk is dat deze studies hebben aangetoond dat pc-9 homodimerisatie de belangrijkste gebeurtenis is die nodig is voor activering en dat het apoptosoom deze gebeurtenis vergemakkelijkt. Dit is consistent met biochemische studies van andere CARD caspases, zoals caspase-2 en Dronc, waar initiële activatie eerder dimerisatie vereist dan splitsing van het zymogeen. Stabilisatie van pc-9 binding aan het apoptosoom vereist niet alleen CARD-CARD interacties, maar ook interacties van de pc-9 kleine subeenheid (p10) via zijn GCFNF404 motief om homo- en heterodimeren te vormen. Wat op dit moment niet duidelijk is, is hoe pc-9 homodimeervorming de stabiliteit van de CARD-CARD schijf beïnvloedt, aangezien katalytische domeindimeren vrij flexibel lijken te zijn, aangezien ze kunnen worden losgemaakt van het holo-apoptosoom door site-directed trombinolyse en niet worden opgelost in cryo-EM kaarten die zonder symmetrie zijn geraffineerd . Het GCFNF motief in pc-9 interageert ook met een Apaf-1 NOD om pc-9/Apaf-1 heterodimeren te vormen die efficiënt caspase-3 klieven. Deze gegevens suggereren dat een katalytisch domein van pc-9, dat rechtstreeks interageert met het apoptosoom, actief zou kunnen zijn. Deze vermeende actieve plaats voor caspase-3 splitsing kan overeenkomen met de nieuwe dichtheid waargenomen op de centrale hub die is geïnterpreteerd als een p20/p10 molecuul en verdere studies zijn nodig op dit punt. Samen geven deze bevindingen aan dat pc-9 twee verschillende actieve conformaties kan hebben binnen het apoptosoom, met één of mogelijk twee homodimeren gebonden aan de CARD schijf en een pc-9/Apaf-1 heterodimer gebonden aan de centrale hub. Wanneer holo-apoptosomen met een drie CARD module gebonden aan de centrale hub worden meegerekend, dan zijn er tenminste zes permutaties mogelijk voor de dispositie van drie tot vijf pc-9 katalytische domeinen (Fig. 5). Dus, het aantal mogelijke actieve pc-9 katalytische domeinen (als homodimeren en heterodimeren) zal variëren afhankelijk van het aantal pc-9 moleculen dat gerekruteerd wordt in het apoptosoom, omdat zij mogelijke bindingsplaatsen invullen die gemedieerd worden door Apaf-1 CARDs.

Ten slotte verwijdert volledige splitsing van pc-9 door caspase-3 de inter-subeenheid linker en herstelt volledige caspase-9 activiteit, wat erop wijst dat caspase-3 ook een proteolytische terugkoppeling heeft op pc-9 die het apoptotische signaal kan versterken . Een gelijkaardig mechanisme werd voorgesteld voor caspase-2 . Deze biochemische studies hebben verder een moleculair timermodel voorgesteld waar de snelheid van caspase-9 dissociatie van het apoptosoom bepaald wordt door een initiële splitsing van de p20-p10 linker die zijn apoptosoom bindingsaffiniteit vermindert. Echter, volledige dissociatie van gespleten caspase-9 van het holo-apoptosoom zou loslating van zijn CARD van de schijf of drie CARD module vereisen. Er kan dus een hiërarchie bestaan voor het vrijkomen van actieve caspase-9 moleculen die afhangt van de lokale omgeving van hun CARDs. Het ontwerp van de CARD-schijf, waarbij alle pc-9 CARDs zich op het bovenoppervlak bevinden, kan ook het vrijkomen van caspase-9 vergemakkelijken.