PLOS ONE

Discussie

De meeste chemotherapeutische geneesmiddelen zijn specifiek ontworpen om te interfereren met DNA-synthese, cellulair metabolisme, en celdeling. Door dit werkingsmechanisme is het te verwachten dat deze geneesmiddelen verschillende soorten mutaties zullen veroorzaken. Mutageniciteit van chemotherapeutica voor normale cellen is een van de ernstigste problemen bij chemotherapie, omdat dit kan leiden tot secundaire maligniteiten en abnormale voortplantingsresultaten zoals het syndroom van Down, Klinefelter en Turner. Daarom is het absoluut noodzakelijk het mutagene effect van chemotherapeutische geneesmiddelen op normale cellen te bepalen. De micronucleustest is algemeen gebruikt om ongerepareerde genoombeschadiging te meten, en een verhoogde MN-frequentie voorspelt het risico op kanker bij de mens. Aangezien MN het gevolg kunnen zijn van chromosoombreuk (clastogeniciteit) of achterblijvende chromosomen (aneugeniciteit), heeft de detectie van MN het potentieel om te worden gebruikt als een screening voor numerieke chromosoomafwijking inductie als assays die de identificatie van volledige chromosomen binnenin MN mogelijk maken, zoals de FISH assay, worden opgenomen.

De clastogene activiteit van epirubicine tijdens mitose in vivo werd gerapporteerd door de beenmerg MN-test . Op dit moment is de oorsprong van de door epirubicine veroorzaakte MN nog niet vastgesteld. Daarom werd de huidige studie opgezet om het vermogen van epirubicine om aneuploïdie in somatische en kiemcellen van mannelijke muizen te induceren, te onderzoeken. Om de efficiëntie van de methode te bepalen werden twee modelmutagenen, colchicine en mitomycine C, waarvan bekend is dat zij respectievelijk aneugene en clastogene effecten hebben, als positieve controles gebruikt. De waargenomen resultaten van de MNPCE en de verdeling van de signalen per MN in de controle en de twee positieve mutagentia in de huidige studie komen goed overeen met de gepubliceerde gegevens , . Deze gegevens bevestigen de gevoeligheid van het gevolgde experimentele protocol voor de detectie van genotoxische effecten.

De resultaten van de MN-test hebben aangetoond dat epirubicine in vivo in het beenmerg van muizen een dosisafhankelijke toename van de vorming van MN veroorzaakt (fig. 1) en een toename van centromeernegatief en centromeerpositief gekleurde MN, wat duidt op de inductie van zowel clastogene als aneugene effecten (fig. 2). Zowel het clastogene als het aneugene potentieel van epirubicine in somatische cellen kan aanleiding geven tot de ontwikkeling van secundaire tumoren. De resultaten van de clastogeniciteit bevestigen de bevindingen van eerdere in vivo studies, waar na behandeling met epirubicine over een vergelijkbaar doseringsbereik een toename van MN-vorming en structurele chromosoomafwijkingen in somatische cellen van muizen werden waargenomen. De resultaten van deze studies komen ook overeen met de eerder gerapporteerde micronucleus-inductie door epirubicine in kankercellen van muizen in vitro , in de erytrocyten van geïncubeerde kippeneieren , en in de menselijke lymfoblastoïde TK6-cellijn . Bovendien werd de inductie van structurele en numerieke chromosoomafwijkingen eerder ook gemeld bij kankerpatiënten die epirubicine-bevattende chemotherapie kregen. Eerdere studies hebben ook aangetoond dat epirubicine structurele chromosoomafwijkingen in gekweekte HeLa-cellen induceert , zowel structurele als numerieke chromosoomafwijkingen en verwisselingen van geslachtschromatiden in een Chinese hamster cellijn , en chromosoomafwijkingen in perifere bloed lymfocytenkweken van vrouwen met borstkanker die in vitro werden behandeld met een epirubicine-bevattend schema .

Studies bij mensen hebben aangetoond dat bepaalde chemotherapieregimes de frequentie van aneuploïdie in kiemcellen verhogen , wat suggereert dat dergelijke patiënten een hoger risico kunnen lopen op abnormale reproductieve resultaten, met name in de reproductieve leeftijd. Daarom is het van algemeen belang om het risico van aneuploïdie productie te verminderen, kiemcel aneugens op te sporen en de oorzakelijke mechanismen te begrijpen. In de huidige studie werd aneuploïdie bepaald in kiemcellen door de sperma-FISH assay met DNA probes specifiek voor muis chromosomen 8, X en Y, elk gelabeld met een andere kleur. Om de betrouwbaarheid van de methoden te bepalen, werd colchicine, waarvan bekend is dat het overwegend aneugenetisch is, gebruikt als positieve controlestof, en de resultaten van de positieve en negatieve controle lagen in hetzelfde bereik als die van eerdere studies , -. Deze gegevens bevestigden de gevoeligheid van het experimentele protocol bij de detectie van aneuploïdogene effecten van de geteste verbindingen.

Epirubicine is het meest actief in de S- en G2-fasen van de celcyclus; het heeft echter enige detecteerbare activiteit in alle fasen van de celcyclus . Er is vaak gerapporteerd dat chemische stoffen met aneugene eigenschappen de voortgang van de celdeling in zowel meiotische als mitotische cellen kunnen veranderen. In de huidige studie werd de ontwikkelingsduur van meiotische delingen in spermatocyten tot epididymaal sperma beoordeeld met de BrdU-incorporatietest. Uit de resultaten blijkt duidelijk dat epirubicine de duur van de meiotische delingen in spermatocyten van muizen met 48 uur verlengt (Fig. 3). Deze waarnemingen bevestigen dus eerdere bevindingen dat door epirubicine geïnduceerde remming van de topoisomerase II-functie tijdens verschillende fasen van de celcyclus de voortgang van de celcyclus vertraagt en de cellen in de G2/M-fase doet stilstaan. Deze G2/M-arrestatie kan het gevolg zijn van de inductie van de G2-checkpoint-machinerie, waardoor beschadigd DNA kan worden gerepareerd voordat de cellen naar de volgende fase van de celcyclus gaan.

De in vivo informatie over de effecten van epirubicine op de niet-disjunctie tijdens de meiose is beperkt, maar bepaalde andere anthracyclines, zoals doxorubicine en het daarvan afgeleide idarubicine, verhinderen chromosomale segregatie en induceren een aanzienlijke toename van de frequentie van disomisch en diploïd sperma. Bovendien bleek uit een in vitro-onderzoek dat de behandeling van Chinese hamsterculturen met epirubicine numerieke afwijkingen in de vorm van hypodiploïdie en hyperdiploïdie induceerde. Bovendien bleek uit flowcytometrische en histologische analyse van de spermatogenese bij muizen dat de variatiecoëfficiënt in het DNA-histogram, als maat voor aneuploïdie, toeneemt en dat het aantal diploïde spermatiden na behandeling met epirubicine toeneemt. In overeenstemming met de bovengenoemde rapporten bleek uit het huidige experiment dat blootstelling aan epirubicine een aanzienlijke dosisafhankelijke toename van de frequentie van disomische en diploïde sperma veroorzaakt en dat de inductie van aneuploïdie lineair dosisafhankelijk was tussen 0 en 12 mg/kg epirubicine (fig. 4). Deze in vivo waarnemingen komen ook overeen met een eerder in vitro verslag over menselijke lymfocyten die waren gekweekt uit gezonde personen en kankerpatiënten, bij wie blootstelling aan doxorubicine een toename van de trisomieën van chromosomen 7 en 17 veroorzaakte. Verder meldden Ganapathi et al. dat menselijke leukemie HL-60 cellen die monosomie 8 als enige karyotypische verandering dragen 7q21 markers verwierven na blootstelling aan doxorubicine. Bovendien toonden cytogenetische bevindingen trisomie 8 aan bij patiënten die systemische chemotherapie met anthracycline kregen. Monosomie 7, 7q-, en onevenwichtige translocatie met inbegrip van chromosoom 7 werden waargenomen bij patiënten die anthracycline-bevattende chemotherapie kregen . Bovendien zijn structurele chromosoomafwijkingen van de chromosomen 1, 9 en 16 in verband gebracht met chemotherapeutica die anthracycline bevatten.

Een van de andere klassen van topoisomerase II-remmers, etoposide is eerder bestudeerd in spermatocyten van muizen. De resultaten van deze studies wijzen erop dat etoposide werkt als een genotoxisch middel en aneuploïdieën induceert in voornamelijk meiotische kiemcellen na behandeling van pachytene cellen. Anderzijds stelden Kallio en Lähdetie vast dat de gevoeligheid voor etoposide bij muizen het grootst was tijdens de diplotene-diakinese van primaire spermatocyten, verminderd tijdens de late pachytene en gering tijdens de preleptotene stadia; een heel ander patroon dan bij DNA-alkylerende chemicaliën. Deze auteurs suggereerden dat etoposide een falen van de resolutie van gerecombineerde chromosoomarmen veroorzaakte, wat waarschijnlijk gepaard gaat met celcyclusstilstand en het op gang brengen van de apoptotische route. In hun gedetailleerde cytogenetische studies meldden Marchetti et al. dat pachytene het gevoeligste stadium van de spermatogenese was voor de inductie van structurele chromosoomafwijkingen en aneuploïdie. Aangezien de gegevens van Schmid et al. en die van Kallio en Lähdetie konden aantonen dat etoposide de meiotische celcyclus verlengt, lijkt het mogelijk dat de effecten die Marchetti et al. in de 24,5 dagen durende paringsgroep bij de eerste splitsingsdelingen constateerden, in feite in een later stadium zijn geïnduceerd, nl. tijdens meiotische diakinesis, MMI of MMII in plaats van pachytene zoals de auteurs suggereerden.

In de huidige studie planden wij een sperma-FISH studie om te bepalen of subacute behandeling met lage doses van de topoisomerase II remmer epirubicine een effect zou hebben omdat vroegere profase stadia in de epirubicine behandeling zouden worden opgenomen. Afzonderlijke doses van 0,25, 0,5 en 1 mg/kg epirubicine werden op 12 opeenvolgende dagen geïnjecteerd, en 23 dagen na de laatste behandeling met epirubicine werden spermamonsters genomen. Een totale dosis van 12 mg/kg epirubicine, toegediend tijdens de gehele profase van de meiose, verhoogde de disomische en diploïde spermafrequenties aanzienlijk, terwijl een totale dosis van 3 en 6 mg/kg doxorubicine negatief was (Fig. 5). Daarentegen gaf een eenmalige dosis van 6 mg/kg epirubicine, toegediend aan spermatocyten tijdens MMI/MMII, een positief resultaat (fig. 4). Deze gegevens suggereren dat eerdere profase stadia relatief minder bijdragen aan door epirubicine veroorzaakte aneuploïdie in mannelijke kiemcellen.

In de huidige studie werd gevonden dat epirubicine een merkbare toename van autodiploïd sperma (XX88 en YY88) veroorzaakte. Na behandeling met epirubicine kwamen autodiploïd sperma als gevolg van arrestatie van MMII vaker voor dan diploïd sperma als gevolg van arrestatie tijdens MMI (XY88). De tweede meiotische deling was dus gevoeliger voor epirubicinebehandeling dan de eerste meiotische deling. De conclusie dat tweede meiotische delingen gevoeliger waren voor epirubicinebehandeling dan eerste meiotische delingen wordt ook ondersteund door de waargenomen frequenties van disomische geslachtschromosomen. Sperma met signalen van XX8 of YY8 kwamen vaker voor dan sperma met signalen van XY8. Deze waarnemingen bevestigen dat de sperma-FISH-test voor disomie of diploïdie in staat is effecten te detecteren die tijdens beide meiotische delingen worden geïnduceerd en de gevoeligheid van beide meiotische delingen te vergelijken, zoals eerder gerapporteerd , .

In de huidige sperma-FISH-test bleek dat de laagste positieve dosis om disomisch of diploïd sperma te veroorzaken 6 mg/kg epirubicine was. Uit beenmerg-MN-studies bij muizen bleek echter dat blootstelling aan 3 mg/kg epirubicine een significante toename van MNPCE opleverde. Deze waarneming suggereert dat MN in beenmerg worden geïnduceerd bij lagere doses dan disomieën of diploïdieën in sperma. Vandaar dat het beenmerg het gevoeligste weefsel is. De tests meten echter verschillende eindpunten. Chromosoomverlies en -breuk worden gemeten in de MN-test, terwijl niet-ontkoppeling wordt gedetecteerd in de sperma-FISH-test. Daarom bevestigen de huidige gegevens het algemene paradigma van de gevarenbeoordeling, dat stelt dat een positief resultaat van de beenmerg-MN-test een indicator is van het genotoxische potentieel van een verbinding in kiemcellen. De kwantificering van aneuploïdie in kiemcellen is echter belangrijk voor de risicobeoordeling.

DNA topoisomeraseremmers hebben een duidelijke neiging tot het veroorzaken van dubbelstrengs DNA-breuken, die voornamelijk resulteren in de vorming van centromeer-negatieve MN . Evenzo suggereert het bewijs dat epirubicine een effectieve topoisomerase II remmer is, dat epirubicine zijn clastogene effecten via dit mechanisme bewerkstelligt. Epirubicinemetabolieten kunnen cellen ook activeren om de intracellulaire productie van reactieve zuurstofspecies te verhogen, waarvan de stabiele en verspreidbare vormen kern-DNA kunnen beschadigen. Als de cellulaire herstelmechanismen overbelast zijn, kan primaire DNA-beschadiging leiden tot structurele of numerieke chromosoomafwijkingen en uiteindelijk tumoren veroorzaken. Deze suggestie wordt ondersteund door het feit dat personen die een tweede kwaadaardig neoplasma ontwikkelden na behandeling voor een eerste kwaadaardig neoplasma een lager vermogen hadden om DNA dubbelstrengsbreuken te herstellen dan degenen die geen tweede kwaadaardig neoplasma ontwikkelden, zoals gemeten door de γH2AX intensiteit . De inductie van centromeer-positieve MN door epirubicine geeft aan dat er een ander mechanisme kan zijn waardoor epirubicine zijn genotoxische effect induceert. Deze observatie onderstreept het belang van het gebruik van de FISH-modificatie van de MN-test om de oorsprong van de geïnduceerde MN te bepalen. Het mogelijke mechanisme waardoor epirubicine zijn aneugene werking kan uitoefenen is door remming van topoisomerase II, wat kan leiden tot een verkeerde verdeling van chromosomen tijdens de celdeling. Dit gebeurt omdat DNA-topoisomerase II nodig is voor de juiste scheiding van de zusterchromatiden tijdens de celdeling, waarbij bij afwezigheid van topoisomerase II zowel geen scheiding als breuk optreedt. Epirubicine kan dus twee belangrijke functies van topoisomerase II remmen; zijn vermogen om nieuw gerepliceerde chromosomen op de juiste wijze te scheiden en zijn functie bij het opnieuw leggen van voorbijgaande dubbelstrengs DNA-breuken.

Samenvattend werd met behulp van de FISH-test met een centromere DNA-sonde voor erytrocyten MN aangetoond dat epirubicine niet alleen clastogeen maar ook aneugenetisch is in somatische cellen in vivo. Met de BrdU-incorporatietest werd aangetoond dat de meiotische vertraging door epirubicine ongeveer 48 uur bedraagt. Met sperma-FISH-analyse werd aangetoond dat epirubicine tijdens de meiose aneuploïdieën induceert die resulteren in disomisch sperma, alsmede een volledige meiotische stilstand waardoor diploïd sperma ontstaat. Het voorkomen van autodiploïd (XX88, YY88) en disomisch (XX8 of YY8) sperma wijst erop dat de tweede meiotische deling gevoeliger is voor epirubicine dan de eerste meiotische deling. De resultaten suggereren ook dat eerdere profase-fasen relatief minder bijdragen aan door epirubicine veroorzaakte aneuploïdie. Zowel het clastogene als het aneugene potentieel van epirubicine kan aanleiding geven tot de ontwikkeling van secundaire tumoren en abnormale voortplantingsresultaten bij kankerpatiënten en medisch personeel dat wordt blootgesteld aan geneesmiddelenregimes die epirubicine bevatten. Hoewel epirubicine minder systemische en harttoxiciteit heeft dan doxorubicine en andere anthracyclines met een gelijkwaardig spectrum van antitumorwerking, heeft het wel aneuploïdogene en cytotoxische effecten in niet-tumorcellen. Dit aneuploïdogene effect van het geneesmiddel kan verantwoordelijk zijn voor het optreden van abnormale voortplantingsresultaten en secundaire tumoren, die bij sommige kankerpatiënten worden waargenomen enige tijd na de succesvolle behandeling van hun primaire kanker met epirubicine-bevattende chemotherapie.