Proximity-Labeling MS (APEX-MS)

Voor deze benadering wordt het eiwit van belang gefuseerd met een peroxidase (ascorbinezuurperoxidase; APEX). Na behandeling met H2O2 zet APEX exogeen toegevoerd biotine-fenol om in biotine-fenoxylradicalen, wat resulteert in een covalente labeling van eiwit in een straal van 20 nm. Vervolgens worden de gebiotinyleerde eiwitten verrijkt met behulp van Steptavidine. Deze technologie maakt het voor het eerst mogelijk “momentopnamen” te maken van lokale eiwitomgevingen op een bepaald tijdstip en voorbijgaande eiwitinteracties vast te leggen. Proximity-based labeling benaderingen zijn snel gevorderd in de afgelopen jaren en is aangetoond dat complementaire resultaten te bieden aan de traditionele affiniteit-gebaseerde zuivering methoden (AP-MS), dus met het potentieel om geheel nieuwe wegen van onderzoek te openen en nieuwe inzichten in eiwit functies te bieden.

APEX is gebruikt om hele organel proteomen vast te leggen met een hoge temporele resolutie, maar de breedte van de etikettering wordt over het algemeen gedacht dat de hogere ruimtelijke resolutie die nodig is om specifieke eiwit-netwerken te ondervragen uitsluiten. We hebben onlangs een oplossing voor dit probleem door het combineren van kwantitatieve proteomics met een systeem van ruimtelijke referenties. Deze nieuwe methode stelt ons in staat om bekende bindingspartners op te lossen, evenals eerder niet-geïdentificeerde netwerkcomponenten, zoals onlangs aangetoond in een proof of principle studie die eiwitten ondervraagd die betrokken zijn bij G-eiwit-gekoppelde receptoren als ze dynamisch signaleren en verkeer in reactie op ligand-geïnduceerde activatie.