Specifieke antilichamen hebben specifieke validatie nodig

Een van de meest gebruikte instrumenten in biomedisch onderzoek is het monoklonale antilichaam. Deze eiwitten hebben het potentieel om elk gewenst doelwit op te zoeken en zich eraan te binden, en kunnen worden gebruikt voor celbeeldvorming, celsortering, immunoassays en vele andere toepassingen.

Maar deze werkpaarden in het lab lopen niet altijd gesmeerd. Afhankelijk van de aard van het doelwit kan een antilichaam in bepaalde tests inconsistent zijn – het kan bijvoorbeeld aan het verkeerde doelwit binden en vals-positieve resultaten geven. Gezien de prevalentie van het gebruik van onderzoeksantilichamen, is dit potentieel een miljard dollar kostend probleem.

Een belangrijk doel is het ontwikkelen van strategieën voor antilichaamvalidatie, zodat onderzoekers erop kunnen vertrouwen dat een antilichaam geschikt is voor hun specifieke behoeften – en dat hun resultaten reproduceerbaar zullen zijn.

Thermo Fisher Scientific heeft een tweedelig antilichaamvalidatieplatform ontwikkeld om niet alleen de specificiteit van haar InvitrogenTM antilichamen te testen (dat ze aan het juiste doel binden), maar ook hun geschiktheid voor verschillende toepassingen. Dezelfde test is echter niet geschikt voor alle antilichamen: Thermo Fisher gebruikt voor elk eiwitdoelwit een geschikte test, afhankelijk van de biologische functie ervan. Bepaalde antilichamen kunnen het best worden getest met CRISPR-Cas9 om het gen dat codeert voor het doeleiwit uit te schakelen, en na te gaan of het antilichaam nergens meer aan bindt. Andere antilichamen kunnen worden getest met behulp van immunoprecipitatie gevolgd door massaspectrometrie om te controleren of ze aan de juiste doelwitten zijn gebonden.

Thermo Fisher ontwikkelt en verfijnt validatietests voor antilichamen op basis van de biologische functie van het doelantigeen. Hier volgen twee casestudies van specifieke eiwitten en hun specificiteitstesten.

Knock-outs voor kanker

De epidermale groeifactorreceptor (EGFR) is een goed bestudeerd eiwit: ontregeling in de EGFR-route is betrokken bij verschillende vormen van kanker. Om te testen of antilichamen specifiek zijn voor EGFR of voor een van zijn downstream targets, kunnen onderzoekers kritische eiwitten in de EGFR pathway uitschakelen en kijken hoe het antilichaam-bindende signaal verandert.

In de afgelopen jaren is het CRISPR-Cas9 systeem bekend geworden als de meest betrouwbare en krachtige manier om een gen uit te schakelen. Dit maakt het ideaal om de specificiteit van antilichamen binnen een signaalcascade te testen. De onderzoekers van Thermo Fisher namen een standaard humane carcinoma-lijn (A-431) en gebruikten een western blot om een basislijn te krijgen voor het bindingssignaal. Vervolgens gebruikten zij CRISPR-Cas9 om het doelgen te elimineren en EGFR-knockouts te creëren. Een western blot van eiwitextracten uit deze knock-out cellen toonde aan dat er geen signaal meer was voor een doeleiwit (figuur 1).

Verder onderzoek bevestigde het resultaat. De signaalcascade downstream van EGFR omvat eiwitten als RAS, RAF, MEK en ERK. Activering van EGFR door epidermale groeifactor (EGF) leidt tot fosforylering van deze downstream-eiwitten, die kan worden opgespoord met andere antilichamen die deze gefosforyleerde toestanden herkennen. Toevoeging van EGF aan de EGFR-knockoutcellen zou echter niet mogen resulteren in enige downstream-fosforylering. Toevoeging van dezelfde antilichamen die gefosforyleerde doelwitten herkennen, leverde geen signalen op. De onderzoekers van Thermo Fisher zijn er dus van overtuigd dat het anti-EGFR-antilichaam doelspecifiek is.

Een scala van modificaties

In de celkern is DNA strak verpakt – gewikkeld rond histon-eiwitten om chromatine te vormen. Het bestuderen van histonen is moeilijk, omdat ze kunnen worden beïnvloed door een aantal chemische veranderingen, die bekend staan als post-translationele modificaties (PTM’s). Zo kunnen residuen op een histon een of meer methyl-, acetyl- of fosforylgroepen krijgen, die elk een effect hebben op de cellulaire functie.

Zekere technieken, zoals chromatine-immunoprecipitatie (ChIP), western blotting, immunofluorescentie en immunohistochemie, gebruiken antilichamen tegen specifieke histon PTM’s om de toestand van het histon en zijn binding te begrijpen. Verschillende histonmodificaties hebben echter vergelijkbare DNA-bindingspatronen; een antilichaam dat niet streng is getest tegen alle histon-PTM’s kan aan het verkeerde type binden en een vals-positief resultaat opleveren.

Thermo Fisher heeft zijn histon-PTM-specifieke antilichamen getest met behulp van een reeks peptiden die een verscheidenheid aan PTM’s bevatten. Als een antilichaam echt specifiek is voor één PTM, zal het zich alleen binden aan de vlekken die dat PTM dragen. De onderzoekers van Thermo Fisher hebben de signalen gemeten aan de hand van een specificiteitsfactor: de gemiddelde intensiteit van alle spots die een bepaalde PTM bevatten gedeeld door de gemiddelde intensiteit van alle spots zonder die PTM (figuur 2). De antilichamen vertoonden een 4- tot 190-voudige hogere specificiteitsfactor voor hun doel-PTM-toestand dan voor niet-doel-toestanden, wat vertrouwen geeft dat ze zeer selectief zijn.

Thermo Fisher heeft zeven andere specificiteitstests dan genetische knock-out en peptide-arrays. Deze omvatten het gebruik van RNAi om genexpressie te onderdrukken, een differentieel opgewekt antilichaam om de doelgerichtheid onafhankelijk te verifiëren en natuurlijk voorkomende variabele expressie om de specificiteit te bevestigen. Alleen door dergelijke zorgvuldige en rigoureuze tests kunnen onderzoekers erop vertrouwen dat hun laboratoriumwerkpaarden geschikt zijn voor hun doel – en dat hun werk de strengste controles zal doorstaan.

Vind toepassingsnotities over deze Invitrogen-antilichamen en meer over de tweeledige testaanpak van Thermo Fisher Scientific hier.