The Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (ARNT/HIF-1β) is Influenced by Hypoxia and Hypoxia-Mimetics

Abstract

Achtergrond: De Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (ARNT, HIF-1β) is een lid van de basic-Helix-Loop-Helix PER/ARNT/SIM (bHLH/PAS) eiwitfamilie en een vitale transcriptionele regulator met betrekking tot ontwikkeling en fysiologische aanpassingsprocessen. Er wordt gesproken over een verband tussen ARNT en kanker en andere ziekten. Het is bekend dat ARNT wordt getranslokeerd naar de celkern, waar accumulatie van het eiwit plaatsvindt. ARNT is een heterodimerisatiepartner van de door xenobiotische liganden geactiveerde Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR), de Single Minded proteïnen (SIM), de cardiovasculaire helix-lus-helix factor 1 en de Hypoxia Inducible Factor proteïnen (HIF-α). ARNT is verplicht voor binding van HIF-1, HIF-2 en HIF-3 aan DNA. Terwijl de afbraak van de HIF-α subeenheden onderdrukt wordt door hypoxie, wordt ARNT over het algemeen beschouwd als constitutief tot expressie gebracht in overmaat binnen de cel, en de stabilisatie wordt over het algemeen verondersteld zuurstofonafhankelijk te zijn. Wij leveren echter het bewijs dat de regulatie van ARNT veel complexer is. Het doel van onze studie was om de regulatie van ARNT expressie opnieuw te evalueren. Methoden: We onderzochten cellijnen van verschillende oorsprong zoals MCF-7 en T47D (humane borstkanker), HeLa (humaan baarmoederhalscarcinoom), Hep3B en HepG2 (humaan hepatoom), Kelly (humaan neuroblastoom), REPC (humane nier) en Cos7 (primaire primaatnier) cellen. Er werd gebruik gemaakt van immunoblotanalyse, densitometrie, RT-PCR en transiënte transfectie. Resultaten en Conclusie: Onze resultaten tonen aan dat ARNT eiwit niveaus worden beïnvloed door hypoxie en hypoxie mimetica zoals kobalt(II)-chloride (CoCl2) en dimethyloxalylglycine (DMOG) op een cellijn specifieke manier. Wij tonen aan dat dit effect zou kunnen worden uitgelokt door HIF-1α dat een belangrijke rol speelt in het proces van stabilisatie van ARNT in hypoxie.

© 2013 S. Karger AG, Basel

Inleiding

De Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (ARNT) is lid van de basic-Helix-Loop-Helix PER/ARNT/SIM (bHLH/PAS) eiwitfamilie en een cruciale transcriptionele regulator betreffende organogenese en neurale ontwikkeling alsook fysiologische aanpassingsprocessen aan hypoxie en vervuilende stoffen. Naast ARNT (HIF-1β) bestaan er nog twee isovormen ARNT2 en ARNT3 (BMAL1, MOP3, JAP3, ARNTL1) in verschillende soorten. ARNT en ARNT2 delen een aminozuuridentiteit van >90%. ARNT heeft een meer alomtegenwoordig expressiepatroon dan ARNT2 in volwassen weefsel. Recente studies melden een verband tussen ARNT en verschillende celdisfuncties en ziekten, zoals kanker en diabetes.

Zoals alle bHLH-moleculen moet ARNT dimeren om actieve DNA-bindingscomplexen te vormen. ARNT is bekend om heterodimeren te vormen met de xenobiotische ligand geactiveerde Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) waarmee metaboliserende enzymen worden geïnduceerd, met HIF-α subeenheden (Hypoxia Inducible Factors) onder lage zuurstofniveaus, SIM (Single Minded) eiwitten voor neurale ontwikkeling en CHF1 (cardiovasculaire helix-lus-helix factor 1) . Eerder toonden we aan dat ARNT hoogstwaarschijnlijk naar de kern getranslokeerd wordt door klassieke nucleaire import gemedieerd door importins α/β . Ondanks een coëxistente nucleaire export accumuleert ARNT voornamelijk in de celkern.

In hypoxie worden de α-subeenheden van de Hypoxia Inducible Factors (HIF-α) gestabiliseerd en vormen heterodimeren met ARNT (HIF-1β) die de cellulaire respons op lage zuurstofniveaus reguleren. Momenteel worden drie verschillende isovormen van zuurstofafhankelijke HIF-α subeenheden geïdentificeerd: HIF-1α, HIF-2α (EPAS1) en HIF-3α . In normoxische omstandigheden ondergaan HIF-α eiwitten hydroxylering door Prolyl-Hydroxylase-Domain enzymen 1-3 (PHD1-3). Prolyl-gehydroxyleerd HIF-α dient als herkenningsmotief voor polyubiquitinatie door Von Hippel-Lindau Proteïne (pVHL) en daaropvolgende proteasomale degradatie. ARNT ontbeert echter het zuurstofafhankelijke afbraakdomein (ODDD) en wordt geacht constant tot expressie te komen in normoxische omstandigheden. De huidige opinie is dat hypoxie geen effect heeft op de ARNT niveaus. Er bestaan echter verspreide studies die een gedeeltelijk gelijktijdige stijging van de ARNT eiwitniveaus in hypoxie waarnemen. Hier leveren wij het bewijs dat ARNT expressie inderdaad beïnvloed en gemoduleerd wordt afhankelijk van het geëvalueerde celtype. Dit suggereert dat tumorcellen het vermogen zouden kunnen verliezen om ARNT te reguleren tijdens de tumorigenese. Onze gegevens tonen aan dat de regulatie van ARNT expressie veel complexer is dan algemeen wordt gedacht.

In onze studie onderzochten we de expressie van ARNT onder verschillende soorten hypoxie, hypoxie mimetica en Hypoxia Inducible Factors waarbij cellijn specifieke en cofactor afhankelijke expressiepatronen werden onthuld.

Materialen en Methoden

Celkweek, Hypoxische Inductie en Hypoxie Mimetica

De cellijnen MCF-7 (humaan borst ductaal carcinoom), T47D (humaan borst ductaal carcinoom), Hep3B (menselijk hepatocellulair carcinoom), HeLa (menselijk cervix adenocarcinoom), HepG2 (menselijk hepatocellulair carcinoom) en Cos-7 (primaten fibroblast-achtige niercellen) werden geïncubeerd in DMEM kweekmedium (Gibco). De cellijnen REPC (primaire menselijke nier, ) en Kelly (menselijk neuroblastoom) werden gekweekt in RPMI-1640 medium (Gibco). Het kweekmedium werd aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS, Gibco) en respectievelijk 100 IE/ml penicilline / 100 µg/ml streptomycine. De cellen werden gekweekt in een gehumidificeerde atmosfeer bij 37°C, 5% CO2 en 20,9% O2 (normoxie). Voor hypoxische studies werden de cellen geplaatst in een gehumidificeerde atmosfeer van 37°C, 5% CO2, gebalanceerde N2 met ofwel 1% of 3% O2. Kobalt(II)-chloride (CoCl2) werd gebruikt in een 50 µM verdunning en dimethyloxalylglycine (DMOG) werd gebruikt in een 1 mM verdunning als hypoxie mimetic.

Transient Transfection

De cellijnen MCF-7, T47D en Hep3B werden getransfecteerd met siRNA met behulp van Lipofectamine ™ RNAiMAX transfectie reagens (Invitrogen). Cellen werden gekweekt tot 50% confluentie in 6-well kweekplaten voordat de transfectie werd uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant. Voorafgaand aan de toepassing van hypoxie het kweekmedium werd veranderd en cellen werden geïncubeerd nog eens 6 uur in normoxische omstandigheden.

Immunoblot Analyse en Densitometry

Voor Western blotting cellen werden verzameld na behandeling, gewassen met ijskoud PBS, geëxtraheerd met ureum lysisbuffer en gesoniceerd het verzamelen van hele cellysaten. Eiwitconcentraties werden bepaald met Bio-Rad DC Protein Assay volgens het protocol van de fabrikant. Eiwitextracten werden geëlektroforeerd met SDS-PAGE en overgebracht op nitrocellulosemembranen door semi-droge elektroblotting. De membranen werden geblokkeerd met 5% vetvrije melk in PBS. Primaire antilichamen (HIF-1α: BD transduction, 1:1000; ARNT: Novus 1:1000) werden ’s nachts geïncubeerd, gevolgd door HRP corresponderende secundaire antilichamen (DAKO 1:5000) toegevoegd gedurende 2 uur. ECL (GE Healthcare) werd gebruikt als detectiereagens. De hoeveelheid eiwitten werd vergeleken met behulp van Aida Image Analyser v.4.27 (Raytest) volgens de protocollen. Elke Western blot achtergrond werd afgetrokken van het individuele meetgebied. Overeenkomstige Lamin A / C belasting werd beschouwd als 100% en de proportionele waarde werd berekend.

RNA Isolatie en RT-PCR

Om specifieke kwantitatieve mRNA niveaus te meten, werd totaal RNA geïsoleerd uit de cellen met behulp van ABI Prism 6100 Nucleic Acid PrepStation (Applied Biosystems) volgens de instructies van de fabrikant. Vervolgens werd 0,2 µg RNA omgekeerd getranscribeerd met Superscript III (Invitrogen). Het gegenereerde cDNA werd gebruikt als sjabloon voor kwantitatieve real-time PCR-analyse (RT-PCR). RT-PCR werd uitgevoerd met ABI 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems), TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) en KAPA SYBR FAST Universal (Peqlab). Amplificatie werd uitgevoerd met TaqMan Genexpressie Assays (Hs01100353_m1, Applied Biosystems) volgens de protocollen van de fabrikant. Voor de normalisatie werden specifieke primers voor het L28-huishoudgen (sense: 5`-ATGGTCGTGCGGAACTGCT-3` en reverse: 3`-TTGTAGCGGAAGGAATTGCG-5`) gebruikt. De cyclische condities waren een initiële polymerase activeringsstap bij 95°C gedurende 10 min, gevolgd door 45 cycli bij 95°C gedurende 15 s, 55°C gedurende 30 s en bij 72°C gedurende 20 s. De monsters werden in viervoud geanalyseerd en de relatieve hoeveelheden mRNA werden berekend met de ∆∆CT methode.

Statistieken

Statistische analyse werd uitgevoerd met GraphPad InStat Software. Ongepaarde t-tests werden toegepast. Grafieken worden weergegeven als gemiddelde ± standaardafwijking (SD). MTT-overlevingstests werden uitgevoerd (gegevens niet weergegeven) om ervoor te zorgen dat de celoverleving niet verschilt tussen de monsters.

Results

ARNT expressie wordt geïnduceerd in hypoxie in MCF-7, HeLa, Hep3B en REPC cellen

We onderzochten de hoeveelheid ARNT eiwit niveaus door het kweken van MCF-7 cellen in normoxische (21% O2) omstandigheden gedurende 24 uur, gevolgd door ofwel 48 uur normoxie (Nox) of 24 uur normoxie en 24 uur hypoxie 1% (Hox 1% 24u, 1% O2) of alleen 48 uur hypoxie 1% (Hox 1% 48u, 1% O2). Hele celextracten werden geanalyseerd door immunoblotting met een monoklonaal muis anti-ARNT antilichaam. HIF-1α proteïne werd waargenomen om hypoxische celinductie te bevestigen. Zoals aangetoond in Fig. 1, werden de ARNT eiwitniveaus verhoogd in reactie op hypoxie in MCF-7 cellen. 24 uur incubatie met 1% hypoxie leidde tot een significante toename van ARNT in vergelijking met 48 uur van 1% hypoxie.

MCF-7-cellen werden tot 96 uur in 1% hypoxie geïncubeerd, om de langetermijneffecten van hypoxie aan het licht te brengen. MCF-7-cellen vertoonden een toenemende ARNT-concentratie na 12 uur. Bij verdere blootstelling aan hypoxie begon de ARNT-concentratie af te nemen tot een basislijnwaarde (fig. 2).

ARNT inductie als gevolg van verschillende intensiteiten van hypoxie werd gemeten kweken MCF-7 cellen in 3% hypoxie (3% O 2) en 1% hypoxie (1% O 2) gedurende 12 uur en 24 uur (Fig. 3a).

Om verschillen tussen verschillende cellijnen op te helderen kweekten we HeLa, Hep3B en REPC cellen vergelijkbaar met MCF-7 cellen (Fig. 3b-d). In alle met hypoxie behandelde celtypes waren de ARNT eiwitniveaus verhoogd. 1% hypoxie leidde tot een snellere toename van de ARNT eiwitniveaus, maar ook tot een vroegere normalisatie dan bij 3% hypoxie. 3% hypoxie vertoont een maximale inductie van ARNT na 24 uur.

Verschillende cellijnen vertonen verschillende reacties op hypoxie en hypoxie mimetica wat betreft ARNT eiwit niveaus

Om een relatie tussen ARNT niveaus en HIF-α te onderzoeken, werden MCF-7, HeLa, Cos7, REPC, HepG2, Hep3B, en Kelly cellen behandeld met de hypoxie mimetica kobalt(II)-chloride (CoCl2) en dimethyloxalylglycine (DMOG) (Fig. 4a-g).

HepG2- en Kelly-cellen reageerden niet op 24 uur hypoxie met een toename van de ARNT-eiwitniveaus. HeLa cellen vertoonden een lichte ARNT inductie in hypoxie en onder behandeling met hypoxie mimetica, maar dit effect was niet statistisch significant. MCF-7 cellen toonden duidelijk een toename van ARNT eiwit niveaus onder 24 uur van 3% hypoxie en een toename van ARNT eiwit niveaus als gevolg van CoCl2 behandeling. Aan de andere kant had DMOG behandeling geen effect op ARNT niveaus in MCF-7 cellen, hoewel DMOG een zeer krachtige HIF stabilisator is. Cos7 cellen toonden een sterk effect van ARNT inductie op zowel hypoxie als op de hypoxie mimetica CoCl2 en DMOG. REPC cellen vertoonden een sterke reactie op hypoxie, maar CoCl2 inductie van ARNT was relatief klein. DMOG verminderde de ARNT-eiwitniveaus in REPC-cellen. HepG2 cellen reageerden niet met ARNT eiwitniveau inductie op hypoxie noch op DMOG. HepG2 cellen vertoonden echter een zeer sterke ARNT inductie door CoCl2. Hep3B cellen reageerden met een verhoging van ARNT eiwit niveaus op alle behandelingen. Kelly cellen vertoonden geen reactie in ARNT eiwit niveaus, noch op hypoxie noch op hypoxie mimetica.

Verschuivingen in ARNT mRNA niveaus correleren niet met ARNT eiwit niveaus onder invloed van hypoxie en hypoxie mimetica

We gebruikten de kwantitatieve RT-PCR methode, om mRNA niveaus te onderzoeken gerelateerd aan de waargenomen veranderingen in ARNT eiwit niveaus. MCF-7, HeLa, REPC en Hep3B cellen werden gekweekt in normoxische condities voordat 3% hypoxie, 1% hypoxie, CoCl2 en DMOG behandeling gedurende 24 uur werd toegepast (Fig. 5). MCF-7 cellen vertoonden een niet significante afname van ARNT mRNA niveaus in reactie op hypoxie. Een significante vermindering van ARNT mRNA niveaus als gevolg van CoCl2 en DMOG behandeling werd echter waargenomen. Terwijl HeLa en REPC cellen geen effect vertoonden op ARNT mRNA niveaus na behandelingen, reageerden Hep3B cellen op hypoxie met een sterke vermindering van ARNT mRNA. In deze cellen werd een lichtere afname van de reactie op CoCl2 waargenomen.

ARNT-eiwit wordt gestabiliseerd in aanwezigheid van HIF-1α

MCF-7-, T47D- en Hep3B-cellen werden transiënt getransfecteerd met HIF-1α siRNA, om het effect van Hif-1α op ARNT-eiwitniveaus te verduidelijken (Fig. 6). Cellen werden geïncubeerd gedurende 48 uur in normoxia met transfectiereagens RNAiMAX en siRNA, gevolgd door een 6 uur durende herstelfase. Vervolgens werden de cellen gedurende 24 uur in 1% hypoxie gehouden. We stelden vast dat de ARNT-eiwitniveaus daalden in hypoxie als HIF-1α werd geblokkeerd. Niet-specifieke siRNA transfectie had echter geen invloed op de waargenomen toename van ARNT eiwitniveaus in hypoxie.

Discussie

De Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (ARNT/HIF-1β) speelt een rol als centrale transcriptieregelaar in de cellulaire homeostase. Het functioneert als een heterodimerisatie partner van verschillende belangrijke regulator eiwitten, zoals HIF-α, SIM eiwitten, AhR en CHF1. Daarom is het betrokken bij tal van verschillende regulerende cellulaire paden. Omdat men ervan uitgaat dat ARNT constitutief tot expressie komt en niet beïnvloed wordt door fysiologische of farmacologische veranderingen, bijvoorbeeld hypoxie, werd ARNT in vroegere rapporten niet beschouwd als de beperkende factor en een mogelijk therapeutisch doelwit . Recente studies melden echter een verband tussen ARNT en verschillende ziekten, zoals kanker. Het is bekend dat HIF-1α en HIF-2α cruciale functies hebben in de ontwikkeling en/of therapie van kanker. Als hun verplichte cofactor, zou ARNT depletie resulteren in inactieve of verlaagde niveaus van HIF-α complexen. Om de relevantie van ARNT verder te onderstrepen, tonen we voor het eerst aan dat hypoxie, hypoxie mimetica en HIF-1α een belangrijke rol spelen in de regulatiemechanismen van ARNT expressie, afhankelijk van het geëvalueerde celtype.

We onderzochten acht verschillende cellijnen van 2 verschillende gastheersoorten om de invloed van hypoxie en hypoxie mimetica op ARNT proteïne expressie aan te tonen. MCF-7 borstkankercellen reageren op hypoxie met een toename van ARNT eiwit niveaus, terwijl ARNT mRNA niveaus lijken af te nemen of onveranderd blijven. Dit impliceert dat er een wederkerige terugkoppelingsregeling bestaat tussen eiwitstabilisatie en de novo synthese. Gelijkaardige down- en up-regulaties van gentranscriptie bij hypoxie zijn bekend voor verschillende enzymen en moleculen. Onze bevindingen zijn niet noodzakelijk het resultaat van een algemene vermindering van de mRNA-synthese in de cel als antwoord op celstress, want de transcriptie van het ESR2-gen wordt geïnduceerd bij hypoxie en HIF-1α knock-down (ongepubliceerde gegevens).

De blootstelling aan hypoxie gedurende een langere periode dan 48 uur leidt tot een terugkeer naar de basale ARNT-eiwitniveaus die ook bij normoxie kunnen worden waargenomen. Een soortgelijke expressiepiek is bekend voor HIF-1α-eiwit na 4 tot 12 uur onder hypoxische behandeling. Verdere hypoxische incubatie leidt tot dalende HIF-1α niveaus tot een steady state bereikt wordt. Dit feit zou kunnen wijzen op een stabiliserend effect van HIF-1α overexpressie naar ARNT. De vorming van HIF-1α/ARNT complexen in de kern zou ARNT degradatie via proteasomen kunnen verhinderen, wat in lijn is met Choi et al. en Mandl et al. Om onze bevindingen te onderzoeken hebben we HIF-1α tijdelijk uitgeschakeld in MCF-7 cellen en zagen we tot 90% vermindering van de ARNT eiwitniveaus in hypoxie vergeleken met normoxie. Dit effect kon ook worden waargenomen in T47D en Hep3B cellen. Een kruisreactie van HIF-1α siRNA die ARNT neerhaalt vanwege een sterke sequentie homologie tussen ARNT en HIF-α werd uitgesloten door in silico analyse van de siRNA en gen sequenties. Deze bevindingen suggereren een sterke correlatie tussen ARNT en HIF-1α proteïne expressie. Een verklaring zou een stabiliserend effect kunnen zijn van de O2 onafhankelijke ARNT bindingspartners, zoals de AhR, SIM en CHF1, ten opzichte van ARNT in normoxie. In hypoxie zouden verlaagde niveaus van AhR, SIM en CHF1, gecompenseerd kunnen worden door overexpressie van HIF-α wat ARNT stabilisatie betreft. Het uitschakelen van HIF-1α zou dus kunnen leiden tot sterk verlaagde ARNT-niveaus via verminderde de novo synthese en minder stabiliteit voor ubiquitinatie en proteasomale degradatie, omdat dimerisatiepartners ontbreken. Deze hypothese zou wijzen op een regulatie van ARNT die sterk afhankelijk is van bindingspartners, hetgeen in lijn zou zijn met Choi et al. en Mandl et al. Om te onderzoeken of HIF-α inductie leidt tot een gelijktijdige toename van ARNT expressie, behandelden we cellen met CoCl2 en DMOG. Ondanks het feit dat het HIF-α stabiliserende effect van CoCl2 en DMOG analoog is, reageren MCF-7 cellen na DMOG minder sterk met een toename van ARNT eiwit dan na CoCl2 behandeling. Deze waarnemingen zijn in lijn met een HIF-α-stabiliserend effect op ARNT. Een tegengesteld gedrag tussen CoCl2 inducerende ARNT in tegenstelling tot DMOG kon worden waargenomen in HepG2 cellen. Interessant is dat REPC cellen reageren met een daling van ARNT niveaus onder DMOG behandeling. Hoewel het HIF-α stabiliserende effect van DMOG vergelijkbaar is met dat van CoCl2, is een andere cellulaire reactie door DMOG niet ongebruikelijk als gevolg van een ander werkingsmechanisme. Anderzijds reageren Cos7 en Hep3B cellen op hypoxie en beide hypoxie mimetica met een sterke toename van ARNT eiwit niveaus, hetgeen in lijn is met het HIF-α stabiliserende effect gepostuleerd door Mandl et al. Het feit dat, in tegenstelling tot verschillende tumorcellijnen, de ARNT niveaus goed beïnvloed worden in de primaire cellijn Cos7 door hypoxie en hypoxie mimetica zou een verlies van functie tijdens de tumorigenese in bepaalde tumoren kunnen impliceren. Gegevens betreffende ARNT in de ontwikkeling van cellulaire kanker zijn schaars en daarom is verder onderzoek nodig.

De Hep3B cellijn vertoont significante verhogingen van ARNT eiwit niveaus door alle drie hypoxische behandelingen, terwijl hypoxie en CoCl2 het ARNT mRNA significant verlagen. Deze bevindingen ondersteunen de hypothese van een wederkerig terugkoppelingsmechanisme, dat ook kan worden verondersteld in MCF-7 cellen. De REPC niercellijn vertoont een afwijkend gedrag. Deze cellen reageren met een sterke toename van ARNT eiwit door hypoxie, maar met een minder intense inductie door CoCl2 en in tegenstelling met afnemende ARNT eiwit niveaus onder DMOG behandeling zoals hierboven besproken. Maar verder vertonen REPC cellen geen variatie in ARNT mRNA niveaus onder de verschillende behandelingen wat een regulatie op eiwitbasis impliceert.

Kelly cellen vertonen stabiele ARNT eiwitniveaus. Noch hypoxie noch hypoxie mimetica zijn in staat de ARNT te beïnvloeden. Dergelijke stabiele ARNT-niveaus worden ook gezien in HepG2-cellen bij hypoxie en DMOG-behandeling, maar deze cellijn reageert met een sterke toename van ARNT-eiwit bij CoCl2-behandeling. HeLa cellen vertonen geen significante verandering van ARNT niveaus, noch wat betreft eiwit noch mRNA. Deze bevindingen ondersteunen de huidige opvatting, dat ARNT constant tot expressie komt en niet beïnvloed wordt door hypoxie zoals besproken door Semenza . Wij en anderen hebben aangetoond dat deze opvatting niet kan worden veralgemeend. Wij leveren hierbij gegevens die de hypothese van een constant tot expressie komende en ongereguleerde ARNT heterodimerisatie partner tegenspreken, maar die in lijn zijn met Chilov et al. Ook ondersteunend voor Choi et al. en Mandl et al., tonen we aan dat de heterodimerisatie met HIF-α een belangrijk mechanisme is van stabilisatie van ARNT eiwit in hypoxie .

In conclusie, onze gegevens suggereren een algemene stabiliserende regulatie van ARNT bindingspartners, zoals HIF-α, AhR, SIM en CHF1 met betrekking tot ARNT expressie. Bovendien kunnen we aantonen dat elke cellijn / type verschillend reageert op hypoxie en hypoxie mimetica met betrekking tot de inductie ARNT eiwitsynthese. Daarom is een universele celoverspannende predicatie van ARNT proteïne expressie niet toelaatbaar. Deze bevindingen tonen aan dat ARNT regulatie verder onderzocht moet worden, vooral met betrekking tot tumorigenese, omdat ARNT regulatie veel complexer is dan vandaag de dag wordt aangenomen.

Acknowledgments

We zijn T. Svensson, B. Rudzewski en A.-K. Hellberg voor uitstekende technische ondersteuning. De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflict hebben.

Open Access Licentie / Drug Dosering / Disclaimer

Open Access Licentie: Dit is een Open Access artikel met een licentie onder de voorwaarden van de Creative Commons Naamsvermelding-NietCommercieel 3.0 Unported licentie (CC BY-NC) (www.karger.com/OA-license), alleen van toepassing op de online versie van het artikel. Distributie uitsluitend toegestaan voor niet-commerciële doeleinden.
Dosering van het geneesmiddel: De auteurs en de uitgever hebben alles in het werk gesteld om ervoor te zorgen dat de keuze van geneesmiddelen en de dosering die in deze tekst worden uiteengezet, in overeenstemming zijn met de huidige aanbevelingen en praktijk op het moment van publicatie. Echter, met het oog op voortdurend onderzoek, veranderingen in overheidsvoorschriften en de constante stroom van informatie met betrekking tot geneesmiddelentherapie en -reacties, wordt de lezer dringend verzocht de bijsluiter van elk geneesmiddel te raadplegen voor eventuele wijzigingen in indicaties en dosering en voor toegevoegde waarschuwingen en voorzorgsmaatregelen. Dit is vooral belangrijk wanneer het aanbevolen middel een nieuw en/of weinig gebruikt geneesmiddel is.
Disclaimer: De verklaringen, meningen en gegevens in deze publicatie zijn uitsluitend die van de individuele auteurs en medewerkers en niet die van de uitgevers en de redacteur(en). Het verschijnen van advertenties of/en productreferenties in de publicatie is geen garantie, goedkeuring of goedkeuring van de geadverteerde producten of diensten of van hun effectiviteit, kwaliteit of veiligheid. De uitgever en de redacteur(s) wijzen elke verantwoordelijkheid af voor enig letsel aan personen of eigendom als gevolg van ideeën, methoden, instructies of producten waarnaar in de inhoud of advertenties wordt verwezen.