Top vijf methoden voor primaire antilichaamlabeling

In elke toepassing waarbij antilichamen worden gebruikt voor signaaldetectie (bijv. Western blotting, ELISA, immunohistochemie of FACS), zijn er twee benaderingen voor antilichaamlabeling: directe en indirecte labeling. Standaard Western blotting maakt gebruik van indirecte labeling, omdat u een primair antilichaam gebruikt om het doelantigeen te detecteren, gevolgd door een secundair antilichaam waaraan een detectiemolecuul is gehecht.

In sommige situaties kan het beter zijn om het secundaire antilichaam en alle bijbehorende stappen over te slaan en uw primaire antilichaam direct te labelen. Gevallen die schreeuwen om directe primaire antilichaam labeling omvatten:

• Er is een aspecifieke binding van het secundaire antilichaam
• U gebruikt nietstandaard organisme primaire antilichamen – in dit geval kan het moeilijk zijn om goede secundaire antilichamen te vinden
• Bij multiplexing met antilichamen die van dezelfde soort afkomstig zijn
• Wanneer u de experimentele tijd moet verkorten door incubatie van secundaire antilichamen en de bijbehorende wasstappen te elimineren

Antibody Parameters

U kunt uw gekozen antilichaam niet alleen labelen met fluorescerende kleurstoffen, maar ook met fluorescerende eiwitten, enzymen, en gekleurde deeltjes. Al deze zijn gewoonlijk verbonden via een terminale lysinegroep, zodat u amine-bevattende buffers (b.v. Tris) en moleculen in alle stappen moet vermijden. Anders zult u vooral uw buffermoleculen labelen! Je moet ook de gemeenschappelijke buffer conserveermiddel natriumazide te vermijden, omdat het zal interfereren met de labeling reactie.

Het antilichaam voor labeling moet in een concentratie niet minder dan 0,5 mg / ml en >90% zuiver. Hoe minder storende proteïnen en aminogroep-bevattende moleculen u in uw antilichaampreparaat hebt, hoe efficiënter de labelingreactie zal zijn. Maar zelfs als uw antilichaam zwemt in glycine en BSA, kunt u interfererende stoffen altijd verwijderen door dialyse. U kunt ook de zuiverheid van uw antilichaam verbeteren door het door een A-eiwit kolom te voeren of u kunt zelfs uw eigen affiniteitszuiveringskolom met een geschikt antigeen bereiden.

Belangrijkste in-huis-antilichaam-labelingmethoden

NHS (Succinimidyl) Ester Methode

Deze methode is nuttig voor de conjugatie van antilichamen met algemeen beschikbare fluorescerende kleurstoffen zoals rhodaminederivaten. Zij wordt typisch uitgevoerd in een fosfaatbuffer met daaropvolgende on-column scheiding van de niet-gelabelde kleurstof. Het belangrijkste nadeel is dat de esters onstabiel zijn omdat zij vochtgevoelig zijn. Het gelabelde antilichaam moet onmiddellijk na het einde van de reactie worden gebruikt.

Isothiocyanaat Methode

U kunt deze methode gebruiken om fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) te maken, dat zeer populair is bij de bereiding van fluorescerende eiwitten en antilichamen. Als u met fluorescentiemicroscopie hebt gewerkt, hebt u met FITC te maken gehad. Isothiocyanaat-analogen van verschillende standaard kleurstoffen zijn ook verkrijgbaar.

Isothiocyanaat is stabieler dan NHS, maar het is moeilijker te maken en uw labeling-reactie zal waarschijnlijk minder efficiënt zijn met deze methode. Zoals met NHS, moet de overtollige kleurstof na de reactie door chromatografie worden verwijderd.

Carbodiimide Methode

Carbodiimide-afgeleide verbindingen zetten carboxylgroepen op proteïnen om in reactieve tussenproducten die met lysines kunnen reageren. De hoge reactiviteit van carbodiimiden betekent dat zij kunnen worden gebruikt om antilichamen te etiketteren met betrekkelijk inerte materialen zoals magnetische of gouddeeltjes. Het meest gebruikte carbodiimide is EDC. Soms wordt NHS aan de reactie toegevoegd om de vorming van relatief stabiele tussenproducten te bevorderen.

De methode is eenvoudig, maar net als NHS is EDS hygroscopisch, zodat u uw antilichaam onmiddellijk na het labelen moet gebruiken.

Twee-tagmethode

Hierbij labelt u uw antilichaam met een ander eiwit dat als katalysator fungeert, bijvoorbeeld HRP of alkalische fosfatase. Aangezien beide moleculen talrijke aminogroepen bevatten, zou directe cross-linking (zoals bij de NHS-methode) leiden tot polymeren van hetzelfde molecuul. Daarom zou u de koppeling in twee afzonderlijke stappen uitvoeren. Je crosslinkt het antilichaam aan molecuul X en de katalysator aan molecuul Y. Je moet X en Y zorgvuldig kiezen omdat ze moeten interageren om het conjugaat te vormen. Je zou bijvoorbeeld maleimide kunnen kiezen als X en een thiol als Y.

Hoewel het resulterende conjugaat stabieler zal zijn dan wat je verkrijgt met de NHS methode, zal deze methode drie keer zoveel werk vergen; aparte labeling en zuiveringsstappen voor het antilichaam, de katalysator, en de conjugerende reactie. Het goede nieuws is dat u vooraf gelabelde katalytische molecule kunt kopen en vervolgens uw antilichaam dienovereenkomstig kunt labelen.

Periodaatmethode

Deze methode is nuttig voor het genereren van specifieke HRP-antilichaamconjugaten. Periodaat activeert HRP door aldehydemoleculen te creëren die een wisselwerking aangaan met lysineresten. HRP zelf heeft slechts enkele lysineresten, zodat polymerisatie van het enzym geen probleem van betekenis is. De bindingen tussen HRP en het antilichaam zijn omkeerbaar tenzij gestabiliseerd door toevoeging van natriumcyanohydride.

Dat was mijn opsomming van de beste zelfgemaakte methoden voor het labelen van antilichamen. Er zijn een heleboel commerciële kits op de markt met vergelijkbare onderliggende chemie die uw leven veel gemakkelijker kunnen maken. Als uw lab het geld heeft.

Heeft u een andere antilichaam labeling methode die u met ons zou willen delen? Neem contact op door te schrijven in de commentaarsectie.

Literatuur:

Meyer JP, Adumeau P, Lewis JS, Zeglis BM. Click Chemistry and Radiochemistry: The First 10 Years. Bioconjug Chem. (2016) 27(12):2791-2807. doi: 10.1021/acs.bioconjchem.6b00561. Epub 2016 Nov 22.