Understanding the structural basis of HIV-1 restriction by the full length double-domein APOBEC3G

Algemene structurele kenmerken van de fl rA3G

Een belangrijk obstakel bij structurele studies van fl dubbel-domein APOBEC eiwitten is de slechte oplosbaarheid – wild-type vormen worden vaak gezuiverd als niet-homogene oligomeren of grote aggregaten bij hogere concentraties. Om een goed oplosbaar fl A3G te verkrijgen voor structurele bepaling, onderzochten we A3G homologen van verschillende primatensoorten en ontdekten dat A3G van resusaap (rA3G) een verbeterde oplosbaarheid had. Twee fl rA3G mutatie constructen (aangeduid als FKL en E/Q) leverde goed gedragen eiwitten en kristallen in verschillende omstandigheden (Supplementary Tabel 1) die diffracted tot 2,47 en 2,40 Å, respectievelijk (Supplementary tabellen 1 en 2, Supplementary Fig. 1). Aanvullende wijzigingen in deze twee constructen verbeterde de oplosbaarheid en opbrengst van rA3G met inbegrip van vervanging van een 8-residu CD1 lus 8 door de 4-residu lus 8 van hA3G-CD2 (zoals in zowel E / Q en FLK constructen, Supplementary Tabel 1, Supplementary Fig. 1), verder mutaties F126Y op CD1-lus 7, K180S/L184S op CD1 h6, en 8-residu deletie van de CD2-lus 3 (zoals in het FKL-construct, supplementaire tabel 1, supplementaire fig. 1B). Er zij op gewezen dat K128 van rA3G, dat als barrière voor de overdracht tussen soorten fungeert, gemuteerd is in een asparaginezuurresidu (D128) zoals in humaan A3G (hA3G)36. De constructen bevatten ook een katalytische E259 naar Q/A mutatie om mogelijke toxiciteit bij recombinante eiwitexpressie te voorkomen. De gemuteerde residuen en hun locaties op de structuur worden getoond in supplementaire Fig. 1B. In beide structuren CD1 en CD2 zijn gevouwen in stand-alone domeinen verbonden door een korte 5-residue linker (residuen R194 tot D198) (Fig. 1a, b). De twee structuren vertonen, ondanks algemene structurele gelijkenis (Fig. 1a, b), duidelijke verschillen in de CD2-conformatie en de pakkingsoriëntatie tussen CD1 en CD2 (Fig. 1c, Supplementary Fig. 2A).

Zowel de rA3G FKL als de E/Q structuren hebben dezelfde canonieke CD1 structuur en superponeren goed over elkaar (Aanvullende Fig. 2B, rmsd van 0.445 Å). De veel grotere conformatieverschillen in elk CD2-domein resulteren in een superimpositie rmsd van 0,862 Å. Bij het uitlijnen van de FKL- en E/Q-structuren via hun CD1-domein, vertoont het CD2-domein van de E/Q-structuur een rotatie van ~29° vergeleken met het CD2 van de FKL-structuur, waardoor het E/Q CD2-domein ~15 Å naar beneden en ~8 Å naar CD1 verschuift, en wat resulteert in een veel nauwere verpakkingsinteractie met CD1 (supplementaire figuur 2 A). Het totale CD1-CD2-verpakkingsinterface heeft een begraven oppervlak van ~623 Å2 voor de FKL-structuur en ~700 Å2 voor de E/Q-structuur. De strakkere CD1-CD2 verpakking in de E/Q structuur leidt slechts tot een iets groter begraven oppervlak dan de FKL structuur, waarschijnlijk als gevolg van het omvouwen en de ontbrekende dichtheid van de interface lokaliseren structurele elementen (h2-lus3) van zijn CD2.

Twee soorten interacties tussen CD1- en CD2-domeinen

Terwijl de FKL-structuur een canonieke vouwing van zijn CD2-domein laat zien (supplementaire fig. 2C), laat de E/Q-structuur een significante verandering zien in de conformatie van CD2 (supplementaire fig. 2D), met grote veranderingen op helix 2 (h2), lus 3, lus 4, en het Zn-actieve centrum. De lange h2 van CD2 in de FKL structuur (supplementaire Fig. 2C) is een korte 310 helix (h2′) geworden in de E/Q structuur (supplementaire Fig. 2D), resulterend in een ongeordende 14-residue stretch over delen van lus 3 en h2 (residu’s A246 tot E259) (supplementaire Fig. 1A). De verschuiving naar een korte 310 h2 en verlengde random spoel structuur is noodzakelijk om botsingen in deze tight packing conformatie te vermijden (Fig. 1e). Echter, dit verstoort ook de conformatie van het CD2 Zn-actieve centrum binnen de gebieden van h2 en lus 3 die ongeordend worden, wat resulteert in geen Zn-coördinatie (Supplementaire Fig. 2D). De afwezigheid van Zn-coördinatie is waargenomen in slechts één andere APOBEC, de APOBEC3F (A3F) CD2 structuur46,47. De Zn-houdende of afwezige A3F-CD2 structuren zijn echter in wezen identiek, die ook goed uitlijnen met verschillende andere APOBEC structuren (Supplementaire Fig. 2E), terwijl de E/Q CD2 uniek is in zijn omgevouwen h2-lussen 3 en 4 en de Zn-centrum conformatie (Supplementaire Fig. 2E, F).

Hoewel het mogelijk is dat het verlies van Zn en de hervouwing van CD2 in de E/Q structuur het gevolg zijn van de mutaties in dit construct, hebben we onderzocht of de E/Q variant een defecte katalyse activiteit heeft. Omkering van E259Q in het E/Q construct terug naar het WT katalytische E259 (E/Q* construct) gaf de variant volledige activiteit terug in deamination assay met behulp van HEK293T celexpressie lysaten (Supplementary Fig. 3). Bovendien is E/Q* met de afzonderlijke mutaties F126Y, K180S/L184S, of CD2Δloop3 (zoals in de FKL-structuur) allemaal actief, hoewel de activiteit van het FKL*-construct (met E259A teruggebracht tot E259) met de gecombineerde mutaties minder is dan E/Q* en WT. Deze resultaten suggereren dat hoewel de gekristalliseerde E/Q structuur, zonder Zn in het CD2 domein, een katalytisch inactieve A3G structurele toestand vertegenwoordigt, het terugdraaien van het katalytische residu naar E259 de deaminase activiteit volledig kan herstellen vergelijkbaar met WT. Gecombineerde mutaties in FKL beïnvloeden gedeeltelijk de katalytische activiteit.

Door het ~29° verschil in de relatieve hoek van rotatie in verpakking tussen elk domein in de FKL en E/Q structuren, verschillen de gedetailleerde moleculaire interacties tussen CD1 en CD2 tussen de twee structuren. De CD1- en CD2-domeinen in de FKL-structuur interageren voornamelijk met elkaar via h3, h4 en lus 7 van CD1 en h1, h2, β2 en lus 3 van CD2 (Fig. 1a, d). In de E/Q structuur interageren de twee domeinen hoofdzakelijk via h3, h4, en h6 van CD1 met h2′, β2, lus 4 en lus 10 van CD2 (Fig. 1b, e). Als gevolg hiervan verschilt ongeveer 40% van de interagerende residuen tussen CD1 en CD2 in de twee structuren (zie een volledige lijst van de interagerende residuen in supplementair Fig. 4), en zelfs wanneer dezelfde residuen deelnemen aan deze interactie, maken ze vaak verschillende bindingscontacten als gevolg van de verandering in de inpakkingshoek tussen de twee domeinen. De mogelijkheid om de CD1 en CD2 domeinen met verschillende hoeken en residu-interacties in te pakken wijst op een zekere mate van plasticiteit in de domeinindeling van fl A3G.

Volledige lengte rA3G dimer en kenmerken van het dimerisatiegebied

Het E/Q construct werd gekristalliseerd in verschillende pH- en zoutcondities (supplementaire tabel 1) maar vertoonde consistent dezelfde structuur en dimerisatie via CD1-CD1 interacties (Fig. 2a, b), voornamelijk door directe pakking van verschillende residuen op h6 (K180, L184, A187), lus 1 (I26) en lus 7 (F126, W127) van beide subeenheden (Supplementary Fig. 5A, B). Interessant is dat deze interacties identiek zijn aan die eerder gerapporteerd voor het rA3G-CD1 domein alleen18, ondanks opname van de K128D mutatie die kritisch is voor het veranderen van rA3G van HIV-1 Vif ongevoelig naar gevoelig voor afbraak. Het is vermeldenswaard dat dergelijke dimerisatie van fl rA3G slechts leidt tot een kleine toename van de grootste dimensie van 85 Å van een monomeer tot 95 Å van een dimeer (Fig. 2a, b).

Een gedetailleerd onderzoek van de residuen die aan weerszijden van het dimer-interfacegebied zijn uitgelijnd, brengt twee opvallende kenmerken aan het licht. Ten eerste zijn er in totaal 18 positief-polaire en hydrofobe residuen rondom de rA3G dimeer verbinding op een wijze die geschikt is voor interactie met enkelstrengs nucleïnezuren zoals RNA (Inzet B in Fig. 2). Deze 18 residuen zijn georganiseerd in twee sets, waarbij de eerste set met de klok mee begint bij het bovenste monomeer (in groen), R24, H181, N177, N176, K180, en doorgaat naar het onderste monomeer (in lichtblauw) W127, Y125, Y124, en S28, en vervolgens met de gespiegelde set van deze zelfde residuen. Ten tweede zijn door de dimerisatie de R24 en de nabijgelegen positieve residuen K180 en H181 van elk monomeer dicht bij elkaar in de ruimte gepositioneerd, met ongeveer 7 Å afstand tussen de twee R24 residuen. Deze ruimtelijke rangschikking verhoogt de lokale elektrostatische potentialen (EP) aanzienlijk van ongeveer +1,9 kT/e als monomeer tot +8,3 kT/e als dimeer (Fig. 2c en Inzet C, Fig. 2d en Inzet D). De aanwezigheid van goed uitgelijnde residuen die geschikt zijn voor het binden van enkelstrengs nucleïnezuren, alsmede de verhoogde positieve EP (PEP) rond de waargenomen dimeerverbinding impliceren sterk dat dit gebied RNA als een dimeer kan binden, en suggereert dat verstoring van deze A3G dimerisatie-interface van invloed kan zijn op de RNA-binding door verstoring van de verhoogde PEP (Fig. 2c) tot de lage PEP als in een monomere vorm (Fig. 2d).

Dimer mutatie effect op RNA associatie en multimerisatie

Onze vorige studie op het CD1 domein alleen suggereerde dat de dimer-interface residuen FWKL (F126, W127, K180, L184) betrokken kunnen zijn bij zowel dimerisatie als RNA binding, hetzij door directe interactie met RNA of indirect door het genereren van een RNA bindend oppervlak via dimerisatie18. Inspectie van de fl rA3G dimer structuur laat zien dat, terwijl de residuen FWKLA (F126, W127, K180, L184, A187) direct deelnemen aan dimerizatie interacties (Supplementary Fig. 5A), alleen W127 toegankelijk is voor pi-stacking of waterstofbinding met een nucleïnezuur base, wat suggereert dat het W127 is die de kritieke dubbele rol heeft in dimerizatie en/of RNA binding, wat ook is gesuggereerd door eerdere mutatie studies15,18,40,48.

Lus 7 van rA3G is gelegen nabij de dimerization interface en bevat een set van hydrofobe residuen (Y124, Y125, en F126) die pack met en waarschijnlijk stabiliseren W127 (Supplementary Fig. 5B). Om te onderzoeken of dimerisatie nodig is voor RNA vereniging en ook de mogelijke dubbele rol van W127 te overwegen, ontwierpen we een set van dimer-interface mutanten van rA3G dat lus 7 ongewijzigd gelaten (Supplementary Table 3, Supplementary Fig. 5A, B). Als zodanig werden alleen begraven interface residuen buiten lus 7 gemuteerd, waardoor de mutanten rM10, rM11, en rM15 (Supplementary Table 3). Als controle hebben we ook een mutant rM9 met veranderingen op zowel lus 7 en h6 van CD1 (F126A-W127A-A187Y), die naar verwachting zal resulteren in een soortgelijk fenotype als de eerder gemelde FWKL mutant van de CD1 alleen18, dat wil zeggen verstoring van zowel dimerisatie en RNA vereniging. Een bijna wild-type rA3G (WT) met een oplosbaarheid-verhogende lusschakeling op CD1 lus 8 en de overeenkomstige katalytisch inactieve mutant (construct E/Q) werden ook opgenomen (Supplementary Table 3). De RNA associatie en oligomerisatie status van deze mutanten na recombinante expressie in E. coli werden onderzocht.

Na affiniteitskolomzuivering van de E.coli cellysaten, werd RNA associatie van sumo-rA3G fusie-eiwit geanalyseerd door denaturerende ureum-PAGE (Fig. 3a-c). Terwijl de WT en E/Q mutant (lanen 7, 8 in Fig. 3b, c) een vergelijkbare RNA associatie hadden, hadden alle dimer-interface mutanten (rM10, rM11, rM15 in lanen 2, 3, 5, respectievelijk in Fig. 3b, c) hadden sterk verminderde RNA associatie (laan 7) voor of na RNase A behandeling, met rM10 (T183D-L184D-A187Y), rM15 (I26A-K180S-L184S-A187E) en de controle mutant rM9 tonen weinig detecteerbare RNA na het doorlopen van dezelfde zuivering proces (lanen 1, 2, 5). Size exclusion chromatografie (SEC) bleek dat rM10 en rM15, evenals de controle mutant rM9, overwegend geëlueerd als een monomeer voor en na RNase A behandeling (Fig. 3d, e; Supplementary Fig. 6A, B), de bevestiging van verstoring van dimerisatie / multimerisatie. Deze resultaten suggereren dus dat onder de experimentele omstandigheden het muteren van residuen begraven binnen de interface niet alleen de dimerisatie verstoort, maar ook de RNA-associatie beïnvloedt, zelfs wanneer lus 7 onveranderd is, waarschijnlijk door het verlies van de versterkte PEP als gevolg van de dimerdisruptie (Fig. 2c, d).

Omdat we niet konden hetzelfde type biochemie assay uit te voeren om soortgelijke mutanten in de menselijke A3G (hA3G) als gevolg van de slechte oplosbaarheid te beoordelen, genereerden we een rA3G-hA3G chimera mutant (h6 chimera) waarin de rA3G CD1 h6 wordt vervangen door hA3G CD1 h6 (zie Supplementary Table 3). Deze h6 chimera gedroeg zich vergelijkbaar als rA3G WT tijdens de zuivering in termen van dimer / multimerization voor of na RNase A behandeling (Supplementary Fig. 7A, B), evenals RNA vereniging, vooral na RNase A behandeling (Supplementary Fig. 7C, D). Het is vermeldenswaard dat, zoals getoond in aanvullende Fig. 7A, B, terwijl H6 chimera eiwit ook verschoven naar dimeer (D) en monomeer (M) fracties na RNase A behandeling (SDS-PAGE gel in aanvullende Fig. 7D), zijn SEC profiel toont meer heterogene pieken dan die van rA3G WT, mogelijk omdat het chimere eiwit drie residuen (Y181, I183, I187) van hA3G die meer hydrofoob dan die in rA3G (H181, T183, A187), en dus minder stabiel/oplosbaar. Deze resultaten suggereren de mogelijkheid dat CD1 h6 uitwisselbaar kan zijn tussen rA3G en hA3G, wat leidt tot de aanwezigheid van hetzelfde PEP-gebied dat op beide eiwitten in wezen dezelfde set oppervlakresiduen heeft.

PEP-mutatie effect op RNA-associatie en multimerisatie

We onderzochten vervolgens of het versterkte PEP-oppervlak gevormd rond de dimeerverbinding (Fig. 2. Inzet b) van belang is voor RNA-associatie. Vier positieve/polaire residuen gecentreerd rond R24 werden gemuteerd om rM12 te genereren (R24T-S28A-N176A-N177D, supplementaire tabel 3). Een mutant met alleen R24T werd ook opgenomen. De RNA-associatie van rM12 was verminderd vergeleken met R24T en WT (lanen 4, 6, 7 in Fig. 3b, c), wat wijst op een rol van deze residuen binnen het PEP-gebied bij het versterken van de RNA-binding. Echter, in vergelijking met rM9 (F126A/W127A/A187Y), had rM12 nog steeds een aanzienlijke hoeveelheid RNA binding voor en na RNase A behandeling (rijstroken 1, 4 in Fig. 3b, c), mogelijk als gevolg van een gedeeltelijke verstoring van de RNA binding aan het PEP gebied, maar niet aan andere gebieden van rA3G. Onverwacht bleek uit SEC-analyse dat rM12 een belangrijke monomere piek had, zelfs vóór RNase A behandeling (Fig. 3d, e, Supplementary Fig. 6A, B), wat wijst op verstoring van dimerisatie/multimerisatie zonder directe mutatie van het dimerisatie-interface. Dit negatieve effect van PEP mutatie op RNA vereniging en dimerization/multimerization werd verder bevestigd door nog twee rA3G mutanten met PEP mutaties, rM13 en rM14 (Supplementary Table 3, Supplementary Fig. 7). Deze twee mutanten vertoonden verschillende niveaus van verstoring van RNA-associatie (Supplementary Fig. 7A) en dimerisatie/multimerisatie zelfs vóór RNase A behandeling onder de geteste conditie (SEC-profielen en gels in Supplementary Fig. 7C).

Intrigerend is dat, hoewel R24T enkele mutant en WT vergelijkbare hoeveelheden geassocieerd RNA vertoonden gedetecteerd door RNA gels in Fig. 3b, c, de gedetailleerde SDS-PAGE analyse van hun SEC piek fracties vóór RNase A behandeling bleek dat de meeste R24T eiwit verdeeld in de fracties verspreid rond de monomere piek (M) locatie (Supplementary Fig. 6A), die in tegenstelling tot de WT die meestal verdeeld in de leeg volume (V) fracties. Deze resultaten wijzen op verandering van RNA associatie en multimerisatie gedrag met een enkele R24T mutatie binnen de PEP gebied, dat consistent is met eerdere studies van R24A mutaties 14,30,38,40. Alles bij elkaar tonen deze resultaten aan dat, onder deze testomstandigheden, residuen binnen het versterkte PEP-gebied van de dimeerovergang (R24/S28/N176/N177) een belangrijke rol spelen bij het tot stand brengen van RNA-associatie, en dat RNA-associatie via deze residuen omgekeerd vereist is voor het stabiliseren van dimerisatie en daaropvolgende multimerisatie van hogere orde.

Effect van PEP/dimer mutaties op in vitro RNA/DNA binding

De fl rA3G structuren onthullen extra gebieden met positief geladen residuen buiten het versterkte PEP gebied zoals getoond in Fig. 2c. Hoewel deze positief geladen residuen buiten het PEP gebied geen belangrijke rol spelen bij het vormen van stabiele A3G-RNA complexen zoals waargenomen bij E. coli cellysaten, kunnen zij toch bijdragen tot het binden van de gedefinieerde ssRNA en ssDNA substraten. Om dit te testen werd elk gezuiverd eiwitmonster onderworpen aan een uitgebreide RNase behandeling om zoveel mogelijk gebonden RNA te verwijderen, en de bindingsaffiniteit met 50 nt ssRNA of ssDNA oligomeren werd getest met behulp van een gel shift assay. Alle mutanten vertoonden binding aan 50 nt ssRNA of ssDNA, en de geschatte dissociatieconstanten (Kd, supplementaire tabel 3) gaven aan dat de meeste mutanten een verminderde binding hadden vergeleken met WT en E/Q. Deze resultaten geven aan dat in dit gereconstrueerde systeem waar hoge concentraties eiwitten en nucleïnezuren aanwezig waren, deze verschillende rA3G dimeer-interface en PEP gebied mutanten nog steeds in staat zijn om aan RNA en ssDNA te binden via andere residuen buiten het PEP gebied bij de dimeer junctie.

Over het geheel genomen is de vermindering van binding van deze mutanten ernstiger voor ssDNA binding dan voor RNA binding. Interessant is dat de deaminase-test met de gezuiverde eiwitten van deze rA3G-mutanten (rM9-rM12 en rM15) aantoonde dat deze dimer-interface mutanten en RNA-bindende mutanten alle een verminderde deaminase-activiteit vertoonden vergeleken met WT (supplementaire figuur 8). De verminderde ssDNA-binding van deze mutanten zou, tenminste gedeeltelijk, een verklaring kunnen zijn voor de verschillende niveaus van vermindering van de deaminase-activiteit. De mate van verminderde ssDNA binding lijkt echter geen strikte correlatie te hebben met het verstoringsniveau van de deaminase activiteit. Bijvoorbeeld, rM12 vertoonde de laagste ssDNA binding (supplementaire tabel 3) maar is niet degene met de minste deaminase activiteit (supplementaire fig. 8).

Effecten van PEP/dimer-interface mutaties op HIV restrictie

De W127A mutatie op menselijk A3G (hA3G) is bekend om virion verpakking te verstoren en, bijgevolg, HIV restrictie, waarschijnlijk door afschaffing van RNA binding gemedieerd door dit residu. Echter, studies die hebben geïnduceerd verpakking van hA3G W127 mutanten door middel van een Vpr peptide fusie hebben tekortkomingen in HIV-beperking15 geïdentificeerd. Om meer inzicht te krijgen in het mechanisme van HIV-1 beperking door hA3G, hebben we extra hA3G mutanten ontworpen op basis van de rA3G structuur en mutatiegegevens. De bedoeling van deze hA3G mutaties (supplementaire tabel 4) was om de intramoleculaire CD1-CD2 interacties (M2, M3, M4) te verstoren (supplementaire fig. 9A, B), de RNA binding rond de dimeer verbinding te verstoren door toenemende aantallen polaire/geladen residuen te muteren (M12, M13, M14), of de eiwit-eiwit dimeer interacties te verstoren door toenemende aantallen begraven residuen te muteren (M6, M10, M11) (supplementaire fig. 9C). 9C).

Zoals verwacht had WT hA3G geen HIV-1 restrictie activiteit in aanwezigheid van Vif, maar beperkte HIV-1 volledig in afwezigheid van Vif, en het Vif-resistente M1 (D128K) construct beperkte HIV infectie volledig met of zonder Vif (Fig. 4a-c). Aan de andere kant, de W127A met mutant M9 (met mutaties F126A/W127A/I187Y, Supplementary Fig. 9C) bekend dat zowel RNA-binding en dimerization verstoren had geen beperking activiteit, ongeacht de aanwezigheid van Vif (Fig. 4a-c). Dit is consistent met eerdere literatuur waarin staat dat W127 belangrijk is voor HIV-beperkingsactiviteit vanwege zijn RNA-bindend vermogen dat nodig is voor hA3G virion verpakking en deamination-onafhankelijke beperking van omgekeerde transcriptie14,15. Inderdaad, hoewel de gevoeligheid voor Vif-degradatie leek te worden verminderd (Supplementary Fig. 10A), ~ 5- tot 10-voudige minder M9 mutant eiwit werd verpakt in virion in de aanwezigheid of afwezigheid van Vif in vergelijking met WT hA3G (Fig. 4a, b). Deze resultaten van WT en controle mutanten M1 en M9 van hA3G toonden volledige activiteit of gebrek aan activiteit aan in onze studie.

Voor de mutanten die zijn ontworpen om de intramoleculaire CD1-CD2-interacties te beïnvloeden, werden meerdere residuen in de buurt van of binnen de inter-domein-interface aan de CD2-zijde gemuteerd voor M2 en M3 en aan de CD1-zijde voor M4 (aanvullende fig. 9A, B). M2 en M3 hadden beide een significant lagere HIV-1-restrictieactiviteit in afwezigheid van Vif (Fig. 4c). M2 met mutaties op CD2-lussen 1 en 3 rond het raakvlak met CD1 vertoonde een volledig verlies van katalytische activiteit (fig. 4e), waarschijnlijk omdat sommige van deze gemuteerde residuen, zoals H216, belangrijk zijn voor de ssDNA-substraatinteractie49. M3 met mutaties op het CD2 raakvlak met CD1, beginnend bij de linker residuen R194/H195 (aanvullende Fig. 9A, B), had slechts ~10% WT deaminase activiteit (Fig. 4e), mogelijk door verlies van de juiste CD2 interactie met CD1 om gecoördineerde ssDNA substraat binding voor efficiënte katalytische activiteit te beïnvloeden. M4 met meerdere mutaties rond de inter-domein interface op CD1 vertoonde kenmerken die vergelijkbaar zijn met WT, wat erop wijst dat deze mutaties geen duidelijk effect hebben op het restrictievermogen. Interessant is dat deze mutatie volledige katalytische activiteit had (fig. 4e), wat wijst op een zekere plasticiteit tussen CD1-CD2-interface-interacties voor functies.

M12 en M13 werden ontworpen om alleen de RNA-binding aan het PEP-gebied op de dimeerverbinding te verstoren, en M14 bevat de meeste mutaties van M12 en M13 plus vier extra R/K-residuen (K52/K63/R69/K76) om het overblijvende enige positief geladen oppervlak op A3G-CD1 te elimineren (supplementaire fig. 9C). Verrassend genoeg toonden deze mutanten allemaal ~70% HIV-1 restrictie activiteit in afwezigheid van Vif (Fig. 4c). Hoewel het moeilijk was om Vif gevoeligheid te kwantificeren als gevolg van aanhoudend lage expressie niveau van M12, M13, en M14 in Vif-gevoeligheid assay (Supplementary Fig. 10A), alle drie mutanten, vergelijkbaar met WT, toonden geen HIV-beperking activiteit in de aanwezigheid van Vif (Fig. 4c), wat suggereert dat ze in feite nog steeds voldoende gevoelig voor Vif-gemedieerde degradatie. De reden voor slechts 70% HIV-1 beperking activiteit van M12-14 was niet te wijten aan hun lagere steady state eiwitniveaus gedetecteerd in HEK293T cellysaten (Fig. 4a, b), omdat transfectie van minder WT expressie plasmide om vergelijkbare cellulaire expressie niveaus als M12-M14 nog resulteerde in ~ 4-voudig meer HIV-1 beperking van WT (Supplementary Fig. 10B). Dit is consistent met de deamination-onafhankelijke beperking activiteit, zoals deze drie mutanten hadden verstoord deamination activiteit (Fig. 4d, e). Vooral M14 had een volledig verlies van deaminaseactiviteit (Fig. 4e). In overeenstemming hiermee was de achtergrondmutatiegraad van M14 op basis van de provirale DNA-sequencingresultaten (supplementaire tabel 5). En toch vertoonde het ~70% HIV-1 restrictie activiteit. Deze resultaten tonen duidelijk aan dat de residuen die in M12-14 gemuteerd zijn om de RNA-binding in de PEP- en nabijgelegen gebieden op CD1 te verstoren, slechts een gedeeltelijk defect vertoonden bij het beperken van HIV, wat erop wijst dat ze een bepaald niveau van virionen inkapseling en HIV-1-beperking behielden, wat in tegenstelling staat tot de rol van RNA-binding die gemedieerd wordt door mutaties die W127 in de M9-mutant bevatten en die cruciaal is voor virionen verpakking en HIV-beperking (fig. 4a-c). 4a-c).

Die mutanten die alleen de eiwit-eiwit dimeer interacties verstoren met toenemend aantal mutaties zijn van M6 tot M11 (supplementaire tabel 4, supplementaire fig. 9C). M6 en M7 vertoonden slechts een gedeeltelijk verlies van restrictieactiviteit in afwezigheid van Vif, ondanks het verlies van 95% van katalytische activiteit voor M7 als gevolg van de bijkomende drie mutaties op CD2 (Fig. 4e). Daarom zijn de mutaties in M6 en M7 niet kritisch voor HIV-restrictie. M10 vertoonde een ernstiger fenotype in HIV-1 beperking in afwezigheid van Vif, ook al behield het enige katalytische activiteit (Fig. 4e), wat suggereert dat mutaties op M10 belangrijk zijn voor virion verpakking en HIV-restrictie. M11 is vergelijkbaar met M10 in deaminase activiteit, maar met een minder ernstig fenotype in termen van restrictie activiteit en integratie (Fig. 4c, d). Het is mogelijk dat M11 meer RNA-bindend vermogen behield dan M10 (uit rM10-11 van rA3G mutant analyse, Fig. 3a-e), wat resulteert in een minder ernstig fenotype. Alles bij elkaar laten deze resultaten zien dat door het muteren van residuen binnen het begraven eiwit-eiwit-dimer grensvlak alleen de HIV-restrictie activiteit nog steeds op een gereduceerd niveau gehandhaafd blijft (Fig. 4c), en de verstoring van de deaminase activiteit van deze mutanten (Fig. 4e) kan gedeeltelijk verantwoordelijk zijn voor de vermindering van de HIV-restrictie activiteit. Dit staat weer in contrast met de M9-mutant die geen HIV-beperkingsactiviteit vertoonde (Fig. 4a-c).