Verbetering van L-Arabinose Fermentatie door Modificatie van de Metabole Route en Transport in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

De L-arabinose benuttingsroute werd tot stand gebracht in Saccharomyces cerevisiae, door expressie van de codon-geoptimaliseerde araA, araB, en araD genen van Lactobacillus plantarum. Na overexpressie van de TAL1-, TKL1-, RPE1-, RKI1- en GAL2-genen en adaptieve evolutie werd de L-arabinosebenutting van de recombinante stam efficiënt. De resulterende stam vertoonde een maximale specifieke groeisnelheid van 0,075 h-1, een maximale specifieke L-arabinoseconsumptiesnelheid van 0,61 g h-1 g-1 droog celgewicht, en een veelbelovende ethanolopbrengst van 0,43 g-1 uit L-arabinosefermentatie.

1. Inleiding

Om de afhankelijkheid van fossiele brandstoffen te verminderen, werd de wereldwijde productie van bio-ethanol verhoogd van ~45 miljoen liter in 2005 tot ~113 miljard liter in 2012 . De toekomstige grootschalige productie van brandstof-ethanol zal hoogstwaarschijnlijk gebaseerd zijn op overvloedig lignocellulosehoudend materiaal in plaats van suiker en graan, die voedsel zijn voor mens en dier . Voor een kosteneffectieve productie van motorbrandstof-ethanol uit lignocellulose is een volledige benutting van de grondstoffen vereist. Een van de doelstellingen van de bio-ethanolproductie is het fermentatiemicro-organisme de capaciteit te geven om alle suikers in lignocellulosehoudende materialen om te zetten. Ongeveer 3-15% L-arabinosecomponent kan worden teruggewonnen uit lignocellulosehoudende materialen . Het is daarom noodzakelijk om een L-arabinose fermenterend micro-organisme te construeren om het gebruik van deze suiker te verhogen .

Twee soorten L-arabinose metabolische routes bestaan in schimmels en bacteriën. De aldose reductase (AR), L-arabitol-4-dehydrogenase (LAD), L-xylulose reductase (LXR), en D-xylitol dehydrogenase (XDH) vormen de fungale L-arabinose metabolische route. De door AR en LXR gekatalyseerde reactie is gekoppeld aan de oxidatie van NADPH tot NADP+, en het LAD en XDH gebruiken NAD+ als cofactor. De geproduceerde xylulose wordt gefosforyleerd en komt in de pentosefosfaatroute (PPP) terecht. De bacteriële L-arabinose metabolische route is cofactor onafhankelijk en bestaat uit L-arabinose isomerase (AraA), L-ribulokinase (AraB), en L-ribulose-5-fosfaat 4-epimerase (AraD). Het geproduceerde D-xylulose-5-fosfaat komt in de PPP terecht. Beide L-arabinose metabolische routes werden tot stand gebracht in Saccharomyces cerevisiae, het traditionele ethanol producerende micro-organisme met een uitstekende suikervergistingscapaciteit en tolerantie voor het ruwe milieu, maar het kan geen L-arabinose vergisten. Het is dan ook geen verrassing dat er een redoxonevenwichtigheid optreedt in de recombinante S. cerevisiae-stam die de fungale L-arabinose-metabolische route bevat. De opbrengst van het bijproduct L-arabitol was maar liefst 0,48 g-1 van de pentose suiker die werd verbruikt in de D-xylose en L-arabinose cofermentatie, hoewel de stam die NADH tot expressie bracht de voorkeur gaf aan AR en LXR om de redox onbalans te verminderen .

Vergeleken met de fungale L-arabinose metabolische route, is de bacteriële route eenvoudiger en cofactor onafhankelijk. Vanwege het ontbreken van effectieve activiteitstesten voor enzymen die betrokken zijn bij de bacteriële L-arabinose metabolische route, was de optimalisatie van deze route in S. cerevisiae echter niet eenvoudig. De S. cerevisiae-stam die de araA-, araB- en araD-genen van Escherichia coli tot expressie bracht, kon L-arabinose niet gebruiken. Nadat het L-arabinose-isomerasegen van E. coli echter was vervangen door het araA-gen dat was gekloond van Bacillus subtilis, kon de stam groeien en ethanol produceren op L-arabinose na verschillende cirkels van adaptieve groei. Bovendien werd het gebruik van L-arabinose verder verbeterd door het codongebruik van de bacteriële araA-, araB- en araD-genen te wijzigen in de voorkeurscodons van gist. De L-arabinose metabolische genen van Lactobacillus plantarum kwamen beter overeen met het codongebruik van S. cerevisiae dan de eerder gerapporteerde genen. Wisselink et al. introduceerden meerdere kopieën van araA en araD en een enkele kopie van araB van L. plantarum in S. cerevisiae. Na overexpressie van de genen die coderen voor de enzymen van niet-oxidatieve PPP en uitgebreide adaptieve evolutie, vertoonde de resulterende stam een hoge ethanolopbrengst tot 0,43 g-1 tijdens anaërobe groei op L-arabinose, met een hoge arabinoseconsumptiesnelheid (0,70 g h-1 g-1 droog celgewicht (DCW)). Het metaboloom, transcriptoom, en metabolische flux analyse van een meer geëvolueerde stam toonde aan dat hogere expressieniveaus van de galactose transporter, transketolase, en transaldolase isoenzymen de groei van S. cerevisiae op L-arabinose ten goede komen.

In het huidige werk, werden de unieke codon-geoptimaliseerde araA, araB, en araD genen van L. plantarum tot expressie gebracht in de S. cerevisiae stam CEN.PK102-3A op verschillende niveaus. Vervolgens werden de genen TAL1, TKL1, RPE1 en RKI1, die betrokken zijn bij PPP, in deze recombinante stam overgeëxpresseerd. De resulterende stam werd achtereenvolgens geselecteerd op L-arabinose onder aerobe omstandigheden en in zuurstofgelimiteerde omstandigheden. Er werd een stam verkregen met een aanzienlijk verhoogde capaciteit voor het gebruik van L-arabinose. De L-arabinose metabolische capaciteit van de geëvolueerde stammen en de stam die ook het transportergen GAL2 tot overexpressie bracht, werd onderzocht. De factoren die de efficiëntie van het L-arabinose metabolisme beïnvloeden, werden besproken.

2. Materialen en methodes

2.1. Media en kweekomstandigheden

Het synthetisch compleet gistmedium (SC) met 1,7 g L-1 giststikstofbasis (YNB, Sangon, China) en 5 g L-1 ammoniumsulfaat (Sangon, China), met extra koolstofbronnen van glucose (Sangon, China) of L-arabinose (Sinopharm, China), werd gebruikt voor de gistkweek. Het volledige supplementmengsel, 0,77 g L-1 CSM-URA of 0,67 g L-1 CSM-LEU-URA (MP Biomedicals, Solon, OH), werd toegevoegd om de vereiste plasmiden te behouden met auxotrofe selectie wanneer nodig. Voor stammen met de KanMX4-marker werd het medium voorzien van 200 g mL-1 van het antibioticum G418 sulfaat (Promega, Madison, WI, USA). Alle gisten werden gekweekt bij 30°C.

2.2. Codon Adaptation Index Analysis

De codon adaptation index (CAI) wordt gebruikt om de voorkeur van codongebruik in specifieke soorten te illustreren. Voor de CAI-analyse is CODONW (http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/MobylePortal/portal.py?form=codonw) gebruikt.

2.3. 2.3. Plasmide- en stamconstructie

E. coli DH5 werd gebruikt voor subklonering. De stammen en plasmiden van S. cerevisiae die in deze studie werden gebruikt, staan vermeld in tabel 1. De in deze studie gebruikte primers zijn vermeld in tabel 2.

De unieke codon-geoptimaliseerde araA-, araB-, en araD-genen die coderen voor L-arabinose-isomerase (GenBank: CCC80517.1), L-ribulokinase (GenBank: CCC80519.1), en L-ribulose-5-fosfaat 4-epimerase (GenBank: CCC80518.1) van L. Plantarum werden kunstmatig gesynthetiseerd en geligeerd tussen de HXT7-promotor en PGK1-terminatorsequenties van plasmide pHX, dat werd geconstrueerd door vervanging van de PGK1p van plasmide YEp24-PGKp door HXT7p, dat sites bevat voor de restrictie-enzymen Kpn I en Sma I. Het HXT7p-araD-PGK1t fragment werd geamplificeerd door PCR met terminale sites voor de restrictie-enzymen Hind III en Bln I en vervolgens ingebracht in de Hind III en Nhe I sites van YIp5, wat resulteerde in plasmide YIp5-araD. Het HXT7p-araA-PGK1t fragment met terminale Bgl II en Sal I sites werd ingebracht in de BamH I en Sal I sites van YIp5-araD, wat resulteerde in het plasmide YIp5-araAD. Het HXT7p-araB-PGK1t fragment met Eag I en Stu I sites werd ingevoegd in de Eag I en Stu I sites van YIp5-araAD, wat resulteerde in het plasmide YIp5-ara (figuur 1 (a)). Het TEF1-promoterfragment (met eindpunten voor Hind III en Sal I) en het PGK1-terminatorfragment (met eindpunten voor BamH I en Hind III) werden gekloond uit de plasmiden pJFE3 en pYMIKP , respectievelijk. Deze twee fragmenten werden geligeerd en in het plasmide pYX242 ingevoegd om een vector, pYX242-WS, te construeren met twee sites die kunnen worden gebruikt om genen tot expressie te brengen. Vervolgens werd het gen araA tussen de Sal I- en Sac I-locaties van deze vector ingevoegd onder controle van de TEF1-promotor en de PloyA-terminator voor de expressie ervan, en de resulterende plasmide kreeg de naam pYX2422-TEF1araA (figuur 1(b)). Het plasmide pYX2422-HXT7araA (figuur 1(b)) werd geconstrueerd met gebruikmaking van het fragment van HXT7p om het TEF1p-fragment van plasmide pYX2422-TEF1araA te verdringen; de verbindingen waren BamH I en Sal I-herkenningssequenties. Het gen GAL2 werd gekloond uit het chromosomale DNA van CEN.PK102-3A en vervolgens ingebracht in de Xba I- en Sal I-plaatsen van plasmide pJFE3, wat resulteerde in plasmide pJFE3-GAL2. Het URA3-fragment van plasmide pJFE3-GAL2 tussen de Nde I- en Apa I-sites werd vervangen door het KanMX4-gen gekloond uit pUG6, wat resulteerde in plasmide pJFE318-GAL2 (figuur 1(c)).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figuur 1

De fysische kaarten van de plasmiden (a) YIp5-ara, (b) pYX2422-TEF1araA/HXT7araA, en (c) pJFE318-GAL2.

De transformatie van gist werd uitgevoerd met behulp van de lithiumacetaat transformatiemethode . Het plasmide YIp5-ara werd gelineariseerd op de Stu I-locatie en vervolgens getransformeerd in CEN.PK102-3A. De transformanten met de araA-, araB- en araD-genen geïntegreerd in het chromosomale URA3-gen werden geselecteerd in SC-medium met CSM-URA, en na bevestiging door sequencing werd de gewenste transformant BSW1A1 genoemd. De plasmiden pYX242, pYX2422-HXT7araA en pYX2422-TEF1araA werden getransformeerd in BSW1A1, wat resulteerde in respectievelijk BSW1AY, BSW1A7 en BSW1AT. Het gelineariseerde pJPPP3, dat de expressieframes van de genen TAL1, TKL1, RPE1 en RKI1 bevat, werd geïntegreerd in het chromosoom van BSW1AT op de genlocus GRE3, wat stam BSW2AP opleverde. De stam BSW2AP werd aangepast aan 20 g L-1 L-arabinose onder aërobe omstandigheden en vervolgens onder zuurstofgelimiteerde omstandigheden. Zodra de stationaire fase was bereikt, werd een nieuwe batch gestart door de cultuur over te brengen in vers medium met een initiële biomassa van 0,15 g DCW L-1. Toen de verdubbelingstijd van de stam gestabiliseerd was, werd uit de aangepaste mutanten de mutant BSW3AP geselecteerd op basis van zijn uitstekende groei op L-arabinose. Het plasmide pJFE318-GAL2 werd vervolgens in stam BSW3AP getransformeerd, wat stam BSW3AG.

2.4 opleverde. Real-Time Quantitative PCR

De cellen werden gekweekt in SC-medium dat 20 g L-1 glucose bevatte en verzameld wanneer de OD600 van de culturen 1 bereikte. Het totale RNA werd geëxtraheerd met TRIzol-reagens (Sangon, China). De eerste streng van cDNA werd omgekeerd getranscribeerd van 1 g totaal RNA met behulp van PrimeScript RT-reagens kits met gDNA Eraser (Takara, Japan). Verdunde cDNA-producten werden gebruikt voor real-time kwantitatieve PCR met behulp van de SYBR Green Real-time PCR Master Mix (TOYOBO, Japan) en het LightCycle PCR System (Roche Molecular Biochemicals, Duitsland). Het actine-coderende gen ACT1 werd gebruikt als referentiegen voor normalisatie. De gegevens van real-time PCR werden berekend volgens de methode . De primers voor deze PCR werden vermeld in tabel 2.

2.5. Fermentatie

Een enkele kolonie werd ’s nachts gekweekt in SC medium dat 20 g L-1 glucose bevatte. Een monster van de nachtkweek werd verdund tot een initiële OD600 van 0,5 in SC-medium dat 10 g L-1 glucose en 10 g L-1 L-arabinose bevatte. Na een kweek van 10 uur werden de cellen verzameld en gebruikt voor de fermentatie. Alle schudkolffermentaties werden uitgevoerd bij 30°C, 200 omw/min-1, in schudkolven van 200 mL met 40 mL medium. De zuurstofgelimiteerde toestand werd gehandhaafd met behulp van een rubberen stop. De batchfermentaties onder anaerobe omstandigheden werden uitgevoerd in fermentoren van 1,4 l (Infors AG, Zwitserland) met een werkvolume van 900 mL. De anaerobe omstandigheden werden gehandhaafd door te spoelen met stikstof (0,1 L min-1); de roersnelheid bedroeg 500 omw/min-1. De pH werd op 5,0 gehouden door het automatisch pompen van 1 mol L-1 NaOH en 1 mol L-1 H3PO4 . De aanvankelijke biomassa bedroeg 0,2 g DCW L-1. De koolstofbron in het SC plus CSM-LEU-URA-medium was 20 g L-1 L-arabinose; bij de fermentatie van stam BSW3AG werd 200 g mL-1 G418 toegediend. Het droog celgewicht van de geëvolueerde stammen en de niet-geëvolueerde stammen werd berekend volgens de formule droog gewicht (mg mL-1) = 0,266 × OD600 – 0,0762 en droog gewicht (mg mL-1) = 0,2365 × OD600 + 0,1149, respectievelijk.

2.6. Analyse van fermentatieproducten

De hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) Prominence LC-20A (Shimadzu, Japan) uitgerust met de brekingsindexdetector RID-10A (Shimadzu, Japan) werd gebruikt om de concentraties van suikers en metabolieten te bepalen. De Aminex HPX-87P ionenwisselingskolom (Bio-Rad, USA) werd gebruikt voor de analyse van L-arabinose, arabitol en ethanol bij 80°C met een mobiele fase van water bij een stroomsnelheid van 0,6 ml min-1. De Aminex HPX-87H ionenwisselingskolom (Bio-Rad, Hercules, USA) werd gebruikt voor de analyse van glycerol en acetaat bij 45°C met 5 mmol L-1 H2SO4 als mobiele fase.

3. Resultaten

3.1. Expressie van de codon-geoptimaliseerde genen betrokken bij de L-arabinose-route in S. cerevisiae

Gebaseerd op de aminozuursequentie van L-arabinose-isomerase (GenBank-toetredingsnr. CCC80517.1), L-ribulokinase (GenBank-toetredingsnr. CCC80519.1), en L-ribulose-5-fosfaat 4-epimerase (GenBank toetredingsnr. CCC80518.1), opgenomen in het National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), werden de araA-, araB-, en araD-genen van L. plantarum kunstmatig gesynthetiseerd met behulp van voorkeurscodons van S. cerevisiae. De CAI’s van de codon-geoptimaliseerde araA, araB, en araD waren respectievelijk 0.599, 0.580, en 0.646, die hoger waren dan die van de oorspronkelijke sequenties (0.324, 0.223, en 0.243, resp.).

De expressiecassettes van codon-geoptimaliseerde araA, araB, en araD werden geïntegreerd in het chromosoom van stam CEN.PK102-3A, resulterend in stam BSW1A1. BSW1A1 kon echter niet groeien op L-arabinose, hoewel de getranscribeerde mRNA’s van deze genen allemaal aantoonbaar waren. Vervolgens werden meer kopieën van araA ingebracht in BSW1A1, gedragen door het episomale plasmide pYX242 en tot expressie gebracht onder controle van de HXT7- en TEF1-promoters. De transcriptionele niveaus van araA in de resulterende stammen, BSW1A7 en BSW1AT, waren -vaak en -vaak hoger dan in de referentiestam BSW1AY die alleen de geïntegreerde, tot expressie gebrachte araA droeg. De BSW1A7- en BSW1AT-stammen werden aeroob geïncubeerd op L-arabinose, en de groei van stam BSW1AT werd waargenomen na ~150 h, terwijl BSW1A7 niet kon groeien, zelfs niet wanneer langer gekweekt.

3.2. Verbetering van het L-Arabinose Gebruik in S. cerevisiae door Engineering en Evolutie

De TAL1, TKL1, RPE1, en RKI1 genen betrokken bij de niet-oxidatieve pentose fosfaat route werden overgeëxpresseerd in een enkele kolonie geïsoleerd uit de BSW1AT 150 h kweek door integratie van het gelineariseerde plasmide pJPPP3 in het chromosoom. De resulterende stam, BSW2AP, werd geëvolueerd op L-arabinose. Na 9 overdrachten in aërobe omstandigheden en 12 overdrachten in zuurstofgelimiteerde omstandigheden daalde de verdubbelingstijd van de cultuur van 22 uur tot 4,5 uur. De mutanten werden gescreend op L-arabinoseplaten, en een grote kolonie werd geselecteerd en BSW3AP genoemd.

De transcriptionele niveaus van genen in de recombinante stammen BSW1AT, BSW2AP, en BSW3AP werden bepaald door real-time kwantitatieve PCR (figuur 2). Het expressieniveau van araA in BSW2AP was twee keer zo hoog als in BSW1AT, terwijl de expressieniveaus van araB en araD in BSW2AP lager waren. Deze veranderingen kunnen het gevolg zijn van mutaties die zijn opgetreden tijdens de teelt van BSW1AT op L-arabinose. In de geëvolueerde stam BSW3AP kwamen alle drie de genen op hoge niveaus tot expressie. De expressieniveaus van araA, araB en araD in BSW3AP waren respectievelijk 4,1 maal, 1,6 maal en 2,5 maal hoger dan die in stam BSW1AT.

Figuur 2

De expressie van araA (zwarte balken), araB (grijze balken), en araD (blanco balken) van de stammen BSW2AP en BSW3AP vergeleken met de stam BSW1AT. De vouwveranderingen van de mRNA-niveaus van deze genen zijn genormaliseerd naar de expressie van ACT1. De geteste stammen werden gekweekt op 20 g L-1 glucose. De vermelde waarden zijn verkregen uit drie onafhankelijke metingen.

Het L-arabinosegebruik van de stammen BSW1AT, BSW2AP, en BSW3AP werd vergeleken in schudbekers onder zuurstofgelimiteerde omstandigheden (Figuur 3); de aanvankelijke OD600 was 0,5. Binnen 120 uur werd geen groei van BSW1AT waargenomen. De stam BSW2AP groeide op L-arabinose met een maximale specifieke groeisnelheid () van 0,011 h-1; 4,4 g L-1 L-arabinose werd verbruikt, en 1,2 g L-1 ethanol werd geproduceerd in 120 uur fermentatie. Bij de geëvolueerde stam BSW3AP nam de ethanolproductie daarentegen toe tot 0,23 h-1. Na 120 uur fermentatie was 18,6 g L-1 L-arabinose verbruikt met een maximale specifieke verbruikssnelheid van 0,7 g h-1 g-1 DCW; 6,9 g L-1 ethanol was geproduceerd, en de ethanolopbrengst was 0,43 g-1; slechts 0,13 g L-1 L-arabitol was geaccumuleerd.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figuur 3

De L-arabinosefermentatie van stammen in schudkolven. Groeivermogen (a), L-arabinoseverbruik (b), arabitolvorming (c), en ethanolvorming (d) door BSW1AT (▲), BSW2AP (■), en BSW3AP (). De stammen werden gekweekt in 40 ml SC-medium met 20 g L-1 L-arabinose bij 30 °C, 200 omw/min-1 met een OD600 van 0,5 in het begin. De gegevens zijn de gemiddelden van drie onafhankelijke experimenten.

3.3. Overexpressie van GAL2 verbeterde de L-arabinose anaërobe fermentatie van de geëvolueerde stam

Het galactose permease gen GAL2 werd overgeëxpresseerd in BSW3AP, wat resulteerde in stam BSW3AG. De anaerobe L-arabinosefermentatie-eigenschappen van stam BSW3AP en BSW3AG werden bestudeerd (Figuur 4 en Tabel 3) in bioreactoren. De stam BSW3AP groeide op L-arabinose met een maximale specifieke groeisnelheid van 0,067 h-1. De maximale specifieke verbruikssnelheid van L-arabinose was 0,49 g h-1 g-1 DCW. Ethanol werd geproduceerd met een maximale specifieke snelheid van 0,20 g h-1 g-1 DCW met een opbrengst van 0,42 g-1. De overexpressie van GAL2 verbeterde de L-arabinose fermentatiecapaciteit aanzienlijk. De maximale specifieke groeisnelheid van BSW3AG bedroeg 0,075 h-1, wat 12% sneller was dan die van BSW3AP. De specifieke L-arabinoseconsumptie van BSW3AG bedroeg 0,61 g h-1 g-1 DCW, wat 24% sneller was dan die van BSW3AP. De ethanolproductiesnelheid was 0,27 g h-1 g-1 DCW, en de ethanolopbrengst was 0,43 g-1. Bovendien produceerden zowel BSW3AP als BSW3AG kleine hoeveelheden glycerol (1,4 g L-1 voor beide stammen) en bijna niet detecteerbare hoeveelheden arabitol en acetaat.

(a)

(b)

(a)
(b)

4. Discussie

De volledige omzetting van suikers is belangrijk voor een efficiënte en kosteneffectieve productie van brandstof-ethanol uit lignocellulosehoudende materialen. Zelfs kleine verbeteringen in het gebruik van substraten kunnen de kosten van het hele proces aanzienlijk verlagen. L-arabinose is een belangrijk bestanddeel van lignocellulosehoudende materialen. Expressie van de L-arabinose pathway van L. plantarum is doeltreffend gebleken bij de constructie van L-arabinose gebruikmakend van S. cerevisiae . Aangezien de codon-geoptimaliseerde genen zouden kunnen leiden tot een verhoogde expressie van de eiwitten, werden in dit werk de originele araA-, araB- en araD-genen van L. plantarum gewijzigd om overeen te stemmen met het codongebruik van S. cerevisiae en vervolgens geïntegreerd in het chromosoom van stam CEN.PK102-3A. Deze recombinante stam kon echter niet groeien op L-arabinose. Vervolgens werden meer kopieën van het araA-gen in de recombinantstam geïntroduceerd onder controle van de HXT7- en TEF1-promotors. Wanneer de twee resulterende stammen op L-arabinose werden gekweekt, werd groei alleen waargenomen in culturen van de stam die araA tot expressie bracht onder controle van de TEF1-promotor, waarin het araA-transcriptieniveau 1,4 maal hoger was dan in de stam die araA tot expressie bracht onder controle van de HXT7-promotor. Wij suggereren dat alleen wanneer het transcriptieniveau van araA hoger is dan een bepaald niveau, groei op L-arabinose kan optreden. Daarentegen werd slechts één kopie van araB en araD in deze recombinante stam ingebracht, en de transcriptieniveaus van deze genen waren lager dan in de ouderlijke stam. Deze verschijnselen wezen erop dat araB en araD minder belangrijk waren voor de groei op L-arabinose, omdat slechts één kopie van deze genen de recombinante stam in staat stelde op L-arabinose te groeien.

Adaptieve evolutie bleek een krachtige methode te zijn om de metabole efficiëntie van de stammen te verbeteren. In de huidige studie vertoont de geëvolueerde stam BSW3AP een aanzienlijk verbeterde L-arabinose metaboliserende capaciteit. De verhoogde transcriptieniveaus van de drie genen (araA, araB, en araD) zouden kunnen bijdragen tot de verbetering. In vergelijking met araA en araD was het expressieniveau van araB lager. Becker en Boles meldden dat een mutant op L-arabinose de door araB tot expressie gebrachte L-ribulokinase-activiteit verminderde. De relatief lagere expressie van araB vermijdt de overconsumptie van ATP, hetgeen de groei van de stam op L-arabinose ten goede zou komen.

L-arabinose is een nieuwe koolstofbron voor S. cerevisiae. De opname van L-arabinose in S. cerevisiae hangt voornamelijk af van het niet-specifieke transport door de hexose-transporter Gal2p. De Hxt9p en Hxt10p kunnen ook L-arabinose transporteren, maar de efficiëntie is zeer laag. Er werd gerapporteerd dat overexpressie van GAL2 het L-arabinose gebruik verbetert. In deze studie bleek dat overexpressie van GAL2 de groeisnelheid en het L-arabinoseverbruik van onze geëvolueerde stam BSW3AP aanzienlijk verhoogde. Dit resultaat suggereert dat de theoretische L-arabinose metabolische flux hoger was dan we in BSW3AP hebben waargenomen. Het L-arabinosegebruik van BSW3AP werd beperkt door zijn absorptiesnelheid. Wanneer GAL2 werd overgeëxpresseerd, leidden meer Gal2p in het plasmamembraan tot een verhoogde L-arabinose-opname en vervolgens tot een bevordering van het L-arabinosegebruik. Ons resultaat bevestigde verder het belang van transporters voor L-arabinose gebruik; de affiniteit van Gal2p voor L-arabinose is echter laag, en glucose remde competitief de binding aan L-arabinose. Verbetering van de efficiëntie van de L-arabinose specifieke transporter moet nog worden uitgevoerd.

5. Conclusies

Met meerdere stappen van genetische manipulatie en adaptieve evolutie, verkregen we de stam BSW3AG, die groeit op L-arabinose met een a van 0,075 h-1. De maximale specifieke L-arabinoseconsumptiesnelheid is 0,27 g h-1 g-1 DCW, en de maximale ethanolopbrengst is 0,43 g-1 verbruikte L-arabinose, wat 84,3% van de theoretische hoeveelheid is. Een hoog expressieniveau van araA is met name belangrijk voor het tot stand brengen van een efficiënte L-arabinose route in S. cerevisiae, en efficiëntere transporters zijn nodig om de L-arabinose absorptiecapaciteit van de geëvolueerde stammen te verbeteren.

Belangenconflict

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflict hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door het National Key Basic Research Program (2011CB707405), het National High-Technology Research and Development Program van China onder Grant (2012AA022106), de National Natural Science Foundation van China (30970091, 31070096, en 31270151), en het International S&T Cooperation Program van China (2010DFA32560). De auteurs danken Dr. Peter Kötter van de Johann Wolfgang Goethe-Universiteit Frankfurt voor de stam CEN.PK102-3A.