Vergelijkende studie van het effect van baicalin en zijn natuurlijke analogen op neuronen met zuurstof- en glucosedeprivatie waarbij de aangeboren immuunreactie van TLR2/TNF𝛼

Abstract

Dit werk is om baicalin en zijn drie analogen te bestuderen, baicalin, wogonoside, en wogonin, op het beschermende effect van neuron van zuurstof-glucose deprivatie (OGD) en toll-like receptor 2 (TLR2) expressie in OGD schade. De resultaten toonden aan dat baicalin en zijn drie analogen neuronen beschermden tegen OGD schade en het eiwitniveau van TLR2 naar beneden reguleerden. D-Glucopyranosiduronzuur op plaats 7 in de structuur speelde een centrale rol in de cytotoxiciteit van deze flavonoïde analogen. De methoxylgroep op koolstof 8 van de structuur had de relatie met TLR2-eiwitexpressie, evenals de anti-inflammatie. Bovendien detecteerden we caspase3 en antioxidatievermogen, om het effect van vier analogen op celapoptose en totale antioxidatievermogen in OGD model te onderzoeken.

1. Inleiding

Scutellariae radix, een Chinees geneesmiddel, heeft verschillende farmacologische effecten zoals antibacteriële, antivirus, anti-inflammatie, antioxidatie, en antistroke in de kliniek . Het actieve ingrediënt is een soort flavonen, bestaande uit baicalin, baicalein, wogonin, en wogoniside kort (figuur 1) . Het is gemeld dat Scutellariae radix neuronen beschermt tegen de schade van ischemie en reperfusie . Baicalin, de belangrijkste component van de flavonen, werd bevestigd met de neuroprotectie van de schade door ischemie en reperfusie en de werking op het centrale zenuwstelsel . Onlangs werd baicaleïne bestudeerd met een veelbelovend effect van neuroactie op meerdere plaatsen. Nochtans, presenteerde geen rapport het effect van baicalin en TLR2 uitdrukking op neuronen. Een paar onderzoeken meldden dat wogonin en wogonoside op de neuronen werkten. Baicalin en baicalein werden bestudeerd als antioxidant; in een paar modellen was baicalein zelfs sterker dan baicalin in het verminderen van verschillende vrije redialen . Bij vergelijking bleek dat baicaleïne en baicaline de cellulaire schade veroorzaakt door waterstofperoxide aanzienlijk verminderden, maar dat wogonine en wogonoside een zwakkere werking hadden. Er wordt gesuggereerd dat er andere mechanismen van wogonin en wogonoside op neuroprotection.

Figuur 1

Chemische structuren van baicalin en zijn natuurlijke analogen, baicalein, wogonoside, en wogonin.

Nadat de ontstekingsremmende werking van baicalin en baicalein werd bevestigd, werden de onderzoeken naar de aangeboren immuunrespons bestudeerd bij cerebrale ischemie reperfusie en werd gedeeltelijk de reden gegeven waarom de ontstekingsremmende werking van baicalin en baicalein een van de belangrijkste tests was voor de bescherming van de hersenen tegen ischemie reperfusieschade. Verscheidene receptoren werden aangewezen als de belangrijkste doelwitten van ischemische reperfusieschade in de glia, zoals toll like receptoren (TLR’s) en de NOD’s (nucleotide-bindend oligomerisatiedomein) . Ons voorafgaand experiment toonde aan dat baicalin de expressie van NOD2 en TNFα in neuronen met ischemie en reperfusieschade in vivo en in vitro verminderde. Wogonoside werd gerapporteerd met remming van lipopolysaccharide-geïnduceerde angiogenese via toll-like receptor 4 (TLR4) signaaltransductie . Echter, TLR2 is niet onderzocht door baicalin en zijn natuurlijke analogen.

Op basis van de eerder genoemde informatie, onderzochten we het regulatie gedrag van baicalin en zijn analogen door een soort neuron cel PC12 om de mogelijke doelen van baicalin en zijn analogen in aangeboren immuunreacties tijdens de zuurstof en glucose deprivatie (OGD) en de relaties tussen de chemische structuur en het effect onder baicalin en zijn natuurlijke analogen te verkennen. Aangezien TLR2 één van de eerste receptoren is in de aangeboren immuniteit en de ontstekingsactivatie, evenals TNFα, geremd kan worden door baicalin in longcellen, werd de eiwitexpressie van TLR2 en TNFα getest om de rol van baicalin en zijn analogen in deze zenuwschademodellen uit te zoeken. Ondertussen, is caspase3 een bekende index van apoptose, en verscheidene studies meldden dat een paar flavonen apoptose van ontstekingscellen konden induceren, zodat wij de uitdrukking van caspase3-eiwit opspoorden. Bovendien, werd het effect van de vier analogen op het totale anti-oxyderende vermogen van cellen in OGD model ook ontdekt in dit document, dat verder de volledige bekwaamheid van deze flavonen vergeleek.

2. Materialen en Methoden

2.1. Chemische stoffen en materialen

Baicalin (zuiverheid was 98%) werd geleverd door Dr. Lujun Zhang, Laboratorium voor Farmaceutische Wetenschappen, Tsinghua University. Wogonoside (zuiverheid was 98%) werd gepresenteerd door Dr. Xiuwei Yang, School of Pharmaceutical Science, Peking universiteit. Baicaleïne en wogonine, alle met een zuiverheid van 98% (chargenummer 111595-200604 en 111514-200403), werden aangekocht bij het China National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products. Tijdens het gehele experiment werd gedeïoniseerd water gebruikt. Andere organische oplosmiddelen en reagentia waren van analytisch-agentkwaliteit. PBS-buffer met pH7,4 werd in ons laboratorium bereid. PC12-cellen werden geleverd door de celbank van het Institute of Fundamental Medicine, Chinese Academy of Medical Science (Beijing, China). Fetaal runderserum (FBS) en RPMI 1640 medium werden aangekocht bij GIBCO. Anti-TLR2/TNFα/caspase3/β-actine antilichamen werden aangekocht bij Santa Cruz Company (USA). Het secundaire antilichaam werd aangekocht bij Zhongshan Company (Beijing, China). De totale anti-oxidatie vermogen (T-AOC) detectie kit werd gekocht bij Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China).

2.2. Cell Culture

PC12 cellen werden aangepast tot ongeveer 1 × 106 cellen / ml met 2 mL inoculeren in elk putje van 6-well platen (Costar) in RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 5% paardenserum en penicilline / streptomycine (100 U / ml elk). De cellen werden gekweekt in een bevochtigde incubator (5% CO2) (Sanyo, Japan) bij 37°C en mochten gedurende ten minste 48 uur aanhechten.

2.3. Cytotoxicity Assays In Vitro

De veilige doseringen van baicalin en zijn drie analogen aan de cellen werden geëvalueerd door MTT (methylthiazol tetrazolium) assay in vitro. Na 24 uur celincubatie in 96-wells platen, werden baicalin en zijn analogen toegevoegd met doseringen van 10 mg/mL tot 0,001 mg/mL. 24 uur na de toevoeging van de verbindingen werd het kweekmedium in 96-wells-platen gedurende 4 uur geïncubeerd met MTT (5 mg/mL, 200 μl per well) bij 37°C. Vervolgens werd het medium zorgvuldig opgezogen en werd per well 200 μl dimethylsulfoxide (DMSO) toegevoegd om de blauwe formazanproducten op te lossen. De absorptie bij 490 nm werd gemeten met een microtiterplaatlezer (Model 550, Bio-Rad, USA). De resultaten van de extinctie van de testputjes werden uitgedrukt als levende cellen. De 50% cytotoxiciteitsconcentratie (CC50) werd berekend. Cellen voor zuurstof-glucose deprivatie

Voor de zuurstof-glucose deprivatie (OGD) vervingen we het groeimedium door glucosevrij kweekmedium (2 ml per well) en plaatsten we de platen in een incubator (YCP-30Q, Changsha, China) vol 95% N2/5% CO2 bij 37°C gedurende 120 min. Daarna werden de cellen teruggebracht naar het normale voedingsmedium en geïncubeerd onder normale omstandigheden bij 37°C (Sanyo, Japan) gedurende de specifieke tijd voor latere experimenten. Controle celculturen niet beroofd van zuurstof en glucose werden geïncubeerd onder normale omstandigheden in het medium met glucose.

Voor beschermend effect van de verbindingen tegen OGD schade, werd de cel leven assay uitgevoerd zoals eerder beschreven. Na 24 uur incubatie van de cellen in 96-wells platen, werden baicalin en zijn analogen toegevoegd met doseringen van 10 mg/mL tot 0,001 mg/mL. 24 uur na het toevoegen van de verbindingen werd het kweekmedium in 96-wells platen geïncubeerd met MTT (5 mg/mL, 200 μL per well) bij 37°C gedurende 4 uur. Het medium werd zorgvuldig opgezogen en 200 μL DMSO per well werd toegevoegd om de blauwe formazanproducten op te lossen. De waarden van de absorptie bij 490 nm werden gemeten met een microtiterplaatlezer. De resultaten van de absorptie van de testputjes werden uitgedrukt als levende cellen. De 50% effectieve concentratie (EC50) werd berekend. Gecombineerd met de cytotoxiciteit (CC50) van de verbindingen, werden de veiligheidsindices (SI’s) berekend door EC50/CC50 .

Voor TLR2/TNFα- en caspase3-studie werd de minimale veiligheidsconcentratie van baicalin en zijn analogen vastgesteld op 10 μg/mL. Deze verbindingen (10 μg/mL) werden toegevoegd wanneer het kweekmedium werd ververst met glucoseoplossing en de cellen in normale toestand werden gekweekt. De cellen werden opgehaald voor eiwitexperiment op de specifieke reperfusietijd (0,5, 1, 3, 6 h) na baicalin en de analogen toegevoegd. In de controle werd medium gebruikt als een voertuig en de cellen werden opgepikt op het reperfusietijdstip van 6 h.

2.5. Voorbereiding van de monsters

Twee groepen zonder geneesmiddelen werden gebruikt als controle. Een groep van de cellen werd gezaaid in het medium met normale groeimedium gedurende het gehele experimentele proces zonder zuurstof-glucose deprivatie. De tweede groep werd gezaaid in het medium met proces van zuurstof-glucose deprivatie als de model controle. Op elk tijdstip werd het celmonster op dezelfde wijze bereid als in de vorige beschrijving. Het medium werd getrokken uit elk putje, en cellen werden drie keer gewassen met koude PBS (pH 7,4) en gebruikt met 100 pi RIPA om totaal eiwit te verzamelen voor Western blotting.

2.6. Western Blot

Western blot assay voor eiwitexpressie van β-actine, TLR2, TNFα, en Caspase3 werd gerefereerd in met minimale modificatie als volgt: geladen monsters in de gel (10%), werd uitgevoerd tot de marker (gekocht bij Fermentas Republiek Litouwen) en ging naar het einde van de gel. De overdracht moet gedurende 60 minuten halfdroog zijn bij 12 volt en 280 mA. Daarna werd het membraan geblokkeerd met 10% melk in PBST (1 × PBS + 0,1% Tween20) gedurende 60 min. langzaam schudden bij kamertemperatuur. Het membraan werd in 1 ml PBST gebracht met antilichaam in een 1 : 1000 verdunning, gedurende 60 min geïncubeerd bij kamertemperatuur op het schudapparaat, en na incubatie van het primaire antilichaam 3 maal gewassen met PBST. Daarna werd het membraan gedurende 60 minuten in PBST geïncubeerd met het secundaire antilichaam in de concentratie 1 : 3000. Het membraan werd laatstelijk 3 maal gewassen met PBST.

2.7. Total Antioxidation Capability Detection

Het principe van dit experiment was om de kleurverandering te detecteren na de reductie van Fe3+ tot Fe2+ door de reducerende componenten in de monsters. De reducerende componenten kunnen het enzym en niet-enzymatische moleculen zoals lipide-oplosbare anti-oxyderende vitamine E en water-oplosbare anti-oxyderende vitamine C, bilirubine, en urinezuur omvatten. Vervolgens werd de optische dichtheid gemeten bij 520 nm met een microtiterplaatlezer. Het celmonster werd op dezelfde wijze bereid als bij de vorige beschrijving en geplukt op het specifieke reperfusietijdstip (6 uur) na toevoeging van baicalin en zijn analogen. Het medium werd uit elk putje getrokken, en de cellen werden driemaal gewassen met koude PBS (pH 7,4). De cellen in de plaat werden opgelost met PBS (1 ml per putje) door herhaald invriezen en ontdooien. Het supernatant werd verzameld voor T-AOC test na centrifuge 12 000 rpm/min.

2.8. Data Analysis

Alle waarden werden uitgedrukt als gemiddelde ± S.D. De gegevens werden statistisch geanalyseerd met ANOVA. De Newman-Keuls vergelijkingen werden gebruikt om de bron van significante verschillen te bepalen, waar nodig. P-waarden onder 0,05 werden als statistisch significant beschouwd. De software van CALC 2.0 (The China Association of Pharmacology) werd gebruikt voor CC50 en EC50 berekening.

3. Resultaten

3.1. Cell Growing Profile

De cellen werden gezaaid in de platen van het medium met 10% FBS voor 48 h. Ze zouden niet worden gebruikt voor de experimenten totdat ze goed groeide en hechtte aan elkaar in de flat van multiwell plates.

3.2. MTT-tests van cytotoxiciteit

Om de cytotoxiciteit te onderzoeken en de veilige doseringen van baicalin en zijn analogen te bepalen, werd de MTT-test uitgevoerd op PC12-cellen in vitro. Op basis van de experimenten was 10 μg/mL van baicalin en wogonoside de hoogste in veiligheidsconcentratie op normale PC12-cellen, en 1 μg/mL van baicalein en wogonin was de hoogste in veiligheidsconcentratie op normale PC12-cellen (figuur 2).

(a)

(b)

(a)
(b)

In PC12-cellen die met zuurstof-glucose deprivatie werden behandeld, overleefden slechts minder dan 40% cellen in vergelijking met de normale controle (𝑃<0,05). In vergelijking met de modelcontrole bedroeg de minimale effectieve concentratie (MEC) van baicalin en wogonin 10 μg/mL, terwijl de MEC van zowel wogonoside als baicalein gelijk was bij 1 μg/mL. De maximale effectieve concentratie (MAXEC) van baicalin en woronin was gelijk bij 1 mg/mL, hetgeen impliceert dat ze even veilig zijn. De MAXEC van wogonoside was 1 mg/mL, maar de MAXEC van baicaleïne was slechts bij 10 μg/mL. Er werd gesuggereerd dat baicaleïne meer cytotoxisch was dan wogonoside. Voor al deze verbindingen was de concentratie-afhankelijke wijze niet duidelijk (figuur 3).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

De CC50 van baicaleïne (188,4 μg/mL of 0,422 mmol/L) vertoonde grote verschillen met die van de andere drie verbindingen. Baicaleïne vertoonde meer celtoxiciteit met CC50 8,9 μg/mL (gelijk aan 0,0329 mmol/L). Wogonine en wogonoside vertoonden een vergelijkbare toxiciteit met respectievelijk CC50 10,6 μg/mL (gelijk aan 0,0373 mmol/L) en 13,7 μg/mL (gelijk aan 0,0298 mmol/L). Baicaleïne was echter effectiever voor de bescherming van de cellen tegen OGD-schade. De minimale effectieve dosering van baicaleïne was 1 μg/mL (gelijk aan 0,0037 mmol/L). De EC50 van baicaleïne was 1,2 μg/mL (gelijk aan 0,0027 mmol/L), en de EC50 van wogonine en wogonoside was 4.3 μg/mL (gelijk aan 0,0151 mmol/L) en 7,4 μg/mL (gelijk aan 0,0161 mmol/L). Bij vergelijking van de toxiciteit en het effect waren de veiligheidsindices van de vier verbindingen respectievelijk 156 (baicalin), 8,89 (baicalein), 2,47 (wogonin), en 1,85 (wogonoside) (tabel 1).

3.3. Effect op de Expressies van TLR2, TNFα, en Caspase3

Geïnduceerd door OGD, werden de eiwitten van TLR2 en TNFα in de cellen duidelijk uitgedrukt, wat betekent dat de OGD de aangeboren immuunreactie stimuleerde, waardoor ontsteking werd veroorzaakt. Het caspase3 eiwit in het OGD model was in zekere mate opgehoogd, maar er was geen significante statistische waarde (Figuur 4). Baicalin verzwakte de eiwitexpressie van TLR2 en TNFα 3 uur na de toediening. Wanneer baicalin 0,5 uur in werking trad, vertoonde de expressie van TLR2 een statistische significantie, ongeacht in vergelijking met normaal of in vergelijking met het model (𝑃<0,05), en de TLR2-expressie van 1 uur nam toe (in vergelijking met normaal, 𝑃<0,05); de expressie van 3 uur of 6 uur vertoonde echter geen duidelijk verschil in vergelijking met normaal (in vergelijking met het model, 𝑃<0,05). De expressie van TNFα bij 0,5 uur was nog steeds hoger dan bij de controle (𝑃<0,05), en de expressie bij 1 uur, 3 uur en 6 uur was duidelijk gedownreguleerd, wat een significant verschil liet zien met het modelniveau (𝑃<0,05). Baicalin had blijkbaar geen invloed op de expressie van het eiwit caspase3, dat werd getoond in figuur 4(a).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Na toevoeging van wogonoside (10 μg/mL) werden TLR2 en TNFα blijkbaar gedownreguleerd. De expressie van TLR2 was veel lager dan die van het model, zelfs dan het normale niveau (𝑃<0,05). Dienovereenkomstig werd de expressie van TNFα blijkbaar geremd door wogonoside vanaf 0,5 uur na de toediening tot het tijdstip van 6 uur (𝑃<0,05). Wogonoside vertoonde ook geen duidelijk effect op de expressie van caspase3 (Figuur 4(b)).

Na toediening van baicaleïne werd TLR2 nog steeds significant geüpreguleerd 0,5 uur en 1 uur na de toevoeging van baicaleïne (𝑃<0,05), en het daalde tot het normale bij 3 uur en 6 uur. Net als TLR2, werd het uitgedrukt tot het normale op 3 h en 6 h (figuur 4 (c)).

In wogonin groep, de twee factoren daalde blijkbaar. TLR2 daalde tot het normale niveau na 0,5 uur van de toevoeging van wogonine (vergeleken met het model, 𝑃<0,05), en het bleef op een lager niveau gedurende het experiment verloop. In de 0,5 h en 1 h tijdstippen, TNFα werd uitgedrukt meer dan de normale (𝑃<0,05) maar minder dan het model (𝑃<0,05), en op 3 h en 6 h, het kwam dicht bij het normale niveau als TLR2 expressie (figuur 4 (d)).

Gelijk aan baicalin en wogonoside groepen, vertoonde de expressie van caspase3 geen significante verandering in baicalein en wogonin groepen (Figuren 4(c) en 4(d)).

3.4. Assay of Total Antioxidation Competence (T-AOC)

Met behulp van de T-AOC kit, vonden we dat de antioxidatie competentie van de normale cellen was ongeveer 2,5 U / g, en een van de cellen behandeld door zuurstof-glucose deprivatie was ver onder 0,5 U / g. In baicalinegroep, was de opsporingswaarde 1.8 U/mL, tonend een significant verschil geen kwestie vergelijkend met normaal of vergelijkend met het OGD model. In wogonoside, baicaleïne, en wogonin groepen, de waarden waren 1,6, 0,8, en 0,6 U / mg, respectievelijk, die alle toonden een significant verschil in vergelijking met de normale of het model (figuur 5).

Figuur 5

Effect van baicalin en zijn drie analogen op de totale antioxidatiecapaciteit van de PC12-cellen die met zuurstof-glucose deprivatie werden behandeld. Model betekent behandeling met zuurstof-glucose deprivatie. Baicalin, wogonoside, en wogonin werden gebruikt in een concentratie van 10 μg/mL, de baicalein werd gebruikt in een concentratie van 1 μg/mL. **𝑃<0.01 versus normale controle. ##𝑃<0.01 versus model groep. $𝑃<0.01 versus baicalin en wogonoside groepen. De gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± S.D. van acht onafhankelijke experimenten.

4. Discussies

Baicalin is een geglycosyleerde verbinding afgeleid van baicaleïne, en het heeft een functionele groep van D-glucopyranosiduronzuur op site 7 van baicaleïne (figuur 1), zodat het meer biologische functie zal vertonen. De basisstructuur van baicalin bestaat uit benzopyran met drie hydroxylgroepen op plaats 5, 6 en 7 en een fenylgroep aan de andere kant van het benzopyran (plaats 2). Baicalin heeft ook een enolstructuur op de benzopyranring om de conjugatie in stand te houden. De twee verschillen tussen baicalin en wogonin liggen in de methoxylgroep op koolstof 8 van wogonin en de hydroxylgroep op koolstof 6 van baicalein. De samenstelling van drie hydroxylgroepen in baicalin kan verantwoordelijk zijn voor meer hydrofiele karaktereigenschappen. Bovendien is wogonoside een geglycosyleerde vorm van wogonine met D-glucopyranosiduronzuur op koolstof 7. Alle vier verbindingen hebben een vergelijkbaar koolstofskelet met een benzopyranstructuur en ook een hydroxylgroep op koolstof 5; baicaleïne en baicalïne hebben hydroxylgroepen op koolstof 6, terwijl wogonine en wogonoside dat niet hebben; baicaleïne en wogonine hebben hydroxylgroepen op koolstof 7, terwijl wogonoside en baicaline beide geglycosyleerd zijn op de hydroxylgroep op plaats 7; ten slotte hebben wogonine en wogonoside methoxylgroepen op koolstof 8, maar baicaleïne en baicaline hebben de functionele groepen niet .

Vanwege het resultaat van cytotoxiciteit en neuroprotectie, was D-glucopyranosiduronzuur op site 7 belangrijk voor het verminderen van cytotoxiciteit, waarbij baicalin minder cytotoxisch was dan baicalein en wogonoside minder cytotoxisch was dan wogonin. Methoxylgroep op koolstof 8 en hydroxylgroep op koolstof 6 waren de belangrijkste factor die het neuroprotectieve effect beïnvloedde, waardoor de EC50 van baicalin en baicalein minder was dan die van wogonoside en wogonin (figuur 1 en tabel 1) nadat ze waren toegediend.

In deze studie vonden we dat TLR2 sterk tot expressie kwam tijdens de zuurstof en glucose deprivatie (OGD) schade in PC12 cellen, wat suggereerde dat de receptor werd geactiveerd in de beschadigde neuronen (figuur 4). TLR2 is geïdentificeerd als een belangrijke mediator van immuunreacties en ontstekingsreacties, en het medieert pro-inflammatoire reacties door activering van TNFα . De receptor was significant verhoogd in vergelijking met het normale niveau, wat aangeeft dat het zich heeft aangesloten bij neuronschade veroorzaakt door OGD.

Door de literatuur van onderzoek, wordt TLR2 in het centrale zenuwstelsel (CZS) gerealiseerd als de directe bron van het schadelijke signaal en een belangrijk potentieel therapeutisch doelwit. In onze resultaten daalden de expressies van TLR2 en TNFα blijkbaar een paar uur nadat we de verbindingen hadden toegevoegd. In hetzelfde profiel werden de expressies van TLR2 en TNFα met wogonin en wogonoside meer geremd dan die met baicalin en baicalein. De remming van de expressie begon vanaf 0,5 uur na toediening van wogonin en wogonoside; de remming van de expressie van TLR2 en TNFα trad echter later op, namelijk 3 uur na toediening van baicalin en baicalein. Daarom bleek dat wogonin en wogonoside een voorkeur hebben voor TLR2. Gecombineerd met hun chemische structuren, impliceerden alle resultaten dat de methoxylgroep op koolstof 8 in de structuur de farmacofore hypothese is van het effect van TLR2 inhibitie, gerelateerd aan ontstekingsremming.

Voorwaarde voor de oversuppressie op TLR2 en TNFα door deze analogen, detecteerden we caspase3 om te bevestigen of er apoptose bestond met de toevoeging van de analogen. Vergeleken met het normale, nam de expressie van caspase3 eiwit in het OGD model inderdaad in enige mate toe, maar vertoonde geen statistisch verschil. Bij toediening van de vier analogen vertoonde het niveau van caspase3-eiwit geen duidelijke verandering, hoewel het de neiging vertoonde af te nemen op het tijdstip van 6 uur en dicht bij de normale controle kwam (vergeleken met de normale of het model, 𝑃>0,05). Bovenstaande resultaten suggereren dat de gewonde PC12 cellen in het OGD model geen duidelijke apoptose hadden, en de vier analogen konden ook geen apoptose induceren in de gewonde PC12 cellen. Volgens de literatuur verzwakte baicaline de globale cerebrale ischemie reperfusieschade bij gerbils via antioxidatieve en antiapoptotische routes, en baicaleine en wogonine konden beide apoptose induceren bij menselijke pancreaskankercellen en HL-60 leukemiecellen. Daarom moeten onze resultaten van apoptose door deze verbindingen verder worden bestudeerd.

Refererend naar de T-AOC detectie, vonden we dat de totale antioxidatie vermogen sequentie was baicalin en wogonoside > baicalein en wogonine, wat aangeeft dat een geglycosyleerde vorm op site 2 van baicalin en wogonoside een sleutelrol speelde in de totale antioxidatie.

Tezamen presenteerden baicalin en zijn drie analogen uitgebreid de bescherming van neuroncellen tegen OGD-schade en de remming van TLR2-expressie en TNFα (de factor in de downstream), wat de mogelijkheid suggereert van deze verbindingen gebruikt in beroertetherapie door TLR2 aan te pakken, een van de belangrijkste mechanismen van de cerebrale schade. Er is een structuur-activiteitsrelatie tussen deze verbindingen met veiligheid, werkzaamheid en specificiteit van het richten van geneesmiddelen op TLR2. Dit is de eerste keer dat we baicalin en zijn natuurlijke analogen bestuderen op moleculaire doelwitten van TLR2 en TNFα, alsook T-AOC. Dat alles zal voordeel hebben bij het ophelderen en ontwikkelen ervan voor de nieuwe geneesmiddelen.

Bijdrage van de auteurs

De eerste twee auteurs hebben gelijkelijk bijgedragen.

Acknowledgments

De auteur danken alle leden in hun laboratorium. De studie werd gedeeltelijk ondersteund door de National Natural Science Foundation van China (30801523, 81073092), de National S&T Major Special Project for New Drug R&D van China (2012ZX09103-201-041, 2012ZX09102-201-008, en 2011ZX09101-002-11), en Speciale Stichting voor Laboratorium van Tsinghua University (LF 20103579).