Vertakt DNA (bDNA) Technologie

BY admin
|

Inleiding

De vertakt DNA (bDNA) assay is een uniek en krachtig instrument voor betrouwbare kwantificering van nucleïnezuurmoleculen. Fundamenteel verschillend van doelamplificatiemethoden zoals PCR, meet de bDNA-test direct nucleïnezuurmoleculen op fysiologische niveaus door het reporter-signaal te versterken, in plaats van doelsequenties te repliceren als detectiemiddel, en vermijdt bijgevolg de fouten die inherent zijn aan de extractie en amplificatie van doelsequenties. De bDNA-test maakt gebruik van lineaire signaalversterking met synthetische oligonucleotide probes en bDNA-moleculen, en kan tussen ongeveer 500 en 10.000.000 moleculen nauwkeurig en precies meten. Nieuwe vorderingen in de bDNA-technologie omvatten de toevoeging van voorversterkermoleculen en de incorporatie van nieuwe nucleotiden, isoC en isoG, in oligonucleotide-probe-sequenties om het signaal verder te versterken en ruis veroorzaakt door niet-specifieke hybridisatie van bDNA-testcomponenten te verminderen. Door deze verbeteringen is de kwantitatieve detectiegrens van de bDNA-test verhoogd tot slechts 50 moleculen.

Geschiedenis van de bDNA-technologie

Geschikt voor routinematig gebruik in een klinische of onderzoekssetting, is de bDNA-test met succes toegepast op een aantal gebieden, waaronder de prognose en monitoring van patiënten met virale ziekten. Als betrouwbaar middel voor directe kwantificering van de virale belasting in klinische monsters zijn bDNA-tests ontwikkeld voor het meten van hepatitis-B-virus-DNA, hepatitis-C-virus-RNA), humaan immunodeficiëntievirus type 1-RNA en cytomegalovirus-DNA. Met het op maat ontwerpen van oligonucleotide probes reiken de potentiële toepassingen van de bDNA-test veel verder dan virale nucleïnezuurkwantificatie. Door het creëren van oligonucleotide probes voor specifieke sequenties van doelwit-nucleïnezuurmoleculen, is de bDNA-test aangepast aan een grote verscheidenheid van toepassingen. Onderzoekers hebben bijvoorbeeld probes ontworpen voor de bDNA-test om cellulaire mRNA-niveaus te meten. Dit is een vruchtbare aanpak gebleken voor een aantal onderzoekstoepassingen, waaronder het monitoren van veranderingen in cytokinemRNA-niveaus bij gezonde en immuungecompromitteerde patiëntenpopulaties, onderzoek naar insulinesplitsingspatronen en evaluatie van stressgen-inductie voor moleculair-toxicologische toepassingen. Gezien de veelzijdigheid, het gebruiksgemak en het hoge prestatieniveau wordt de bDNA-test snel de methode bij uitstek voor nucleïnezuurkwantificatie

Outline

De bDNA-test maakt gebruik van een 96-well microtiterplaatformaat, en is gebaseerd op een reeks specifieke hybridisatiereacties en chemiluminescente detectie van gehybridiseerde probes. Aan het oppervlak van elke microwell zijn “capture” probes bevestigd die een specifieke nucleotide-sequentie bevatten. Deze capture probes binden aan een subset van “target probes” die gebonden zijn aan specifieke nucleotide-sequenties in het doel-nucleïnezuurmolecuul. Deze reeks hybridisaties verankert het doelnucleïnezuurmolecuul aan het oppervlak van de microwell. Detectie van het doelnucleïnezuur en versterking van het signaal geschiedt door middel van een andere reeks hybridisaties.

Een tweede subset van doelsondes koppelt het doelnucleïnezuurmolecuul aan bDNA-versterkermoleculen. Met de toevoeging van voorversterkermoleculen om een extra versterkingslaag tussen de doelsondes en de bDNA-versterkermoleculen aan te brengen, kan een nog grotere signaalversterking worden bereikt. Elk bDNA-versterkermolecuul is zodanig ontworpen dat het 15 armen bevat, die elk drie bindingsplaatsen voor alkalische-fosfatase-geconjugeerde “label probes” bevatten. Een chemiluminescent signaal wordt opgewekt na inbrenging van een dioxetaansubstraat dat door de alkalische fosfatase wordt geactiveerd. Dit signaal kan gemakkelijk worden gekwantificeerd door het aantal uitgezonden fotonen in een luminometer te tellen. De bDNA-test is inherent kwantitatief aangezien het aantal uitgezonden fotonen rechtstreeks verband houdt met de hoeveelheid doelnucleïnezuur in het specimen.

Materialen

Apparatuur – Chiron-plaatverwarmer uitgerust met 8×12 microwellhouder – Chiron-plaatleesluminometer

Gereedschappen voor dag 1

  • Oligonucleotide-gemodificeerde microwells
  • Lysisverdunningsmiddel
  • Lysereagens (proteinase K)
  • Target-sondes voor capture
  • Target-sondes voor label
  • Specimens
  • Standaarden en controles (facultatief)

Vergoedingsmiddelen voor dag 2

Procedure

Dag 1

  1. Voorbereiding van het monster-werkreagens door te combineren:
  • 6 mllyseverdunningsmiddel
  • 600 ml lysereagens
  • 32 ml 500 fm/ml doelsondes voor vangst (20 fm/200 ml eindproduct)
  • 96 ml500 fm/ml doelsondes voor etikettering (60 fm/200 ml eindproduct)

Noot: De werkelijke concentraties van de doelsondes zullen variëren naar gelang van het doelnucleïnezuurmolecuul.

  1. Voor plasma- of serummonsters: pipetteer 150 ml Specimen Working Reagent en 50 ml serum of plasma in tweevoud in microwells met oligonucleotide-gemodificeerde microwells. Voor cel- of weefselspecimens: bereid en extraheer RNA-pellets in het specimen-werkreagens zoals beschreven, en pipetteer 200 ml van elk RNA-extract in tweevoudige, met oligonucleotide gemodificeerde microwells.
  2. Indien gewenst kunnen positieve en negatieve controles worden opgenomen voor specificiteitsdoeleinden. De controles moeten op dezelfde manier worden behandeld als beschreven voor de specimens in stap 2 (hierboven) en moeten in duplo worden uitgevoerd.
  3. Voor absolute kwantificering kunnen desgewenst standaarden worden toegevoegd. Pipetteer 150 ml monsterwerkreagens en 50 ml van het juiste standaardcurve lid in duplo oligonucleotide gemodificeerde microwells.
  4. Sluit de microwells af met Mylar-folie en incubeer de microwells ’s nachts bij 53°C in de Chiron-plaatverwarmer. (Opmerking: De temperatuur is afhankelijk van de optimale temperatuur voor de specifieke test.)

Dag 2

  1. Haal de plaat uit de Chiron-plaatverwarmer en laat 10 minuten bij kamertemperatuur staan. Terwijl de plaat afkoelt, bereidt u de versterkeroplossing door het versterkerconcentraat bij 200 fm/ml in labelverdunningsmiddel te verdunnen. De uiteindelijke concentratie moet 10 fm/50 ml zijn.
  2. Was de microwells tweemaal met Wash A en pipetteer vervolgens 50 ml verdunde versterker in elke well. Incubeer de microwells gedurende 30 minuten bij 53°C in de Chiron plaatverwarmer.
  3. Haal de plaat uit de Chiron plaatverwarmer en laat hem 10 minuten bij kamertemperatuur staan. Terwijl de plaat afkoelt, wordt de label-werkoplossing bereid door de labelsonde bij 500 fm/ml in labelverdunningsmiddel te verdunnen. De eindconcentratie moet 20 fm/50 ml zijn.
  4. Was de microwells tweemaal met Wash A en pipetteer vervolgens 50 ml van de Label Working Solution in elk putje. Incubeer de microwells 15 min. bij 53 °C in de Chiron-plaatverwarmer.
  5. Haal de plaat uit de Chiron-plaatverwarmer en laat hem 10 min. bij kamertemperatuur staan. Bereid gedurende deze tijd de substraatoplossing van 99,7% v/v LumiphosPlus en 0,3% v/v 10% SDS (bijvoorbeeld: 3 ml LumiphosPlus, 9 ml 10% SDS).
  6. Was de microwells tweemaal met Wash A en vervolgens driemaal met Wash B. Voeg 50 ml van de substraatoplossing toe aan elke well.
  7. Met de chemiluminescentie in de plaat-aflees-luminometer. (Dit omvat incubatie van de microwells gedurende 30 minuten bij 37°C vóór de meting om een steady-state kinetiek te bereiken).

Troubleshooting

  • Oligonucleotide gemodificeerde wells moeten voorzichtig worden gehanteerd. Breek de wellstrips niet in segmenten uiteen. Sluit de wells goed af met een nieuwe plaatafsluiter om verdamping tijdens de incubatie te voorkomen. Wanneer u de plaatsealer na incubaties verwijdert, moet u erop letten dat u de wells niet uit de microwellhouder trekt.
  • Alle specimens, standaarden en controles moeten in duplo worden geanalyseerd voor een optimale kwantificering. Verwijder lipemische of troebele specimens omdat deze onduidelijke resultaten kunnen opleveren.
  • Voor optimale resultaten moeten alle reagentia vóór gebruik op de in de assayprocedure aangegeven temperatuur worden gebracht. Voeg reagens toe aan de microwells door het aanraken van de pipetpunt aan de wand in de buurt van het midden van de well, boven het oppervlak van de vloeistof in de well.

Toepassing

Virale kwantificering of virale belasting testen is onderdeel geworden van de routinematige behandeling van patiënten die besmet zijn met HIV-1 of hepatitis C-virus (HCV). Er zijn momenteel verschillende moleculaire technologieën beschikbaar voor gebruik in de klinische laboratoriumomgeving. Daarvan zijn alleen de vertakte DNA (bDNA) tests door de FDA goedgekeurd voor HIV-1 en HCV viral load tests. Deze signaalversterkingstechnologie is gebaseerd op een reeks hybridisatiereacties die zeer geschikt zijn voor volledige automatisering en daardoor de hoeveelheid arbeid verminderen die nodig is om dit type analyse uit te voeren.

Moleculair-diagnostische assays die gebruik maken van bDNA-technologie voor de detectie van nucleïnezuur-doelmoleculen zijn gevoelige, specifieke en betrouwbare hulpmiddelen bij de diagnose van virale en bacteriële infecties en voor het volgen van de ziekteprogressie in de loop van de therapie. bDNA-tests zijn geëvolueerd van ontwikkelingsstadia in het onderzoekslaboratorium tot door de US Food and Drug Administration goedgekeurde kwantitatieve assays met waardevolle klinische toepassingen. De bDNA-tests zijn minder arbeidsintensief dan veel moleculair-gebaseerde procedures omdat zij zeer geschikt zijn voor totale automatisering. Bij gebruik van bDNA is amplificatie van een doelsequentie niet vereist, zodat kruisbesmetting tussen replicaatmonsters als gevolg van overmatige amplicons of carry-over bij bDNA-tests minder waarschijnlijk is. Omdat bDNA een signaalversterkingstechnologie is, kan de test bovendien kwantificeren met minder dan een 0,5-log of 3-voudige variabiliteit over het gehele dynamische bereik.

bDNA-technologie is veelzijdig gebleken omdat methoden zijn ontwikkeld voor het opsporen van infectie door een breed scala van micro-organismen, waaronder de parasiet Trypanosoma

brucei, cytomegalovirus, antibiotica-gevoelige en antibiotica-resistente stafylokokkenbacteriën, humaan papillomavirus, en hepatitis B-virus. Meer recente inspanningen zijn echter gericht op de ontwikkeling van bDNA-tests voor de kwantificering van HIV-1 en hepatitis C-virus (HCV) RNA, wat heeft geleid tot de routinematige toepassing van bDNA-methoden in het laboratorium voor klinische moleculaire diagnostiek. Bij de beschrijving van de vooruitgang van bDNA-methoden, wordt in dit overzicht de nadruk gelegd op bDNA-tests voor HIV-1 en HCV.

Eerste generatie HIV-1 bDNA-tests

Nauwkeurige, reproduceerbare bDNA-tests van de eerste generatie werden ontwikkeld voor de detectie van HIV-1 RNA en HCV RNA in menselijk plasma (Quantiplex HIV-1 of HCV RNA 1.0 assay, Bayer, Tarrytown, NY).9-11 In een van de eerste rapporten over de Quantiplex bDNA assay werd met de eerste generatie

bDNA assay geen reactiviteit waargenomen met plasmamonsters van seronegatieve donors, wat duidt op een uitstekende specificiteit.9 Positieve resultaten in de bDNA-test werden waargenomen in 83% van de monsters van 348 patiënten die seropositief waren voor HIV-1.9 Het dynamische bereik voor kwantificering met behulp van de Quantiplex HIV-1 RNA 1.0-assay liep van 104 (ondergrens van detectie) tot meer dan 106 HIV RNA-kopieën/mL.9,11 Veranderingen in viral load van 2- tot 3-voudig waren statistisch significant met de bDNA-test, wat aangeeft dat de Quantiplex HIV-1 RNA 1.0-test zeer accuraat en reproduceerbaar is.11 Ter vergelijking: bij de eerste versies van de RT-PCR-test waren veranderingen in viral load van ten minste 3,7- tot 5,8-voudig nodig voordat de resultaten statistisch significant waren.11 Daarom werd bDNA de voorkeursmethode voor de meeste klinische trials waarin viral load-tests en de klinische werkzaamheid van nieuwe HIV-1 reverse transcriptase- en proteaseremmers worden geëvalueerd.

De gevoeligheid van de bDNA-detectiemethode werd in de tweede generatie HIV-1-assay (Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 assay, Bayer) verbeterd door het ontwerp van de doel- en vangstprobes en de toevoeging van vooramplifier-oligonucleotiden te veranderen. Door het verbeterde ontwerp van de doel- en vangstprobes kon de striktheid van de hybridisatie worden verhoogd, waardoor de achtergrond van de assay werd verlaagd. Voorversterkers verhogen de signaalintensiteit drastisch omdat elk voorversterkermolecuul meerdere gebieden heeft voor hybridisatie met vele bDNA-moleculen. Bovendien heeft elke bDNA-molecule meerdere, herhaalde sequenties voor hybridisatie van AP-gelabelde probes. Het met de Quantiplex HIV-1 RNA 2.0-assay verkregen signaal vertoonde lineariteit van ongeveer 500 kopieën/mL tot 1,6 × 106 kopieën/mL (het opgegeven dynamische bereik was 500 tot 8 × 105 kopieën/mL). De gevoeligheid van de tweede-generatie HIV-1 bDNA-test was 20-maal hoger dan die van de eerste-generatie-test (de onderste detectiegrens was respectievelijk 500 kopieën/mL en 10 × 104 kopieën/mL). In een uitgebreide analyse van de precisie werden initiële testresultaten en hertestresultaten in de Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 assay vergeleken. De HIV-1 RNA 2.0 assay bleek zeer reproduceerbaar te zijn.14 Van 174 monsters met virale ladingen van meer dan 5.000 kopieën/mL had 96% verschillen van minder dan 0,3 log10 in kopiegetal tussen de initiële resultaten en de hertestresultaten. Van 69 monsters met virale ladingen tussen 500 en 5.000 kopieën/mL, had 86% minder dan 0,3 log10 verschillen tussen de initiële en hertestresultaten. Echter, onder 5.339 patiënten die gedurende een interval van 1 jaar bij routine klinische tests werden getest, werden virale ladingen van minder dan 500 kopieën/mL waargenomen in 41,6% van de monsters.

Daarom was een bDNA-test met een hogere gevoeligheid (d.w.z. een lagere detectiegrens van <500 kopieën/mL) nodig voor een aanzienlijk deel van de patiënten.

De prestatiekenmerken van de Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 assay en een RT-PCR-test (Amplicor HIV-1 Monitor 1.0 assay, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) werden vergeleken met behulp van verdunningen van standaardmonsters waarvan het aantal HIV-1-viruskopieën bekend was. Wanneer verdunningen van dezelfde standaards in de twee tests werden getest, waren de aantallen HIV-1-kopieën in het algemeen hoger in de RT-PCR-test dan in de bDNA-test. Het bereik van de RNA-kopiegetallen was bijvoorbeeld 900 tot 7,68 × 105 kopieën/mL bij de bDNA-test en 3.360 tot 1,88 × 106 kopieën/mL bij de RT-PCR-test. Beide tests waren lineair voor de aangegeven dynamische bereiken.

Vergelijking van de hellingen van de regressielijnen van het aantal HIV-1-kopieën ten opzichte van de signaaloutput suggereerde dat de bDNA-test minder proportionele systematische fout had. De variabiliteit tussen de tests, met gebruikmaking van een standaardmonster met 1.650 HIV-1 kopieën/mL, was lager bij de bDNA-test dan bij de RT-PCR-test; de variatiecoëfficiënten voor de bDNA- en RT-PCR-tests bedroegen respectievelijk 24,3% en 34,3%, wat erop wijst dat de bDNA-test bij dit HIV-1 RNA-kopiegetal iets nauwkeuriger was. Vergeleken met het gebruik van de standaard van 1650 kopieën/mL waren de variatiecoëfficiënten tussen de tests hoger voor een monster met 165 HIV-1 RNA-kopieën/mL (44,0% en 42,3%).7% voor de bDNA- en RT-PCR-tests, respectievelijk). De testresultaten waren vergelijkbaar wanneer gelijke aantallen HIV-1 kopieën werden vergeleken tussen de HIV-subtypes A tot en met F met behulp van de bDNA-test. Echter, met deze versie van RT-PCR, werden subtypes A, E, en F minder efficiënt gedetecteerd dan de B, C, en D subtypes. De verschillen tussen de tweede-generatie bDNA-test en de Amplicor Monitor RT-PCR-test voor HIV-1 kwantificering gaven aan dat consistentie in testmethode nodig was voor elke individuele patiënt gedurende diagnose en behandeling.

HCV bDNA Assays

Terwijl Bayer doorging met het ontwikkelen van een verbeterde derde-generatie HIV-1 bDNA-test, zag het de noodzaak in van het ontwikkelen van een HCV viral load assay met een opkomende klinische bruikbaarheid vergelijkbaar met die voor HIV-1 testen. Voor de detectie van HCV had de bDNA-test van de eerste generatie (Quantiplex HCV RNA 1.0-test, Bayer) een dynamisch kwantificatiebereik in menselijk plasma van 3,5 × 105 tot 1,2 × 108 HCV RNA-kopieën/mL. Genotypes 1 tot en met 6 werden met deze assay gedetecteerd, hoewel de gevoeligheid lager was voor genotypes 2 en 3 (67% detectiegraad: positief signaal voor 60 van 89 serummonsters waarvan bekend was dat ze HCV-genotypes 2 of 3 bevatten) in vergelijking met genotype 1 (97% detectiegraad: positief signaal voor 67 van 69 serummonsters waarvan bekend was dat ze HCV-genotype 1 bevatten). Een vergelijking van de Quantiplex HCV RNA 1.0 assay en een door een onderzoekslaboratorium ontwikkelde RT-PCR-test voor HCV liet een grotere gevoeligheid zien bij de RT-PCR-test, die een ondergrens detectie had van 2,5 × 104 HCV RNA kopieën/mL. De HCV bDNA-test had echter een grotere reproduceerbaarheid en was minder tijdrovend dan de door het laboratorium ontwikkelde HCV RT-PCR-test.

Om het detectiepercentage voor HCV-genotype 2 en 3 te verbeteren, werd een tweede-generatietest ontwikkeld (Quantiplex HCV RNA 2.0 assay, Bayer).15 De belangrijkste wijziging in het ontwerp van de tweede-generatietest voor HCV RNA was het gebruik van probes voor sequenties in het HCV-genoom die in hogere mate geconserveerd waren tussen genotypes. Deze geconserveerde gebieden waren 5′ ongetranslinkte sequenties en sequenties in het kerngen van het HCV-genoom. Het resultaat van de wijzigingen in de doel- en vangstprobes was een drastische vermindering van de variatie in detectiegraad tussen HCV-genotypes in de tweede-generatie-test. Elk van de 6 HCV-genotypes had een hoog detectiepercentage, en er was een duidelijke verbetering in de detectie van HCV-genotypes 2 en 3 (detectie van 93% vs. 67% van monsters waarvan bekend was dat ze HCV-genotypes 2 of 3 bevatten in respectievelijk de HCV 2.0- en HCV 1.0-assays). Ook was de gevoeligheid van de tweede-generatie bDNA-assay iets hoger dan die van de HCV 1.0-assay (ondergrenzen van kwantificering waren 2,0 × 105 versus 3,5 × 105 ).

Derde-generatie bDNA-assays voor HIV-1 en HCV

In de eerste- en tweede-generatie bDNA-assays beperkte niet-specifieke hybridisatie van oligonucleotideproeven aan niet-doelsequenties de gevoeligheid van de assay. De cruciale technologische verbetering in de bDNA-test van de derde generatie (Quantiplex HIV-1 RNA 3.0 assay, Bayer) was het gebruik van niet-natuurlijke basen, 5′-methyl-2′-deoxyisoguanosine (isoG) en 5′-methyl-2′-isodeoxycytidine (isoC), in de synthese van alle probes in het bDNA-systeem, met uitzondering van de capture extenders die zorgen voor het vastleggen van het virale doelnucleïnezuur op het plaatoppervlak. Omdat oligonucleotiden die isoG en isoC bevatten in de natuur niet voorkomen, wordt niet-specifieke hybridisatie aanzienlijk beperkt. Zo vormen probes die met de niet-natuurlijke basen zijn gemodificeerd geen stabiele hybriden met de vangstsonde in afwezigheid van doel-RNA. Bij de eerste beschrijving van de derdegeneratietest was de aantoonbaarheidsgrens van HIV-1 in plasmamonsters van 11 patiënten 50 kopieën per ml, hetgeen een tienvoudige verbetering van de aantoonbaarheidsgrens betekent ten opzichte van de tweedegeneratietest. Tijdens de behandeling met zeer actieve antiretrovirale therapie daalde de HIV-1-viral load bij alle 11 patiënten tot onder de detectiegrens.

Het VERSANT HIV-1 RNA 3.0-assay heeft een dynamisch bereik van 75 tot 5 × 105 HIV RNA-exemplaren/mL. Versie 3.0 is ook goedgekeurd tot een ondergrens van detectie gelijk aan 50 kopieën/mL in verschillende andere landen. Wanneer gematchte monsters werden vergeleken in de tweedegeneratie HIV-1 bDNA-test (Quantiplex versie 2.0) en de Amplicor Monitor 1.0 RT-PCR-test, werden met de bDNA-test consistent lagere aantallen HIV-1-kopieën verkregen. Er werd echter een nauwe kwantitatieve correlatie in aantallen HIV-1 RNA-kopieën waargenomen tussen de derdegeneratietest (versie 3.0) en de Amplicor Monitor 1.5 RT-PCR-test.18 De resultaten van de virale belasting in de bDNA-test van versie 3.0 en in de Amplicor RT-PCR-test waren ongeveer 2-maal zo hoog als in de versie 2.0-test. Kwantitatief vergelijkbare resultaten in de versie 3.0 bDNA-test en de RT-PCR-test zijn belangrijk in de patiëntenzorg vanwege de waarschijnlijke mogelijkheid dat verschillende methoden zullen worden gebruikt bij het testen van monsters van dezelfde patiënt voor de kuur van anti-HIV-therapieën. Recente gegevens suggereren dat rebaselining voor patiënten die met een RT-PCR-test worden getest wellicht niet nodig is.

Gelijk aan de HIV-1 versie 3.0 bDNA-test, werd bij de derde generatie bDNA-test voor HCV ook gebruik gemaakt van isoC- en isoG-gesubstitueerde oligonucleotiden om niet-specifieke hybridisatie te verminderen. Door het gebruik van isoC- en isoG-gesubstitueerde oligonucleotiden werd de gevoeligheid van de assay ongeveer 62-voudig verhoogd. De onderste aantoonbaarheidsgrens van de HCV RNA 3.0 assay was 3,2 × 103 kopieën/mL vergeleken met 2 × 105 kopieën/mL in de HCV RNA 2.0 assay. Het dynamische lineaire kwantificeringsbereik van de HCV RNA 3.0-assay liep van 3,2 × 103 kopieën/mL (615 IU/mL) tot 4 × 107 HCV RNA kopieën/mL (7,7 × 106 IU/mL). Het HCV RNA 3.0 assay had een hoge specificiteit (98,2%) en was, net als het assay van de tweede generatie, even effectief bij de kwantificering van HCV RNA voor alle genotypes. De standaardafwijkingen tussen de tests en binnen de tests voor replicaatmonsters bedroegen respectievelijk 0,2 log10 en 0,14 log10, wat aangeeft dat de derde-generatietest zeer reproduceerbaar was.

Naast de uitroeiing van HCV in serum, is een belangrijk doel van anti-HCV-therapieën de HCV-niveaus in de lever te verminderen. De bruikbaarheid van de HCV RNA 3.0-test voor de detectie en kwantificering van HCV RNA in leverbiopsiestalen werd onderzocht bij 25 patiënten die tegelijk met HCV en HIV geïnfecteerd waren.20 De reproduceerbaarheid van de HCV bDNA-test van de derde generatie was vergelijkbaar tussen leverbiopsiestalen en serumstalen. Ook was de detectie van HCV RNA in levermonsters van patiënten die geïnfecteerd waren met genotype 1, 3, en 4 met de HCV RNA 3.0 assay zeer specifiek en gevoelig. In deze studie van 25 patiënten correleerde een hoge prebehandeling van intrahepatisch HCV

met een lage frequentie van respons op anti-HCV-therapie. De intrahepatische HCV-spiegels vóór de behandeling waren het hoogst bij patiënten die geïnfecteerd waren met HCV-genotype 1. De resultaten van deze studie toonden aan dat belangrijke markers van HCV ziekteprogressie, HCV niveaus in lever en in serum, betrouwbaar gekwantificeerd kunnen worden door bDNA analyse tijdens de behandeling. De methoden voor bDNA-tests van de derde generatie omvatten monstervoorbereiding, hybridisatie, en signaaldetectie voorHIV-1 RNA en HCV RNA. Alle 3 s eps worden uitgevoerd in de microwells op het System 340-platform voor de HCV RNA 3.0-assay waarvoor geen afzonderlijke extractiestap nodig is. In de versie 3.0 HIV-1 RNA-assay verschilt de monstervoorbereiding van de HCV RNA-methode en wordt deze buiten het System 340-platform uitgevoerd. In een recente studie is een aanpassing van de HIV-1 RNA-methode van versie 3.0 geëvalueerd, waarbij de verwerking van het HIV-1-monster is gewijzigd om gelijktijdig testen op HCV en HIV-1 op het System 340-platform mogelijk te maken. De HIV-1-methode werd gewijzigd door weglating van de 2-uur durende incubatie bij 63°C voor virale lysis. In plaats daarvan werd de lysis van HIV-1 en HCV uitgevoerd op het System 340-platform. De HCV bDNA-testmethoden bleven ongewijzigd in de gecombineerde test. De specificiteit en kwantificering met de gecombineerde bDNA-methode vielen binnen de specificaties voor de afzonderlijke hiv-1- en HCV-tests. Gelijktijdig testen op HIV-1 en HCV verbeterde de workflow in het klinisch laboratorium en resulteerde in lagere kosten. Omdat detectie en kwantificering van HIV-1 RNA en HCV RNA van cruciaal belang zijn voor de diagnose en voor de evaluatie van de respons op therapie, betekent de mogelijkheid om gelijktijdig op beide virussen te testen een belangrijke vooruitgang in de moleculaire diagnostiek.