Objev, aktivita a charakterizace lytické polysacharidové oxygenázy AA10 ze symbionta lodních červů Teredinibacter turnerae

Exprese a enzymatická charakterizace LPMO AA10 z T. turnerae

Gama-proteobakterie T. turnerae je jediným endosymbiontem nalezeným v žábrách lodních červů, který byl úspěšně izolován, kultivován a jehož genom byl zmapován . Prostřednictvím automatické anotace a ručního vyhledávání BLAST v předpokládaném proteomu T. turnerae jsme identifikovali jeden gen (referenční sekvence NCBI: WP_019602454.1) kódující LPMO AA10 (dále jen TtAA10A). Předpokládaná sekvence proteinu obsahuje N-koncový signální peptid, doménu LPMO a na serin bohatou linkerovou oblast následovanou doménou CBM (carbohydrate binding module) 10 (obr. 1a). Byly nalezeny AA10 s připojenými doménami CBM2, CBM3, CBM5, CBM10, CBM12, CBM18 a CBM73 (osobní sdělení Bernarda Henrissata) a je známo, že jsou aktivní na celulóze nebo chitinu. Předpokládá se, že domény CBM10 se vážou na celulózu, a mohou tak zajišťovat rozpoznávání celulózy, které pravděpodobně není spojeno s katalytickým dějem . Ačkoli se liší od CBM, které se běžně vyskytují připojené k proteinům AA10 , jeho přítomnost v doménové struktuře genu TtAA10A dává tušit, že tento protein může být aktivní především na polysacharidech na bázi glukózy.

Po několika pokusech o expresi genu s různými afinitami, značkami rozpustnosti a různými sekrečními signály se nakonec podařilo získat dostatečné množství proteinu pro analýzu produkcí C-terminálně značené streptokokové katalytické domény LPMO (od His25 po Gly228) v E. coli (obr. 1b). Purifikovaný značený protein byl zatížen přebytkem mědi, odsolen pomocí velikostně vylučovací chromatografie, analyzován z hlediska čistoty pomocí SDS-PAGE (obr. 1c) a identifikace proteinu pomocí hmotnostní spektrometrie (není uvedeno) a použit pro další experimenty.

Rekombinační TtAA10A (pouze katalytické domény, 25-228) vykazuje znaky správně složeného AA10. Analýza tepelného posunu (Thermofluor) purifikovaného, Cu zatíženého TtAA10A ukazuje teplotu tání (Tm) 50,4 °C. Odstranění mědi pomocí 10 mM EDTA snižuje Tm na 42,5 °C, což naznačuje stabilizační účinek kovového kofaktoru na protein, jak bylo uvedeno v předchozí literatuře u jiných LPMO (např. , obr. 1d). Zaznamenali jsme také variabilitu proteinových preparátů, přičemž některé preparáty obsahovaly jediný atom Cu (s aktivním centrem), zatímco jiné obsahovaly dva atomy Cu, což je popsáno níže.

Testy aktivity, jak na vzorcích s jedním, tak se dvěma Cu místy, byly provedeny na řadě komerčních polysacharidových substrátů (Avicel, β-chitin z pera olihně, α-chitin ze skořápky krevety, cellohexaosa, kukuřičný škrob, pachyman, bukový xylan, glukomannan, xyloglukan, lichenan, galaktan, galaktomannan a mannan) v přítomnosti redukujícího kofaktoru, kyseliny gallové. Vzorky byly po 24 hodinách analyzovány pomocí MALDI-TOF MS a hmotnosti píků reakčních produktů byly porovnány s dříve publikovanými údaji, které odhalily smíšený oxidační vzorec C1-C4, výhradně na celulose a závislý na přítomnosti donoru elektronů (obr. 2a, b). Produkty nebyly detekovány v žádné z negativních kontrol (doplňkový soubor 1: obr. S1). Analýza MALDI-TOF MS surového extraktu z testů aktivity provedených s TtAA10A zatíženým Cu v přítomnosti 10 mM EDTA nezjistila uvolňování produktů (údaje nejsou uvedeny), což naznačuje, že podle očekávání je pro aktivitu nezbytná měď.

Synergické experimenty byly provedeny koinkubací TtAA10A a komerčních glykosidových hydrolas (GH6 a GH9) v přítomnosti Avicelu a kyseliny gallové a vzniklé mono- a oligosacharidy byly kvantifikovány pomocí vysokoúčinné aniontově výměnné chromatografie (HPAEC). Zatímco reakce obsahující samotný LPMO nebo GH uvolňovaly zanedbatelné množství volných cukrů, koinkubační reakce vykazovaly silný synergický účinek, který byl dále zesílen přítomností donoru elektronů (obr. 2c, d, Additional file 2: Figure S2). Stojí za zmínku, že oba komerční GH (GH6 a GH9) testované během těchto experimentů patří do rodin, které byly identifikovány jako jedny z nejhojnějších v trávicím proteomu loděnek , což posiluje biologickou relevanci výše uvedených testů aktivity v kontextu trávení dřeva v prostředí loděnek.

Elektronová paramagnetická rezonanční spektroskopie

První důkaz, že některé proteinové preparáty obsahují dvě místa pro Cu, přinesly EPR analýzy. Spektrum CW-EPR v pásmu X zmraženého roztoku (165 K) TtAA10A nasyceného Cu (obr. 3) vykazovalo dvě sady hyperjemných píků v paralelní oblasti spektra, což naznačuje přítomnost dvou různých koordinačních geometrií mědi, které vyplývají buď z různých koordinačních prostředí v rámci jednoho místa (např. rozdíly v protonizačních stavech ligandů), nebo z odlišného druhého vazebného místa mědi. Přesnou simulaci paralelní oblasti spektra bylo skutečně možné získat se dvěma různými druhy, z nichž každý poskytoval jiný soubor parametrů spinového hamiltoniánu, gz = 2,267 a |Az| = 425 MHz (druh 1) a gz = 2,314 a |Az| = 465 MHz (druh 2), tabulka 1, přičemž poměr mezi druhy 1 a 2 byl přibližně 3:2. Hodnota gz druhu 2 je vysoká ve srovnání s hodnotou, kterou lze očekávat pro typickou koordinaci mědi v aktivním místě LPMO AA10 (spektroskopie LPMO nedávno přezkoumána v Ref. ), na jejímž základě přiřazujeme druh 1 mědi navázané na kanonickou histidinovou závorku aktivního místa. Jeho hodnoty spinového hamiltoniánu jsou typické pro axiální koordinační geometrii Cu, která obsahuje směs N a O-donujících ligandů . (Všimněte si, že druh 2 nemůže pocházet z volného druhu mědi v roztoku, protože všechny druhy malých molekul jsou odstraněny během přípravy proteinu; proto všechny signály mědi v EPR pocházejí z mědi vázané na protein.)

Pro určení, zda oba signály vznikly z jednoho vazebného místa mědi s různou koordinační geometrií, nebo ze dvou různých vazebných míst mědi, byl proveden X-pásmový CW-EPR titrační experiment. Protein byl předem ošetřen EDTA (10× koncentrace proteinu), aby se odstranila veškerá měď, a poté byl vyměněn pufr, aby se odstranila veškerá EDTA. Tento vzorek proteinu bez mědi byl testován a podle očekávání nevykazoval žádný signál na bázi mědi. Přidání 0,2 ekvivalentu mědi (ve srovnání s koncentrací proteinu) ukázalo jediný signál v paralelní oblasti, který byl přiřazen iontu mědi (II) v aktivním místě histidinové závorky (druh 1). Další přídavky mědi tento signál mědi v histidinovém závorníku zvyšovaly, přičemž současně rostl signál pro druh 2, který byl patrný již po 0,4 ekvivalentu mědi (Additional file 3: Figure S3). Tyto titrační experimenty byly provedeny při fixním pH a ukazují, že dva druhy v EPR spektru TtAA10A nasyceného mědí představují dvě různá vazebná místa Cu s mírně odlišnou afinitou k mědi, přičemž druh 1 je místem s vyšší afinitou. Dále byl vzorek TtAA10A s 0,4 ekvivalentu Cu ponechán 48 h při 4 °C a jeho EPR spektrum bylo znovu prozkoumáno. Tento vzorek nevykazoval žádný rozdíl v poměru druhů mědi, což dokazuje, že různá vazebná místa nevznikla v důsledku velkých rozdílů v kinetice vazby mědi.

V několika preparátech, které jsme vyrobili, byl izolován vzorek TtAA10A, který v EPR spektru vykazoval pouze jediný signál mědi. Důvody tohoto rozdílu ve stechiometrii mědi izolovaného proteinu nejsou jasné, protože tyto vzorky byly údajně připraveny za stejných podmínek jako ty, které poskytly TtAA10A se dvěma odlišnými signály Cu v EPR spektru v pásmu X (druh 1 a druh 2). U těchto preparátů s jednotlivě obsazenou mědí jsme nebyli schopni zjistit žádné rozdíly v aktivitě oproti předchozím vzorkům, ale mohli jsme využít těchto vzorků k měření CW-EPR spekter v pásmu X i Q pro Cu aktivního centra TtAA10A (obr. 4) s obsazenou pouze histidinovou závorkou, jak jsme usoudili na základě předchozích spekter. Tento vzorek nám proto umožnil provést simultánní fit obou spekter v pásmu X a Q, abychom získali přesnější parametry spinového hamiltoniánu pro měďnatý ion v aktivním místě s histidinovou sponou (druh 1). Tyto hodnoty jsou uvedeny v tabulce 2. Přidání PASC k TtAA10A nezpůsobilo žádnou změnu EPR spekter (údaje nejsou uvedeny).

3D struktura TtAA10A

Abychom získali další poznatky o molekulární podstatě biochemických vlastností TtAA10A a prozkoumali tuto, potenciálně neobvyklou, duální Cu strukturu, stanovili jsme krystalovou strukturu pro rekombinantně exprimovaný protein s rozlišením 1,4 Å (Additional file 4: Table S1). Celková struktura odhalila jádro podobné imunoglobulinovému záhybu zdobené smyčkami a šroubovicovým svazkem, jak je typické pro enzymy z této rodiny (obr. 5). Strukturní srovnání pomocí serveru DALI skutečně odhalilo nejbližší strukturní shody s Cellvibrio japonicus AA10A (PDB ID 5fjq) a Serratia marcescens CBP21 (PDB ID 2bem) s RMSD 2,4 Å a 2,3 Å na 180, resp. 170 Cα-pozicích, což představuje pouze 30% identitu na úrovni sekvence. Vzhledem k vysoké aktivitě TtAA10A na celulóze může být poněkud překvapivé, že dvě nejbližší strukturní shody s tímto enzymem jsou chitin-aktivní AA10. Třetí nejbližší strukturní shodou však byl AA10 ze Streptomyces coelicolor (ScAA10, PDB ID 4oy7 ), což je AA10 specifický pro celulosu, který poskytuje RMSD 2,5 Å na 160 atomech Cα. TtAA10A a ScAA10 sdílejí pouze 26% sekvenční identitu, přestože jsou aktivní na stejném substrátu, což dále poukazuje na obtíže při vztahování substrátové specifity LPMO pouze na základě sekvence a celkové struktury (dále diskutováno v souvislosti s AA9 v Ref. ).

Stejně jako u všech dosud studovaných LPMO (definovaných podle jejich aktivity) je aktivní místo TtAA10A tvořeno motivem „histidinové rovnátko“, které se nachází ve středu téměř rovného povrchu (obr. 5a, b). V této poloze byl modelován jediný měďnatý iont koordinovaný v typické geometrii ve tvaru písmene T aminoterminálem a postranním řetězcem His 1 a imidazolem postranního řetězce His 107. V této poloze je umístěn jeden měďnatý iont. V axiálních polohách kolem měďnatého iontu aktivního místa má TtAA10A Phe 195 a Gly 105. Tyto pozice jsou u jiných AA10 často obsazeny postranním řetězcem fenylalaninu/tyrosinu, resp. alaninu. Ten se podílí na vytváření sterického prostředí, které je hnací silou pro vznik pokřivené koordinační geometrie aktivního místa pozorované u chitin-specifických AA10 v jejich oxidačním stavu Cu(II) . Zde záměna Ala za Gly umožňuje mědi v aktivním místě zaujmout mírně axiálnější koordinační geometrii, která je bližší geometrii typické pro AA9s a celulosově aktivní AA10s a je v souladu s parametry spinového Hamiltoniánu druhu 1 v naší EPR analýze popsané dříve, obr. 4. Krystalové struktury LPMO jsou často poznamenány fotoredukcí v důsledku radiačního poškození, takže klidovou geometrii aktivního místa nelze v krystalových strukturách přímo pozorovat (příklady zahrnují ). Analýza sféry obklopující měďnatý ion v TtAA10A odhaluje pouze slabou hustotu pro molekulu vody vzdálenou 2,6 Å od mědi a silnější hustotu pro druhou molekulu vody vzdálenou 3,2 Å, která se vodíkově váže na Glu 53. V tomto případě se jedná o slabou hustotu pro molekulu vody, která se váže na Glu 53. Tyto molekuly vody jsou příliš vzdálené od mědi, než aby mohly být považovány za přímo koordinující. Zdá se tedy, že měď v tomto enzymu také prošla fotoredukcí do oxidačního stavu Cu(I)

Naše struktura odhaluje polohu druhého vazebného místa mědi, které bylo pozorováno v EPR spektrech. Toto místo se nachází 14,4 Å (Cu…Cu) od měďnatého iontu histidinové závorky ve velké záporně nabité skvrně na povrchu proteinu (obr. 5a, b; Additional file 5: Figure S4). Tento druhý měďnatý ion je přímo koordinován His 165, Glu 5, Asp 101, molekulou vody a His 207*, který je zajištěn Strep-značkou ze sousední molekuly v krystalu. Vzhledem k pozorování této interakce jsme ověřili oligomerní stav proteinu v roztoku pomocí SEC-MALLS (Additional file 6: Figure S5). To potvrdilo, že protein je monomerní, což naznačuje, že interakce měď-His207* je krystalový artefakt (i když může naznačovat potenciální interakci protein-protein). Nicméně po doplnění EPR dat struktura naznačuje, že toto druhé místo je v roztoku obsazeno, přičemž His 207* je pravděpodobně nahrazen molekulou vody. Vícenásobné zarovnání sekvencí 500 nejvýznamnějších ortologů TtAA10A identifikovaných pomocí vyhledávání BlastP ukazuje, že zatímco kyselý zbytek v poloze 5 není u AA10 neobvyklý, zbytky 101 a 165 jsou do značné míry konzervovány pouze v rámci LPMO z bakterií, které jsou blízce příbuzné Teredinibacter.

O možných pozicích, v nichž se mohou na LPMO vázat donory elektronů, a to jak malomolekulární, tak bílkovinné, aby umožnily katalýzu, když je enzym vázán na povrch pevného substrátu, se vedou rozsáhlé diskuse (viz například ). Zkoumání struktury TtAA10A z hlediska potenciálních drah přenosu náboje pomocí programu EHPath skutečně ukazuje, že mezi histidinem 1 a tyrosinem 3 (vzdálenost 10 Å) existuje jasná a rychlá dráha přeskakování děr se střední dobou pobytu díry pouhých 20 ms. Tyrosin 3 sousedí (5,3 Å) s druhým místem Cu, a poskytuje tak účinnou cestu přenosu náboje mezi oběma měděnými místy . Proto jsme vzhledem k potenciální cestě přenosu náboje mezi oběma měděnými místy zkoumali, zda druhé kovové místo (v našem případě obsazené mědí, ačkoli se nám nepodařilo Cu vytěsnit solemi Fe, Ni, Zn a Mn) představuje vazebné místo pro bílkovinného redoxního partnera (vazbu jiné bílkoviny na toto místo naznačuje asociace Strep-tag se sousední molekulou v krystalické mřížce), a pokusili jsme se stáhnout bílkoviny z T. turnerae, které mohou stabilně interagovat s TtAA10A, pomocí afinitní kolony (StrepTrap HP) imobilizované TtAA10A. Tyto pokusy (údaje nejsou uvedeny) nevedly k izolaci žádných kandidátních proteinových aktivátorů pro TtAA10A, ale nelze vyloučit, že by se v této oblasti mohl přechodně vázat aktivační enzym, který by umožnil přenos elektronů na LPMO, a tím zahájení katalýzy. Je však třeba poznamenat, že během zpřesňování struktury jsme také identifikovali vazebné místo pro sodík na povrchu proteinu (Additional file 7: Figure S6). Zda jsou tato další vazebná místa důsledkem zvýšeného náboje, který může mít tento protein, aby byl stabilní ve slaném prostředí, v němž T. turnerae pobývá, zůstává otevřenou otázkou. Nicméně tyto povrchové vlastnosti TtAA10A mohou být zajímavé pro enzymové inženýry, pokud mají být LPMO stabilizovány nebo přizpůsobeny specifickým podmínkám pro nasazení v průmyslových bioreaktorech.

.