A complex structure of arrestin-2 bound to a G protein-coupled receptor

Functional characterization and structure determination of Arr2-NTSR1 complex

Interakcje arektyn z niewidzialnymi GPCR są stosunkowo słabe i wysoce dynamiczne, ale uzyskanie stabilnego kompleksu jest niezbędnym krokiem w badaniach strukturalnych. Dlatego też, przed przystąpieniem do badań strukturalnych, scharakteryzowaliśmy interakcje NTSR1 z arretynami, wykorzystując komercyjny system NanoBiT, który jest skuteczną metodą wykrywania interakcji białko-białko.17 Stwierdzono, że NTSR1 oddziałuje zarówno z Arr2, jak i Arr3, co jest wzmacniane przez zwiększone stężenia peptydowego agonisty, neurotensyny (NTS). Mutanty arestyn z trzema C-końcowymi resztami hydrofobowymi zmutowanymi na alaninę (mutanty 3 A; I386A, V387A i F388A w Arr2 oraz I387A, V388A i F389A w Arr3),18,19 które są znane jako wstępnie aktywowane formy arestyn, wykazywały zwiększoną aktywność wiązania z NTSR1 (ryc. 1b). 1b).

Dalej testowaliśmy interakcję aresztantin-NTSR1 za pomocą testu Tango, testu opartego na komórkach, który określa aktywność wiązania białek błonowych do rozpuszczalnych partnerów wiążących.7,20 Nasze testy Tango wykazały, że aktywność wiązania NTSR1 do Arr2 była zwiększona odpowiednio o około dwa do trzech razy, gdy dodano peptydowego agonistę NTS lub małego agonistę cząsteczkowego ML314, znanego pozytywnego modulatora alosterycznego (PAM),21,22. Aktywność wiązania Arr2 do NTSR1 była zwiększona około czterokrotnie, gdy zastosowano zarówno NTS, jak i ML314. Wiązanie NTSR1 z Arr2 było jeszcze bardziej wzmocnione przez wprowadzenie mutacji 3A (ryc. 1c).

W oparciu o powyższe wyniki przeprowadziliśmy badania strukturalne z użyciem mutanta 3A Arr2 w kompleksie z NTSR1 w obecności NTS i ML314, ale kompleks dysocjował w siatkach krio-EM z powodu niekorzystnych efektów związanych z witryfikacją próbki. Aby przezwyciężyć ten problem dysocjacji, połączyliśmy ludzki NTSR1 typu dzikiego z ludzkim mutantem 3A Arr2 na jego C-końcu z linkerem o długości trzech aminokwasów (GSA). Domena RIL cytochromu b562 (BRIL) została również przyłączona do N-końca receptora w celu zwiększenia ekspresji kompleksu. Arr2 został dodatkowo ustabilizowany przez fuzję łańcucha lekkiego Fab30, fragmentu przeciwciała używanego do stabilizacji aktywnej formy Arr2,23 na jego C-końcu z 12 aminokwasowym linkerem (GSAGSAGSAGSA). Konstrukt kompleksu fuzyjnego poddano koekspresji z ciężkim łańcuchem Fab30 znakowanym His8 i kinazą GPCR, GRK5, która fosforyluje receptor w celu lepszego wiązania aretenyny. Białko kompleksowe zostało oczyszczone przy użyciu kolumny powinowactwa niklowego w obecności 2 µM NTS i 10 µM ML314, a następnie zatężone i dalej oczyszczone przez chromatografię filtracji żelowej do badań strukturalnych (Fig. 1d, e, patrz sekcja „Materiały i metody” w celu uzyskania szczegółowych informacji).

Oczyszczone białko kompleksowe BRIL-NTSR1-Arr2-Fab30 wykazywało stosunkowo wysoką temperaturę topnienia (Tm) na poziomie 58 °C, określoną za pomocą testu przesunięcia termostabilności24 (Fig. 1f). W badaniu metodą negatywnego barwienia EM wykazywało jednorodny rozkład (Rys. 1g). Dane krio-EM pojedynczych cząstek zebrano za pomocą mikroskopu FEI Titan Krios. W sumie zarejestrowano 17 206 mikrografów, z których wybrano i posortowano ponad 5 milionów złożonych cząstek do dalszego przetwarzania danych. Klasyfikacja 2D pozwoliła na identyfikację wielu konformacji cząstek złożonych. Po intensywnej klasyfikacji 3D, 220 464 cząstek (~4.5% wszystkich początkowych cząstek) zostało wybranych do rekonstrukcji struktury (Supplementary information, Fig. S1). Mapa gęstości wykazała średnią rozdzielczość 4,8 Å wyznaczoną przez kryterium korelacji powłok Fouriera (FSC) wynoszące 0,143, przy czym struktura rdzeniowa złożona z Arr2 i regionu zmiennego Fab (Fv) wykazywała zakres rozdzielczości do 4,5 Å (ryc. 2a i informacje uzupełniające, ryc. S1, S2). Jednak heterogenność konformacyjna między NTSR1 i Arr2 jest nadal obecna, jak pokazano w analizie wielociałowej (Informacja dodatkowa, Fig. S3), mimo że bardzo niska frakcja pełnego zestawu danych została wykorzystana w ostatecznej rekonstrukcji.

Mapa EM, pomimo umiarkowanej rozdzielczości, pozwoliła na wyraźne określenie pozycji i orientacji NTSR1, Arr2 i Fab30 w złożeniu kompleksu (Rys. 2). Model kompleksu został zbudowany poprzez dokowanie struktury krystalicznej kompleksu NTSR1-NTS (PDB: 4GRV),14 oraz struktury Arr2 związanej z fosforylowanym C-końcowym peptydem wazopresyny (V2Rpp) i Fab30 (PDB: 4JQI)23 do mapy gęstości, a następnie ręczne dopasowanie modelu, rafinację w przestrzeni rzeczywistej oraz iteracyjne cykle rafinacji Rosetta i odbudowy modelu względem mapy EM.25 Ostateczny model kompleksu zawiera reszty NTSR1 od R49 do T416, z których brakuje ICL3 (A270 do P292) i regionu łącznika między helisą 8 a C-końcowym ogonem (P384 do S404). Model Arr2 obejmuje reszty od T6 do M352, a model Fab30 zawiera łącznie 409 reszt, które składają się zarówno na łańcuch lekki, jak i łańcuch ciężki Fab. N-końcowo połączone BRIL i mała cząsteczka ML314 nie są widoczne na mapie gęstości, a zatem nie są zawarte w modelu kompleksu. Statystyki i geometria modelu strukturalnego są podsumowane w Informacjach uzupełniających, Tabela S1.

Ogólna struktura kompleksu Arr2-NTSR1

Kompleks Arr2-NTSR1 powstaje w wyniku asymetrycznego złożenia dwóch komponentów z poziomą osią Arr2 przecinającą wewnętrzną powierzchnię błony komórkowej pod kątem około 20°, co skutkuje oddziaływaniem hydrofobowych pętli krawędzi C (L191 i M192 oraz L334 do L338) aretyny z błoną komórkową (Fig. 2a, b). Jest to zgodne ze strukturą krystaliczną wizualnego kompleksu aresztyna-rhodopsina, która po raz pierwszy wykazała asymetryczne połączenie aresztyna-GPCR i potwierdziła funkcję hydrofobowych pętli C-edge aresztyny jako kotwicy błonowej stabilizującej wiązanie aresztyny z receptorem osadzonym na błonie, co zostało później potwierdzone eksperymentalnie.7,26,27 Interakcja hydrofobowych pętli C-edge Arr2 z warstwą błony komórkowej sugeruje, że zdolność wiązania lipidów jest ogólną właściwością członków rodziny arektyn.

Pomimo podobieństwa w asymetrycznym montażu kompleksu Arr2-NTSR1 z kompleksem Arr1-rhodopsin, względna orientacja arektyn do receptora jest dramatycznie różna między tymi dwoma kompleksami arektyn-receptor. Superpozycja receptorowych TMD tych dwóch kompleksów ujawnia, że orientacja Arr2 jest obrócona o 90° wokół osi transmembranowej w stosunku do orientacji wizualnej aretenyny (ryc. 2c). W tej nowej orientacji pozycje ICL3 i zarówno TM5, jak i TM6 receptora są skierowane w kierunku N-końcowej domeny Arr2, umożliwiając ICL3 upodobnienie się do C-końcowego ogona w celu interakcji z N-domeną Arr2 (ryc. 2b).

Aby ocenić stabilność konformacyjną zespołu kompleksu, przeprowadziliśmy sześć niezależnych, trwających dwie mikrosekundy, all-atomowych symulacji dynamiki molekularnej kompleksu Arr2-NTSR1 bez stabilizującej Fab30. Przez cały czas trwania symulacji pętle krawędzi C od L334 do L338 pozostawały w asocjacji z lipidami błonowymi, a C-końcowy ogon NTSR1 pozostawał w interakcji z N-końcową domeną Arr2 (Informacja dodatkowa, Fig. S4 i S5). Jednakże struktura rdzenia arektyny może obracać się wokół struktury cryo-EM w ograniczonym zakresie, a przedłużona pętla palcowa może odłączyć się od rdzenia NTSR1 TMD (Informacja dodatkowa, Rys. S5). Te dane symulacyjne sugerują, że pętla palca, jak również interfejs rdzenia między Arr2 i receptorem jest wysoce dynamiczny, a złożenie kompleksu Arr2-NTSR1 uchwycone przez strukturę cryo-EM prawdopodobnie reprezentuje jeden z wielu stanów konformacyjnych, co jest zgodne z faktem, że heterogeniczność konformacyjna złożenia kompleksu Arr2-NTSR1 nadal istnieje w cząsteczkach klasy 3D użytych w ostatecznej rekonstrukcji cryo-EM (Informacja dodatkowa, Fig. S3).

Interfejs rdzeniowy Arr2-NTSR1

Kompleks Arr2-NTSR1 jest montowany poprzez oddziaływania międzycząsteczkowe, które składają się z dwóch oddzielonych głównych interfejsów: interfejsu rdzeniowego składającego się z dwóch oddzielonych łat między centralnymi pętlami grzebieniastymi areteny i wewnątrzkomórkową stroną TMD receptora oraz interfejsu ogonowego między N-końcową domeną Arr2 i C-końcowym ogonem receptora (ryc. 2b). Jedną z łat interfejsu rdzeniowego pomiędzy Arr2 i NTSR1 jest pętla palcowa (od E66 do L71) areteny, która jest wprowadzona do wewnątrzkomórkowej jamy TMD receptora i otoczona przez ICL1, ICL2, TM5 i 6 receptora (ryc. 3a). W tej konfiguracji, górna powierzchnia pętli palcowej tworzy bezpośredni interfejs z zakrętem pomiędzy TM7 i helisą 8 receptora (Rys. 3a).

Aby zatwierdzić interfejs struktury kompleksu, wykonaliśmy eksperymenty sieciowania disulfidowego oparte na komórkach. W tym zestawie eksperymentów, specyficzne dla danego miejsca reszty cysteinowe zostały wprowadzone do interfejsu Arr2 i NTSR1. Oba białka z mutacjami cysteinowymi były współekspresjonowane w komórkach jako oddzielne białka. Produkty sieciowania powstawały w wyniku traktowania komórek odczynnikiem utleniającym i były monitorowane za pomocą SDS-PAGE, a następnie western blotting w celu wykrycia znacznika Flag, który był przyklejony do C-końca Arr2. Ta sama metoda została zastosowana do walidacji wizualnego interfejsu kompleksu arektyn-rhodopsin.7,9 Przeprowadzono reakcje sieciowania w sumie 177 par reszt, wśród których zaobserwowaliśmy silne sygnały sieciowania między resztami Arr2 D67 i L68 w centralnym regionie pętli palca, z resztami NTSR1 V367 do N370 zlokalizowanymi na zakręcie między TM7 i helisą 8 (ryc. 3b, a pozycje tych reszt interfejsu są przedstawione jako kule na ryc. 3a). Dla porównania, reszty L71 na C-końcowym końcu pętli palca nie wykazywały żadnego lub bardzo słaby sygnał sieciowania z tymi resztami NTSR1 (Rys. 3a, b). Stwierdzono również, że kilka reszt pętli palcowej krzyżuje się z resztami w ICL1 (Q98) i TM6 (R294 i A297), które są składnikami wewnątrzkomórkowej jamy TMD receptora (Informacja dodatkowa, Rys. S6). Te dane dotyczące sieciowania potwierdziły łatę interfejsu między pętlą palca Arr2 a receptorem i wykazały, że pętla palca arektyny służy jako kluczowy składnik interfejsu rdzenia tego kompleksu Arr2-GPCR.

Sekwencje aminokwasowe pętli palca Arr2 są wzbogacone o reszty kwaśne, podobne do wizualnej arektyny (ryc. 3c), o której wiadomo, że wiąże się z dodatnio naładowaną jamą TMD.7 Kiedy NTSR1 i rodopsyna są nałożone na siebie, pętla palca Arr2 zajmuje tę samą przestrzeń, co odpowiadający jej region wizualnej areteniny, ale nie wstawia się tak głęboko do jamy TMD, jak wizualna aretenina (ryc. 3d), wskazując, że asocjacja pętli palca Arr2 z wewnątrzkomórkową jamą TMD NTSR1 może być bardziej dynamiczna niż ta między wizualną areteniną i rodopsyną.

Inną łatą interfejsu rdzenia między Arr2 i NTSR1 jest interakcja regionów grzebieniastych Arr2 z ICL1 i ICL2 receptora, która różni się od tej w kompleksie wizualna aresztantyna-rhodopsina. W przeciwieństwie do podobnej orientacji pętli palcowych obu arektyn, superpozycja dwóch receptorów pozostawiła struktury rdzeniowe arektyn w dwóch orientacjach różniących się o kąt około 90°, jak pokazano na Rys. 2c. Odmienne orientacje struktur rdzeniowych Arr2 i wizualnej arestyny w ich kompleksach z GPCR skutkują różnymi sposobami wiązania regionów grzebieniastych arestyny z wewnątrzkomórkowymi pętlami receptorów, szczególnie ICL1 i ICL2, w tych dwóch kompleksach arestyna-GPCR (ryc. 2c i 4).

Porównanie strukturalne NTSR1 i rodopsyny ujawnia, że dzielą one konserwowaną konformację TMD z ich ICL1 przyjmującą przedłużoną pętlę i ICL2 tworzącą krótką helisę w ich odpowiednich kompleksach związanych z aresztantami. Spirala ICL2 rodopsyny jest umieszczona w szczelinie utworzonej przez pętlę środkową, pętlę dolną i pętlę lariatową areteny wizualnej (określanej jako szczelina MBL).7 Jednakże ta sama szczelina MBL w Arr2 jest zajęta przez ICL1 NTSR1 (Rys. 4a) z powodu innej orientacji areteny. Odpowiednio, ICL2 NTSR1 jest obracany z dala od szczeliny MBL, aby ponownie umieścić się na szczycie pętli lariatowej (ryc. 4a). Eksperymenty sieciowania disiarczkowego wykazały sygnały sieciowania między resztami receptorowymi L94 do S96 na ICL1 NTSR1 i resztami G286 w dolnej pętli Arr2, co jest zgodne z interfejsem ICL1 NTSR1 z tym regionem grzebienia Arr2 (ryc. 4b).

ICL3 receptora, pomimo że jest niewidoczny na mapie gęstości, prawdopodobnie tworzy interfejs z N-domeną β-arrestiny w oparciu o konformację kompleksu Arr2-NTSR1 (ryc. 2b). Dane dotyczące sieciowania disiarczkowego wykazały, że reszty ICL3 Q275, C277, T278 i V279 NTSR1 sieciowały z resztami T56, T58, V81 i N83 na górnej powierzchni N-domeny Arr2 (ryc. 4c i informacja dodatkowa, ryc. S6). Te reszty ICL3 wykazywały również silne sygnały sieciowania z resztami Arr2 K160 (Rys. 4d). Dodatkowe sygnały sieciowania disiarczkowego zaobserwowano pomiędzy większością reszt od Q273 do G280 ICL3 NTSR1 a resztą P14 z Arr2 (Rys. 4d). Te dane sieciowania wskazują, że ICL3 receptora jest umieszczony blisko N-domeny i może oddziaływać z resztami na powierzchni N-domeny Arr2 (Fig. 4e).

Interfejs ogona Arr2-NTSR1

Podczas gdy interfejs rdzenia Arr2-NTSR1 jest wysoce dynamiczny, interfejs ogona między C-końcowym ogonem NTSR1 i N-domeną Arr2 wydaje się podobny do tego w kompleksie wizualnej areteny-rhodopsin9 (Fig. 5). Zaobserwowaliśmy gęstość elektronową na poziomie konturu 0,016 (przy którym można prawidłowo pokazać gęstość całej struktury kompleksu) około dziesięciu reszt C-końcowego ogona NTSR1, które wiążą się z pierwszą nicią β kompleksu Arr2 (Rys. 5a). Jednak szczegółowe informacje o tym regionie C-końcowego ogona, w tym o jego specyficznych resztach, są trudne do zidentyfikowania ze względu na ograniczoną rozdzielczość mapy gęstości. Analiza białka fuzyjnego NTSR1-Arr2-Fab30 metodą spektrometrii mas (ryc. 5b i informacja dodatkowa, ryc. S7) ujawniła, że siedem reszt serynowych lub treoninowych od S401 do T416 na C-końcowym ogonie NTSR1 uległo fosforylacji, co sugeruje możliwy udział tego regionu w wiązaniu się z dodatnio naładowaną powierzchnią N-domeny arestyny. Eksperymenty sieciowania disiarczkowego wykazały, że reszty Arr2 P14 na C-końcowym skręcie pierwszej nici β silnie sieciowały z resztami receptora od H406 do S410 (ryc. 5d i informacje uzupełniające, ryc. S6), co wskazywało, że reszty receptora C-końcowe do H406 są prawdopodobnie regionem, który wiąże się z domeną N-adrenergiczną arestyny (ryc. 5c). 5c).

A model for Arr3-GPCR interaction

Ludzki genom zawiera dwa podtypy β-arrestiny: Arr2 i Arr3, które dzielą ponad 53% identyczności sekwencji, ale mają zarówno pewne pokrywające się, jak i pewne rozbieżne funkcje. Ponieważ Arr3 wykazywała powinowactwo do NTSR1 podobne do Arr2 (ryc. 1b), chcieliśmy sprawdzić, czy sposób wiązania Arr3 do NTSR1 jest zachowany w stosunku do Arr2. Nasze eksperymenty sieciowania disiarczkowego wykazały, że reszty pętli palca Arr3 od E67 do L72 (odpowiadające od E66 do L71 Arr2) sieciowały z odpowiadającym im zestawem reszt (A369 i N370) na przełomie między TM7 i helisą 8 NTSR1 (Informacja dodatkowa, Fig. S8), wskazując na konserwowany interfejs pętli palca z TM7 i H8 receptora między tymi dwiema β-arrestynami.

W dodatku, dane dotyczące sieciowania disulfidowego wykazały, że reszty P15 Arr3 (odpowiadające P14 Arr2) sieciowały z resztami N405 do T407 C-końcowego ogona receptora, sugerując podobny interfejs ogona między Arr3 i NTSR1 (informacje uzupełniające, Fig. S8). Zaobserwowano również podobny wzór sieciowania pomiędzy resztami NTSR1 ICL3 i resztami N-domeny Arr3, w tym P15 na C-końcu pierwszego prążka β i K161 (odpowiadający K160 Arr2) na pętli pomiędzy górnymi prążkami β (Informacja dodatkowa, Rys. S8). Razem, te dane dotyczące sieciowania sugerują, że ogólne złożenie Arr3 z NTSR1 jest podobne do tego z Arr2 do NTSR1 w tej konfiguracji zaangażowanego rdzenia.

Model rekrutacji β-arrestin przez 5-HTR1A i 5-HTR1B

Wielu GPCR, w tym receptory serotoninowe 5-HTR1A i 5-HTR1B, jak również kilka receptorów dopaminowych, albo nie ma, albo zawiera bardzo krótki C-końcowy ogon i proponuje się, aby używały one ich ICL3 jako alternatywnego interfejsu do rekrutacji β-arrestin.28 Receptory 5-HTR1A i 1B mają długie ICL3 z wieloma miejscami fosforylacji, które mogą potencjalnie oddziaływać z dodatnio naładowanymi N-domenami β-arrestin. Nasze biochemiczne testy wiązania wykazały, że oba receptory wiązały się z Arr2 i 3 z podobną aktywnością jak NTSR1 z Arr2 (Informacja dodatkowa, Fig. S9). Jednakże, gdy jako szablon wykorzystano wizualną strukturę kompleksu arestyn-rhodopsin, trudno było modelować sposób wiązania fosforylowanej ICL3 5-HTR1A lub 1B do dodatnio naładowanej szczeliny w N-domenie β-arrestyn. Dzieje się tak dlatego, że TM5 i 6 oraz ICL3 rodopsyny są umieszczone w miejscu przeciwnym do dodatnio naładowanej powierzchni N-domeny areteny w strukturze kompleksu aretenyny-rhodopsyny.

Struktura kompleksu Arr2-NTSR1 wykazuje jednak odrębne złożenie kompleksu z Arr2 obróconym o 90° w stosunku do pozycji areteny wizualnej w kompleksie aretenyny-rhodopsyny (ryc. 2c). TM5 i TM6 NTSR1 znajdują się zatem nad przednią powierzchnią N-domeny Arr2, umożliwiając ICL3 receptora (niewidoczny w strukturze) dotarcie do dodatnio naładowanej N-domeny Arr2 (Rys. 4e). Nasze dane dotyczące sieciowania disulfidowego dostarczają dowodów, że NTSR1 ICL3 może oddziaływać z dodatnio naładowaną rozpadliną N-domeny Arr2 i 3 (ryc. 4c-e, informacje uzupełniające, ryc. S6 i S8). Dlatego struktura kompleksu Arr2-NTSR1 może służyć jako odpowiedni szablon do modelowania interfejsu β-arrestin z 5-HTR1A i 5-HTR1B.

Używając struktury Arr2-NTSR1 jako szablonu oraz struktury krystalicznej związanego z ergotaminą 5-HTR1B jako wstępnego modelu dla 5-HTR1B (PDB: 4IAR),29 wygenerowaliśmy model homologiczny kompleksu Arr2-5-HTR1B, w którym interfejs rdzeniowy pomiędzy Arr2 i 5-HTR1B jest podobny do tego z kompleksu Arr2-NTSR1 (Rys. 6a, b). Następnie przeprowadziliśmy eksperymenty sieciowania disulfidowego, aby przetestować złożenie kompleksu Arr2-5-HTR1B pokazane w modelu homologicznym (Fig. 6c i Informacje uzupełniające, Fig. S10).

Zaobserwowaliśmy sygnały sieciowania między resztami pętli palca D67 L68, V70 i L71 Arr2 i resztami N373, E374 i D375 na przełomie między TM7 i helisą 8 5-HTR1B (ryc. 6c). Rezydy D67, L68, V70 i L71 pętli palcowej sieciowały z resztami receptora R308 i K311 na wewnętrznej powierzchni TM6 (Informacja dodatkowa, ryc. S10). Te dane dotyczące sieciowania wspierają konserwowany sposób wiązania pętli palcowej Arr2 z wewnątrzkomórkową jamą domeny TM 5-HTR1B (ryc. 6a, b). Dane dotyczące sieciowania disiarczkowego wykazały również sygnały sieciowania pomiędzy resztami Arr2 R285 i G286 w dolnej pętli arestyny z resztą ICL1 K79 domeny 5-HTR1B (ryc. 6c i informacja dodatkowa, ryc. S10). To specyficzne usieciowanie jest zgodne tylko z orientacją arestyny w modelu Arr2-NTSR1, ale nie jest zgodne z wizualnym kompleksem arestyna-rhodopsina. Razem te dane dotyczące sieciowania wspierały rdzeniowy interfejs między regionem grzebienia Arr2 i wewnątrzkomórkową stroną domeny TM 5-HTR1B, która jest konserwowana z tą w kompleksie Arr2-NTSR1 (ryc. 6a-c).

5-HTR1B zawiera wiele reszt seryny i treoniny w centralnym obszarze jego długiego ICL3, które mogą być fosforylowane w celu wiązania się z powierzchnią dodatnio naładowanej domeny N areteny (ryc. 6d). Zaprojektowaliśmy mutacje par cysteinowych w potencjalnym interfejsie między ICL3 receptora a N-domeną Arr2 i stwierdziliśmy, że reszty ICL3 T268, S295, L298 i E300 były usieciowane z resztami na powierzchni górnego β-szkieletu, w tym T56, V81, N83, K147 i K157 Arr2 (ryc. 6e i informacje uzupełniające, ryc. S10). Rezydy S260 i T268 w ICL3 wykazywały sygnały sieciowania z resztami K11 na pierwszej nici β i N15 na skręcie następującym po pierwszej nici β Arr2 (Rys. 6e i Informacja dodatkowa, Rys. S10). Rezydencja S260 znajduje się w pobliżu C-końcowego końca TM5, a jej usieciowanie z K11 po dodatnio naładowanej stronie N-domeny Arr2 jest możliwe tylko w orientacji Arr2-NTSR1, ale nie w orientacji wizualna aresztyna-rhodopsina, ponieważ w strukturze kompleksu wizualna aresztyna-rhodopsina zarówno TM5, jak i 6 receptora są umieszczone w miejscu tylnej strony dodatnio naładowanej powierzchni N-domeny aresztyny.

Zaobserwowaliśmy również prawie identyczny wzór sieciowania Arr2 między 5HTR1A i 5-HTR1B. Sygnały sieciowania zaobserwowano między resztami pętli palca D67, L68, V70 i L71 Arr2 i resztami N404, K405 i D406 (odpowiadającymi N373, E374 i D375 5-HTR1B) na zakręcie między TM7 i helisą 8 5-HTR1A (Informacja dodatkowa, Fig. S11). Rezydy D67 i L68 pętli palcowej były również usieciowane z resztami receptorowymi R339 i K342 (odpowiadającymi R308 i K311 5-HTR1B) na wewnętrznej powierzchni TM6 (informacja dodatkowa, ryc. S11). Ponadto zaobserwowaliśmy krzyżowe wiązania disiarczkowe pomiędzy resztami R285 i G286 dolnej pętli Arr2 a resztą L67 ICL1 5-HTR1A (odpowiadającą K79 5-HTR1B) (Informacja dodatkowa, ryc. S11). Te dane dotyczące sieciowania wspierają podobny interfejs rdzenia między Arr2 z 5-HTR1A i 5-HTR1B, który jest konserwowany z tym w kompleksie Arr2-NTSR1 (ryc. 6a, c).

ICL3 z 5-HTR1A zawiera ponad 100 reszt aminokwasowych (233 do 336) z 12 resztami seryny lub treoniny, które tworzą sześć częściowych kodów fosforylacji wraz z resztami kwasu glutaminowego lub asparaginowego (Informacje uzupełniające, Fig. S12). Zaprojektowaliśmy mutacje pary cysteinowej, aby zmapować potencjalny interfejs między ICL3 tego receptora a N-domeną Arr2. Dane dotyczące sieciowania wykazały, że reszty ICL3 V230, T240, P250, R261, K270 i D285 krzyżują się z V81 i K160 w N-domenie Arr2 (Informacja dodatkowa, ryc. S11). Rezydencja P14 z pierwszej nici β Arr2 silnie usieciowała się z resztami ICL3 N300, P308, P315, P318, P321 i R323 5-HTR1A (Informacja dodatkowa, ryc. S11).Te dane dotyczące sieciowania, wraz z modelem homologicznym kompleksu Arr2-5-HTR1B, dostarczyły ogólnego obrazu tego, jak 5-HTR1A i 5-HTR1B rekrutują Arr2.

W niniejszej pracy zgłaszamy strukturę Arr2 w kompleksie z NTSR1, GPCR klasy A, za pomocą analizy krio-EM pojedynczej cząsteczki. Podczas gdy sposób wiązania interfejsu ogonowego pomiędzy C-końcowym ogonem receptora i dodatnio naładowaną domeną N arektyny jest zachowany z tym w kompleksie wizualna arektyna-rhodopsina, struktura ta wykazuje inną orientację Arr2 niż ta widoczna w kompleksie wizualna arektyna-rhodopsina. Modelowanie homologiczne i mapowanie interfejsu metodą sieciowania disulfidowego wykazują, że ten rdzeniowy interfejs jest konserwowany w kompleksach Arr2 z podrodzinami 5-HTR1A i 1B. W tych modelach kompleksów, orientacja Arr2 pozwala ICL3 receptora dotrzeć do powierzchni N-domeny Arr2, co daje możliwość GPCR, któremu brakuje C-końcowego ogona do wykorzystania ICL3 do interakcji z N-domeną arektyny. Ponieważ Arr2 i Arr3 są wszechobecnie wyrażanymi partnerami białkowymi dla transdukcji sygnału wielu niewizualnych GPCRs, nasze strukturalne i biochemiczne badania interakcji Arr2 z członkami podrodziny NTSR1 i 5-HTR1 dostarczyły alternatywnego modelu dla zrozumienia interakcji Arr2 i Arr3 z niewizualnymi GPCRs.

.